Recenzja 2

Dr hab. n. med. Michał Pikuła
Gdański Uniwersytet Medyczny
Wydział Lekarski, Katedra Immunologii
Zakład Immunologii Klinicznej i Transplantologii
ul. Dębinki 7, 80-211 Gdańsk, bud. nr 27
tel. 58 349 1592, fax. 58 349 1591
E-mail: [email protected]
Gdańsk, 02.01.2017
Recenzja pracy doktorskiej Pani mgr inż. Agnieszki Łupickiej-Słowik pt.
„Otrzymywanie przeciwciał IgY specyficznych wobec ludzkich markerów
nowotworowych”, napisanej pod kierunkiem Pana prof. dra hab. inż. Józefa
Oleksyszyna. Recenzja opracowana na zlecenie Rady Wydziału Chemicznego
Politechniki Wrocławskiej.
Z dużym zainteresowaniem zapoznałem się z pracą doktorską Pani mgr inż. Agnieszki
Łupickiej-Słowik pt. „Otrzymywanie przeciwciał IgY specyficznych wobec ludzkich
markerów nowotworowych”. Praca została zrealizowana w Zakładzie Chemii Medycznej i
Mikrobiologii Politechniki Wrocławskiej pod kierunkiem Prof. dra hab. inż. Józefa
Oleksyszyna. Praca dotyczy niezwykle istotnej i aktualnej kwestii metod wytwarzania
antygenowo specyficznych przeciwciał. Przeciwciała stanowią bardzo ważną klasę związków
biologicznie czynnych, które w organizmie człowieka, jak również zwierząt pełnią krytyczną
rolę m.in. w tworzeniu odporności humoralnej. Przeciwciała od wielu lat wykorzystuje się
również w medycynie i naukach pokrewnych na potrzeby diagnostyki oraz terapii szeregu
chorób, głównie nowotworowych i zapalnych. W tym celu wykorzystywane są głównie
przeciwciała wytwarzane przez komórki ssaków. Przeciwciała te, mimo wielu ugruntowanych
zastosowań posiadają pewne wady i ograniczania. Alternatywą do konwencjonalnych
przeciwciał mogą być przeciwciała kurze IgY. Przeciwciała te mogą być stosunkowo łatwo
izolowane z jaj kurzych, bez konieczności pobierania dużych ilości krwi od zwierząt i
wywoływania dodatkowego stresu. Również technika uzyskiwania tego rodzaju przeciwciał
jest tańsza od rutynowej procedury produkcji przeciwciał poliklonalnych, jak i
monoklonalnych ssaków. Biorąc również pod uwagę właściwości biologiczne przeciwciał
IgY, należy zauważyć ich ogromny potencjał praktyczny i duże możliwości zastosowania nie
tylko diagnostycznego, ale również terapeutycznego. Przeciwciała IgY nie reagują krzyżowo
z czynnikami reumatoidalnymi ani ludzkimi przeciwciałami anty-mysimi, które mogą
występować w ludzkim osoczu. Szczególnie przeciwciała anty-mysie (HAMA) stanowią
problem dzisiejszej analityki medycznej. Mogą one bowiem silnie interferować z
przeciwciałami diagnostycznymi wpływając znacząco na otrzymywane wyniki laboratoryjne.
Przeciwciała IgY nie są również zdolne do aktywacji ludzkiego układu dopełniacza. Cieszy
zatem podjęty przez Doktorantkę temat wytwarzania i badań biochemicznych przeciwciał
IgY.
Recenzowaną pracę Pani mgr Agnieszki Łupickiej-Słowik stanowi przygotowane w
języku polskim opracowanie liczące 171 stron. Praca podzielona jest na następujące części:
wstęp (1), immunoglobuliny Y (2), markery nowotworowe (3), cele pracy (4), część
eksperymentalna (5), podsumowanie i wnioski (6), materiały i metody (7), spis tabel (8), spis
rysunków (9), wykaz skrótów (10), spis literatury (11). Na końcu pracy znajdują się również
imponujący wykaz dorobku naukowego Doktorantki z wyszczególnieniem publikacji
naukowych, patentów oraz doniesień konferencyjnych.
W pierwszych trzech rozdziałach Autorka opisała metody diagnostyki nowotworów
oraz możliwości zastosowania przeciwciał w testach diagnostycznych chorób u ludzi. Autorka
dokładnie opisała budowę i syntezę endogennych przeciwciał IgY u ptaków, otrzymywanie
ich poprzez immunizację oraz właściwości biologiczne przeciwciał IgY. Doktorantka
przedstawiła również możliwości zastosowania przeciwciał IgY w diagnostyce laboratoryjnej.
W kolejnej części pracy zostały opisane wybrane do doświadczeń markery nowotworowe:
antygen specyficzny dla prostaty (PSA), białko CA15-3 oraz deaminaza adenozyny. Ta część
pracy nie budzi zastrzeżeń Recenzenta. Opisanie markerów nowotworowych pozwala na
pełne zapoznanie się z budową, syntezą i możliwościami ich zastosowania klinicznego. Warte
podkreślenia są również bardzo dobrej jakości schematy budowy przeciwciał i markerów
nowotworowych.
W rozdziale czwartym przedstawiono cele pracy, które zostały zdefiniowane jako
otrzymanie poliklonalnych przeciwciał IgY
specyficznych wobec ludzkich białek
markerowych o potencjalnym zastosowaniu w diagnostyce onkologicznej. Autorka pracy
postawiła za kolejny cel analizę biochemiczną otrzymanych przeciwciał. Cele pracy zostały
postawione prawidłowo. Warto byłoby jednak w tym miejscu lub w osobnym rozdziale opisać
bliżej założenia pracy oraz przesłanki, które zdecydowały o wykonaniu konkretnych typów
doświadczeń.
Rozdział piąty, nazwany przez Doktorantkę „częścią eksperymentalną” zawiera
głównie wyniki badań i stanowi zrąb pracy. Rozdział ten podzielony jest na dwa
podrozdziały: metodykę oraz badania własne. Podział ten, nie jest dla mnie w pełni
2
zrozumiały i wymaga wyjaśnienia przez Doktorantkę. Moim zdaniem, dla przejrzystości
pracy, metodyka powinna zostać umieszczona w rozdziale materiały i metody. Metodyka
opisywana w tym rozdziale została opisana jednak dokładnie i starannie. Doktorantka
przedstawiła syntezę peptydów, immunizację zwierząt, izolację i charakterystykę przeciwciał
IgY, testy immunoenzymatyczne oraz analizę SRP (powierzchniowy rezonans plazmowy).
Bardzo wartościowe są w tej części pracy precyzyjne schematy, które pozwalają prześledzić
daną technikę doświadczalną, np. schemat immobilizacji białek do powierzchni sensora. W
tej części pracy warto byłoby dodać jaka była czystość otrzymywanych peptydów,
przeznaczonych do immunizacji zwierząt. Jest to istotny element z uwagi na to, iż ewentualne
dodatkowe związki, nawet w niewielkich ilościach, mogą wpływać na reakcję układu
immunologicznego zwierząt. Dodatkowo, szerszego opisu wymagają kryteria wyboru
konkretnych (immunogennych) epitopów białek markerowych do dalszej syntezy chemicznej
(strona 48).
Doktorantka w drugim podrozdziale „badania własne” przedstawiła metodę
otrzymywania przeciwciał poliklonalnych IgY specyficznych wobec białka PSA, CA15-3
oraz bydlęcej deaminazy adenozyny (cADA). Przedstawione zostały również właściwości
biochemiczne otrzymanych przeciwciał IgY. Podrozdział ten stanowi bardzo wartościową
cześć rozprawy doktorskiej i świadczy o dużym nakładzie pracy Doktorantki oraz dowodzi
staranności wykonywanych doświadczeń. Wyniki przedstawione są zrozumiale i są wsparte
czytelnymi wykresami. Doktorantka wykazała, iż zaprezentowane techniki badawcze
pozwalają na efektywne otrzymywanie poliklonalnych przeciwciał IgY specyficznych wobec
właściwych (PSA, CA15-3) lub potencjalnych (cADA) markerów nowotworowych.
Wykonane analizy biochemiczne uzyskanych przez Doktorantkę przeciwciał wykazały ich
wysoką awidność oraz specyficzność wobec badanych antygenów. Warty podkreślenia jest
również fakt, iż otrzymane przeciwciała zastosowano do konstrukcji immunoenzymatycznych
oraz immunochromatograficznych prototypów testów diagnostycznych. Istotne jest, iż
opracowany test ELISA oparty na przeciwciałach IgG/IgY zoptymalizowano do oznaczania
antygenu specyficznego dla prostaty w próbkach surowicy pacjentów. Bardzo wartościowy
jest również test na wykrywanie ludzkiej deaminazy adenozyny (ADA). Większość aktualnie
wykorzystywanych testów oznaczających ADA opiera się bowiem na jej aktywności
enzymatycznej.
zaawansowanymi
Doktorantka
technikami
w
części
eksperymentalnej
badawczymi.
Szczególnie
pracy
warte
posługiwała
podkreślenia
się
jest
wykorzystanie w pracy rezonansu plazmonów powierzchniowych, który pozwolił na analizę
oddziaływań antygen-przeciwciało. Doświadczenia te zostały wykonane podczas stażu
3
Doktorantki w Laboratorium Peptydów oraz Chemii i Biologii Białek Uniwersytetu we
Florencji.
Mimo imponujących wyników i dużej staranności w przygotowaniu omawianego
podrozdziału, mam w tym miejscu kilka uwag. Moje wątpliwości budzi kwestia liczby
powtórzeń przedstawianych doświadczeń. W zdecydowanej większości prezentują one
średnią tylko z dwóch powtórzeń, np. wykresy na rysunkach 17-22. Ponadto, Doktorantka nie
wyjaśniła czy dotyczą one powtórzeń biologicznych (niezależne doświadczenia immunizacji
zwierząt), czy też były to tzw. powtórzenia techniczne. Brakuje również informacji na temat
liczby zwierząt wykorzystanych do doświadczeń. Dodatkowo, przy omawianiu wyników
oczyszczania przeciwciał IgY anty CA15-3 Doktorantka nie wyjaśniła czym były kontrole K3
oraz K4 (rysunek 47). W przypadku rysunku nr 50 (detekcja białka MUC1 na komórkach
MCF-7) warto byłoby dodać również zdjęcie komórek w świetle widzialnym, co
uwidoczniłyby ilość komórek wykazujących ekspresję MUC1. Natomiast do uwidocznienia
topografii ekspresji MUC1 w komórkach MCF-7 należałoby wykonać również barwienia
jąder komórkowych, np. barwnikiem DAPI. Chciałbym podkreślić, iż mimo tych uwag,
całość rozdziału „część eksperymentalna” reprezentuje bardzo wysoki poziom naukowy i
stanowi niezwykle wartościową podstawę do wyciągania wniosków.
W następnym rozdziale „podsumowanie i wnioski” znajduje się wyszczególnienie i
opisanie najważniejszych wyników pracy. Opis ten nie budzi większych zastrzeżeń
Recenzenta i świadczy o wysokich umiejętnościach syntezy otrzymywanych wyników. W
omawianym rozdziale brakuje moim zdaniem szerszej dyskusji wyników, np. przyczyn różnej
reaktywności przeciwciał IgY w zależności od stosowanego peptydu, jak również odniesienia
się do częstości wyników fałszywie dodatnich otrzymywanych w przypadku zastosowania
ssaczych przeciwciał oraz możliwości wystąpienia takiego zjawiska w przypadku IgY. Warto
byłoby również omówić krótko interpretację wyników z zastosowaną linią komórkową MCF7. Do jakiego stopnia można odnieść ją do komórek nowotworowych izolowanych rutynowo
od pacjentek? W mojej opinii warto byłoby przedstawić także bardziej ogólne wnioski
płynące z prac eksperymentalnych i podsumowania wyników. Szczególnie ciekawą kwestią
są potencjalne możliwości zastosowania terapeutycznego przeciwciał IgY.
Rozdział siódmy „materiały i metody” zawiera dokładne opisy przygotowania
antygenów peptydowych do immunizacji zwierząt, procedurę immunizacji, izolacji oraz
badania właściwości biochemicznych otrzymywanych przeciwciał. Warte podkreślenia są
dokładne opisy testów ELISA z wykorzystaniem uzyskanych przeciwciał IgY. W
podrozdziale 7.2 należałoby wskazać pełną liczbę zwierząt, które posłużyły do immunizacji
4
oraz realizacji pracy doktorskiej. Prosiłbym również o wyjaśnienie do jakich doświadczeń
stosowano 2 zwierzęta w grupie a dla jakich 4 zwierzęta w grupie (strona 129).
Spis tabel, rysunków oraz wykaz skrótów przygotowane są w sposób staranny i nie
budzą zastrzeżeń Recenzenta. W pracy przedstawiono łącznie 11 tabel oraz 65 rysunków,
które wyróżniały się bardzo dobrą jakością.
Dobór piśmiennictwa liczącego 212 pozycji bibliograficznych przygotowany był
staranie i nie budzi zastrzeżeń. Cytowana literatura znajduje się również na końcu
odpowiednich stron pracy doktorskiej, co w znaczny sposób ułatwia zaznajomienie się z
informacją na temat publikacji. Wykorzystanie bogatej i szerokiej literatury pokazuje, iż
Autorka rozprawy swobodnie porusza się w zakresie prowadzonych badań naukowych.
Należy jednak zaznaczyć, iż znaczna część cytowanych prac została opublikowana ponad 10
lat temu.
Doktorantka przedstawiła na końcu pracy również swój dorobek naukowy, w skład
którego wchodzi: 7 publikacji naukowych (większość o zasięgu międzynarodowym), 16
patentów, 2 zgłoszenia patentowe oraz 5 doniesień konferencyjnych. Co ważne, większość
prac oraz patentów związana jest tematyką recenzowanej pracy doktorskiej. Warty
podkreślenia jest również fakt, iż w dwóch publikacjach Doktorantka jest pierwszym
Autorem. Wyszczególnione prace zostały opublikowane w latach 2011-2015. Doktorantka
brała również udział w realizacji kilku projektów naukowych, w tym w jednym z nich, jako
kierownik projektu (realizacja w latach 2015-2017, konkurs NCN Preludium 7). Wszystko to
świadczy o dużej aktywności naukowej Doktorantki oraz ukierunkowaniu na praktyczne
zastosowanie wyników prac.
Cała praca napisana jest bardzo starannie i reprezentuje wysoki poziom edytorski.
Mimo to, Doktorantka w kilku miejscach pracy popełniła niewielkie błędy lub zastosowała
niefortunne zwroty pisząc np. „gikozylotransferaz” (strona 34) lub „ocena zjadliwości”
nowotworu (strona 37) zamiast „ocena złośliwości”. Chciałbym również zwrócić uwagę, na
pojawiąjącą się w wielu miejscach pracy nazwę „cielęca deaminaza”. Zgodnie z
nazewnictwem biologicznym bardziej właściwym jest stosowanie nazwy bydlęca deaminaza.
Również szeroko przyjętą nazwą dla tego enzymu jest „deaminaza adenozyny” zamiast
stosowanej w pracy „deaminazy adenozynowej”. Omyłki te nie wpływają jednak na ogólny
obraz pracy i przy tak wysokim poziomie rozprawy doktorskiej nie mają dużego znaczenia.
Podsumowując, chciałbym podkreślić wysoki poziom naukowy recenzowanej
rozprawy doktorskiej, a szczególnie poruszenie ciekawego problemu naukowego, precyzyjnie
wykonane i opisane doświadczenia oraz wysoce aplikacyjny charakter pracy. Jednocześnie
5
chciałbym podkreślić, iż Autorka włożyła ogromny wkład pracy laboratoryjnej by uzyskać
zaprezentowane wyniki. Co ważne, większość z tych wyników spotkało się z dużym
zainteresowaniem i dobrym przyjęciem przez świat naukowy, czego dowodem są publikacje o
zasięgu międzynarodowym. Żywię nadzieję, że badania Doktorantki oraz Zespołu Zakładu
spotkają się z jeszcze większym zainteresowaniem środowiska naukowego oraz przemysłu
biotechnologicznego oraz farmaceutycznego. Z pewnością zagadnienie możliwości
wykorzystywania przeciwciał IgY w medycynie i naukach pokrewnych jest jeszcze słabo
poznane i powinno być szerzej propagowane.
Podsumowując stwierdzam, iż przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska
Pani mgr inż. Agnieszki Łupickiej-Słowik pt. „Otrzymywanie przeciwciał IgY specyficznych
wobec ludzkich markerów nowotworowych” odpowiada warunkom określonym w art. 13
ustawy z dnia 14 marca 2003 roku, jak również spełnia zwyczajowe wymagania stawiane
pracom doktorskim. W związku z tym, wnioskuję do Wysokiej Rady Wydziału Chemicznego
Politechniki Wrocławskiej o dopuszczenie Pani mgr Agnieszki Łupickiej-Słowik do dalszych
etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie z uwagi na wysoki poziom naukowy pracy,
wysoki dorobek naukowy Autorki oraz duże możliwości praktycznego zastosowania
wyników pracy wnoszę do Wysokiej Rady Wydziału Chemicznego o wyróżnienie pracy
doktorskiej Pani mgr Agnieszki Łupickiej-Słowik.
Dr hab. n. med. Michał Pikuła
6