Nr wniosku: 174826, nr raportu: 13199. Kierownik (z rap.): prof. dr

Nr wniosku: 174826, nr raportu: 13199. Kierownik (z rap.): prof. dr hab. Felicyta Walczak
Popularyzatorski opis rezultatów projektu
W warunkach naturalnych na rośliny działa wiele czynników stresowych. Zadaniem rośliny jest odpowiednie
skoordynowanie odpowiedzi na nie. Oprócz przystosowań morfologicznych, strukturalnych, fizjologicznych, rośliny mają
zdolność syntezy białek związanych z patogenezą (ang. pathogenesis related, PRs). Dzięki nim rośliny bronią się przed
atakiem patogenów i szkodników, w tym owadów. Na uwagę zasługuje grupa białek PR-6, do której należą inhibitory
proteaz. Roślinne inhibitory proteaz wiążą się z enzymami proteolitycznymi w jelicie owada, blokując tym samym ich
aktywność, niezbędną do prawidłowego funkcjonowania i przyswajania pokarmu. W ten sposób, owad pozyskuje
mniejszą ilości istotnych dla życia aminokwasów, co ma wpływ na jego fizjologię i może prowadzić do jego śmierci z
głodu. Uważa się, że owady nie są bierne na roślinne inhibitory i posiadają zdolność kompensacji inhibicji enzymów
trawiennych. W ramach realizowanego projektu przedmiotem badań była charakterystyka oddziaływania roślina-owad, na
przykładzie układu pszenica – skrzypionki, w tym identyfikacja owadzich proteaz oraz roślinnych inhibitorów proteaz. W
projekcie założono, że u roślin pszenicy uszkodzonych w wyniku żerowania skrzypionek, dochodzi do wyższej ekspresji
genów kodujących inhibitory proteaz oraz, że roślinne inhibitory proteaz blokują działanie enzymów proteolitycznych
skrzypionek. Celem projektu było zatem: a) wyjaśnienie mechanizmu obronnego pszenicy w odpowiedzi na żerowanie
Oulema spp., ze zwróceniem szczególnej uwagi na rolę roślinnych inhibitorów proteaz, b) wyjaśnienie roli roślinnych
inhibitorów proteaz, c) zidentyfikowanie enzymów proteolitycznych skrzypionek, oraz d) wskazanie odmiany pszenicy o
najsilniejszej ekspresji genów kodujących inhibitory proteaz.
Przeprowadzone badania (elektroforeza w warunkach in gel protease assay, analizy spektrofotometryczne) z użyciem
selektywnych inhibitorów proteaz, pozwoliły zidentyfikować rodzaje enzymów proteolitycznych działających w jelicie
skrzypionki. Wykazano tam aktywność proteaz należących do czterech klas, tj. proteaz cysteinowych, serynowych
(trypsyna, chymotrypsyna), aspartylowych (katepsyna D) oraz metaloproteaz. Określono optymalną temperaturę (45°C) i
pH (3.0-4.0) działania oraz wpływ jonów metali na ich aktywność. Zauważono, że jony Zn2+ oraz Fe2+ najefektywniej
hamowały aktywność proteaz owada. Doświadczenia w warunkach in vivo (larwy żerowały na liściach pokrytych
inhibitorami) wykazały, że larwy traktowane inhibitorem proteaz serynowych (AEBSF) syntetyzują dwie dodatkowe
frakcje białkowe o aktywnościach proteolitycznych. Pokazuje to zdolność owada do kompensacji inhibicji enzymów
trawiennych poprzez syntezę nowych izoform proteaz. Odnotowano także wzrost aktywności proteolitycznej enzymów
syntetyzowanych konstytutywnie u larw traktowanych inhibitorami.
W związku ze zidentyfikowaniem silnej aktywności proteaz cysteinowych i serynowych u skrzypionek,
sprawdzono poziom ekspresji genów dla inhibitorów tych proteaz kodowanych przez genom roślinny (pszenica). Analizy
elektroforetyczne i spektrometria mas potwierdziły obecność ww. inhibitorów i ich nagromadzenie zależne od czasu.
Wykazano również znaczną akumulację innych białek należących do grupy w odpowiedzi na żerowanie owada, w tym
należących do PR1. Spośród badanych odmian pszenicy (Arabella – pszenica jara, Arkadia, Banderola-pszenica ozima),
odmiana Arabella wykazała najwyższy poziom ekspresji genów kodujących inhibitory proteaz w odpowiedzi na
uszkodzenie poprzez żerowanie skrzypionek. Obraz ekspresji dwóch pozostałych odmian był zbliżony. Dodatkowo,
wykazano powiązanie pomiędzy powierzchnią morfologiczną liścia pszenicy a ekspresją genów kodujących inhibitory
proteaz. Odmiana Arabella, która wykazała najsilniejszą ekspresję genów inhibitorów proteaz, posiada blaszkę liściową
pokrytą najmniejszą liczbą struktur wzmacniających, które mogą pełnić funkcję obronne. Sugeruje to, że odmiana ta
kompensuje brak wzmacniających struktur na blaszce liściowej, wyższą ekspresją genów kodujących inhibitory proteaz.
Wyrządzane szkody przez skrzypionki są widoczne gołym okiem, ale do wielu zmian w roślinie dochodzi na
poziomie molekularnym. Przeprowadzone badania pozwoliły poznać rolę roślinnych inhibitorów proteaz w odpowiedzi
na uszkodzenie, żerowanie skrzypionek. Poznano strategie przystosowawcze owada na hamujący wpływ inhibitorów,
zależność struktur morfologicznych liści i poziomu ekspresji genów PI w odpowiedzi na uszkodzenie mechaniczne przez
owada tkanek roślinnych. Dodatkowym aspektem projektu jest to, że przeprowadzone badania wskazały, że w tej walce
rośliny oraz owady nie są same, że wpływ na interakcje roślina-owad mogą mieć np. mikroorganizmy towarzyszące
zarówno jednym, jak i drugim. Ten aspekt autorzy projektu chcieliby zgłębić w dalszych badaniach. W obecnych czasach,
gdy dąży się do ograniczenia ilości stosowanych pestycydów, bardzo ważne jest poznanie mechanizmów oddziaływania
roślina – owad. Uzyskana wiedza, może stać się podstawą do opracowania nowych metod, środków ochrony roślin
pochodzenia naturalnego, które nie miałyby szkodliwego wpływu na środowisko, a tym samym na człowieka. Może
przyczynić się do zrozumienia pewnych aspektów fizjologii roślin i owadów.