Marta Markiewicz, Agnieszka Barnyk - IHAR
Transkrypt
Marta Markiewicz, Agnieszka Barnyk - IHAR
Ziemniak Polski 2010 nr 2 1 BIAŁKA AKTYWNE BIOLOGICZNIE OBECNE W SOKU POKROCHMALNIANYM POKROCHMALNI NYM mgr inż. Marta Markiewicz1, dr inż. Agnieszka Barnyk2 1 Politechnika Gdańska, Katedra Technologii Chemicznej, ul. Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk, e-mail: [email protected] 2 IHAR, Zakład Nasiennictwa i Ochrony Ziemniaka w Boninie e-mail: [email protected] 1. Białka jako produkt uboczny krochmalnictwa Podczas przetwarzania jednej tony ziemniaków na skrobię powstaje od 5 do 12 m3 soku ziemniaczanego, który zawiera 300-410 g/kg białek w całkowitej suchej masie. Przybliżona zawartość białka w soku poprodukcyjnym typowego zakładu przetwórstwa ziemniaczanego zawiera się w granicach 1-4 g/l, czysta frakcja białkowa stanowi ok. 50% osadu (Vikelouda, Kiosseoglou 2004). Białka znajdują się w soku poprodukcyjnym w formie natywnej (aktywnej funkcjonalnie). Jednakże z uwagi na ich wysoką wrażliwość na ogrzewanie i siły ścinające często ulegają denaturacji podczas filtrowania, a nawet przechowywania (Zwijnenbegr i in. 2002). 1.1. Rodzaje białek obecnych w odpadzie krochmalniczym Trzy główne grupy białek zawartych w bulwach ziemniaka to: białka typu patatyny, grupa białek złożonych o wielkości 22 kDa oraz inhibitory proteaz o charakterze zasadowym (Ralet, Gueguen 2000b). Białka typu patatyny są jednorodną grupą kwaśnych białek, stanowiących do 40% wszystkich białek rozpuszczalnych obecnych w bulwach ziemniaka. Pierwszy raz zostały wyizolowane przez Racusena i Foote’a w 1980 roku. Białka te występują w formie dimerów o łącznej wielkości ok. 88 kDa, złożonych z podjednostek o wielkości ok. 40 kDa (Ralet, Gueguen 2000a). Istnieje wiele form patatyny, można je podzielić na cztery grupy: A, B, C i D, stanowiące odpowiednio 62, 26, 5 i 7% patatyn występujących w tkance bulw ziemniaka czy w soku poprodukcyjnym (Pots i in. 1999). Wszystkie formy mają niemal identyczną sekwencję aminokwasową i są immunologicznie nierozróżnialne. Patatyna służy głównie jako białko zapasowe, ale ma również aktywność enzymatyczną pozwalającą na trawienie tłuszczów (Ralet, Gueguen 2000a) należących do fosfolipidów, glikolipidów, sulfolipidów oraz mono- i diacylogliceroli. Zdaniem Tonon i innych (2001) aktywność lipolityczna patatyny może być częścią mechanizmu obronnego, pozwalającego na hamowanie procesu patogenezy. Druga grupa białek, obejmujących związki o wielkości 22 kDa, jest zdecydowanie gorzej poznana niż patatyna. Wiadomo, że białka do niej należące mają charakter zasadowy. Grupa ta obejmuje dwie odrębne rodziny białek, z których każda wykazuje zdolność do hamowania enzymów proteolitycznych trawiących białka. Frakcja ta stanowi ok. 30-40% białek obecnych w bulwach ziemniaka (Ralet, Gueguen 2000b). Inhibitory proteaz, stanowiące 20-30% ekstraktu (Ralet, Guegeun 2000b), są w przeciwieństwie do białek z grupy patatyny znacznie bardziej zróżnicowane. Białka w tej grupie różnią się masą cząsteczkową, sekwencją aminokwasów oraz aktywnością enzymatyczną. Można je podzielić na siedem kategorii (Pouvreau i in. 2001): ● inhibitory I (PI-1) – białka o wielkości 7-8 kDa, hamujące chymotrypsynę oraz w mniejszym stopniu trypsynę; ● inhibitory II (PI-2) – dimery zbudowane z dwóch podjednostek, wśród których wyróżniamy cztery typy: A, B, C i D. Zależnie od tego, które z podjednostek tworzą białko, 2 Ziemniak Polski 2010 nr 2 zmienia się powinowactwo inhibitora do trypsyny i chymotrypsyny; ● inhibitory proteazy cysteinowej (PCPI) – to rodzina białek o wielkości 20-22 kDa. Niektóre z nich wykazują częściową zdolność do hamowania proliferacji komórek nowotworowych (Ledoigt i in. 2006). Inhibitory te wykazują maksimum aktywności w pH 5-7, czyli takim, jakie panuje w przewodzie pokarmowym insektów wytwarzających proteazy serynowe; ● inhibitory proteazy asparaginowej (PAPI), o wielkości ok. 20 kDa i optimum aktywności w zakresie pH 3-5. Bulwy ziemniaka zawierają inhibitor proteinazy asparaginowej – katepsyny D, który hamuje oprócz katepsyny D także trypsynę i chymotrypsynę, ale nie wykazuje aktywności w stosunku do proteaz asparaginowych takich jak pepsyna, renina lub katepsyna E (Lawrence, Kouldal 2002); ● inhibitory proteazy typu Kunitza (PKPI) – mają wielkość ok. 20 kDa i wykazują aktywność w stosunku do chymotrypsyny i nieco mniejszą aktywność w stosunku do trypsyny. Jorgensen i inni (2006) wyizolowali z soku poprodukcyjnego aż czternaście wariantów inhibitorów proteaz typu Kunitza, które wykazywały aktywność w stosunku do trypsyny oraz proteaz pochodzących z grzybów Fusarium; ● inhibitor karboksypeptydaz (PCI) – jest najmniejszym z inhibitorów obecnych w bul- wach ziemniaka (4,3 kDa), złożonym tylko z jednego peptydu. Odznacza się bardzo dużą odpornością termiczną i wykazuje aktywność w stosunku do karboksypeptydazy A (Pou-vreau i in. 2001). Inhibitory karboksypeptydaz pochodzące z ziemniaka są silnymi inhibitorami o szerokim spektrum działania, hamującymi zarówno enzymy zwierzęce, jak i produkowane przez mikroorganizmy, ale nie działają na karboksypeptydazy serynowe drożdży i roślin (Lawrence, Koundal 2002); ● inne inhibitory proteazy serynowej (OSPI) – mają wielkość ok. 21 kDa i są złożone z dwóch podjednostek. Wykazują aktywność w stosunku do chymotrypsyny, trypsyny i elastazy (Pouvreau i in. 2001). Inhibitory proteaz serynowych wykazują największą aktywność w pH 9-11, zakres ten odpowiada pH, jakie występuje w przewodzie pokarmowym insektów rzędu Lepidoptera, wśród których wyróżnia się wiele szkodników roślin (Lawrence, Koundal 2002). Biologiczna rola inhibitorów proteaz nie jest poznana, ale istnieją hipotezy wskazujące na trzy funkcje, które mogą spełniać: są białkami zapasowymi, ponadto służą jako regulatory aktywności endogennych proteaz oraz stanowią czynniki chroniące roślinę przed insektami i patogenną mikroflorą (Ledoigt i in. 2006). Tabela 1 Charakterystyka białek występujących w wodach sokowych Białko Patatyna Masa cząsteczko43 wa (kDa) Procentowa za37,5% wartość w soku Zakres pI 4.0 Liczba izoform Substrat lipidy PI-1 PI-2 PCPI PAPI PKPI PCI OSPI 7-8 20 20-23 19-22 20 4,3 21 4,5% 22,3% 11,9% 5,9% 3,6% 0,9% 1,5% nie ozna- 7,5-8,8 -czono 8 7 8 6 2 2 trp, trp, chym, trp, chym, trp, chym, trp, chym, trp, chym chym, LEL LEL pap LEL, kat D LEL 5,1-7,8 5,5-6,9 5,9-9,4 6,2-8,7 8,0-9,0 Objaśnienia: trp – trypsyna, chym – chymotrypsyna, LEL – ludzka elastyna leukocytowa, kat D – katepsyna D; Źródło: Pouvreau i in. (2001); Ralet, Gueguen (2000) 1.2. Sposoby izolacji białek z soku poprodukcyjnego Jednym ze sposobów izolacji białek z produktów ubocznych krochmalnictwa jest kon- centracja z użyciem odwróconej osmozy połączona z koagulacją termiczną białek, a następnie ich separacją i suszeniem. Tak pozyskane białko ma słony i gorzki smak oraz Ziemniak Polski 2010 nr 2 ograniczone zastosowanie. Nie może być używane jako np. dodatek do żywności, a jedynie jako pasza dla zwierząt. Wykorzystanie ultrafiltracji pozwala na uzyskanie preparatu o nieco lepszych właściwościach organoleptycznych, mogącego być np. dodatkiem do produktów mięsnych, jednak w ilości nie większej niż 10% masy produktu i przy zastosowaniu substancji maskujących jego smak i zapach (Zwijnenberg i in. 2002). Sharma i inni (2004), stosując rozdział na kolumnach wypełnionych jonowymieniaczem, uzyskali rozdział białek na dwie grupy: związane na kolumnie – białka kwasowe (22% ilości białek naniesionych na kolumnę) i niezwiązane – białka zasadowe (71%). Frakcja kwasowa wykazywała aktywność antygrzybową. Możliwe jest również odzyskiwanie białek z soku poprodukcyjnego na drodze kombinacji koagulacji termicznej i strącania kwasem. Jednak białka uzyskane w ten sposób są nieodwracalnie zdenaturowane i pozbawione aktywności biologicznej właściwej ich formom natywnym (Pots i in. 1998). Inne metody umożliwiające wydzielenie białek z soku to kompleksowanie na bentonicie lub karboksymetylocelulozie (Ralet, Gueguen 2000b). Kompleksowanie przy uży-ciu polisacharydów wydaje się najwłaściwszą metodą izolacji białek w formie natywnej (Gonzalez i in. 1991). 1.3. Potencjalne zastosowanie wyizolowanych białek Roślinne inhibitory proteaz (enzymów trawiących białka) odgrywają znaczącą rolę w obronie roślin przed patogenami i zwierzętami roślinożernymi. Hamując aktywność proteaz, ograniczają ilość białek, które są trawione przez szkodniki, oraz powodują nadprodukcję enzymów hydrolitycznych, co zwiększa utratę aminokwasów siarkowych (Lawrence, Koundal 2002). W efekcie dochodzi najpierw do zahamowania rozwoju insektów, a ostatecznie do ich śmierci. Niektóre białkowe inhibitory proteaz pozyskiwane z ziemniaka są toksyczne na przykład w stosunku do: Sesamia inferens, Chrysodeixus erisoma, Teleogryllus comodus, Diabrotica virgifera i Diabrotica undecimpuntata (Lawrence, Kouldal 2002). Kim i inni (2005) stwierdzili, że jeden z inhibitorów proteaz 3 typu Kunitza – potamin-1 – hamuje wzrost i rozmnażanie się niektórych bakterii, np. Staphylococcus aureus, Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis oraz grzybów, np. Candida albicans i Rhizoctonia solani. Inhibitor ten odznacza się niezwykłą aktywnością antydrobnoustrojową, jednocześnie nie oddziałując na komórki ssaków. W rok później grupa badaczy pod kierunkiem Kima wyizolowała z bulw ziemniaka inne białko o charakterze inhibitora proteaz serynowych typu Kunitza o wielkości zbliżonej do potamin-1, ale innej sekwencji aminokwasowej. Białko to otrzymało nazwę potide-G i wykazywało aktywność antybakteryjną i przeciwgrzybową w stosunku do tych samych patogenów co potamin-1, a ponadto także względem Listeria monocytogenes i Escherichia coli (Kim i in. 2006). Potide-G ma zdolność hamowania infekcji wirusa PVYO nawet w stężeniu dziesięciokrotnie niższym niż jego średnie stężenie w bulwach ziemniaka (Tripathi i in. 2006). Białkowe inhibitory proteinaz wyizolowane z bulw ziemniaka są wykorzystywane w przemyśle spożywczym do hamowania niekorzystnych zmian enzymatycznych w mięsie ryb, mięczaków i skorupiaków. Podczas przetwarzania tych produktów w temperaturze 60°C aktywowane są enzymy rozkładające miozynę i powodujące zniszczenie tekstury tych surowców. Inhibitory proteaz z ziemniaka znalazły też zastosowanie w produkcji surimi (jap. „mielone mięso”, produkt na bazie zmielonego mięsa białych ryb, najczęściej mintaja lub morszczuka; popularny w kuchniach dalekowschodnich; najbardziej znana postać to paluszki krabowe – przyp. red.) z kilku gatunków ryb, co pozwoliło na poprawę jakości produktu i zwiększenie zysków (Garcia-Carreño 1996). Opisywano antynowotworowe działanie inhibitorów proteaz pochodzących z bulw ziemniaka. Inhibitory proteaz I i II posiadają zdolność hamowania zmian w komórkach prowadzących do transformacji nowotworowej (Billings i in. 1991). Natomiast ziemniaczane inhibitory karboksypeptydaz hamują proliferację komórek kilku linii gruczolaka trzustki (Blanco-Aparicio i in. 1998). Ma to ogromne potencjalne znaczenie terapeutyczne ze względu na brak skutecznej terapii w przypadku tego nowotworu. 4 Ziemniak Polski 2010 nr 2 Ponadto wykazano, że spożywanie izolowanych z bulw ziemniaka inhibitorów proteaz powoduje uwalnianie substancji powodujących zmniejszenie wchłaniania spożywanego pokarmu, a w efekcie prowadzi do zmniejszenia masy ciała. Na bazie inhibitorów proteaz wyprodukowano i wprowadzono na rynek dwa suplementy diety w postaci napoju (Satietrol) i kapsułek (Satise), zawierające mieszaninę białek z ziemniaka i kwasów tłuszczowych, efektywnie wspomagające odchudzanie (Fear i in. 2007). Ruseler-van Embden i inni (2004) udowodnili, że inhibitory proteaz pozyskiwane z ziemniaka mogą być z doskonałym skutkiem stosowane w leczeniu pooperacyjnych zapaleń skóry będących efektem podrażnień wywoływanych przez enzymy trzustkowe. Z badań tych wynika też, że inhibitory trypsyny z soi również hamują działanie enzymów trzustkowych, jednak w znacznie mniejszym stopniu niż inhibitory proteaz izolowane z ziemniaka. Te ostatnie blokują niemal zupełnie aktywność wszystkich trzech enzymów trzustkowych. Ze względu na zdolność do hamowania wzrostu Candida albicans inhibitory proteaz mogą być stosowane również w leczeniu drożdżyc jamy ustnej, przełyku i dróg moczowych (Kim i in. 2005). Patatyna – stanowi część systemu obronnego rośliny przed patogenami, wykazując zdolność degradacji ścian komórkowych bakterii i grzybów (Sharma i in. 2004). Ponadto aktywność patatyny powoduje uwal-nianie substratów do wytwarzania toksycznych dla patogenów pochodnych kwasów tłuszczowych i wosków (Andreau i in. 1998). Patatyna okazała się też bardzo obiecującym czynnikiem pianotwórczym. Jej zdolność do tworzenia i utrzymania piany jest porównywalna ze sproszkowanym białkiem jaja kurzego, a nawet lepsza (Ralet, Guegen 2000). Może też być stosowana jako enzymatyczny katalizator niektórych procesów, jak deacylacja czy synteza estrów, wykazujący aktywność nawet przy małej dostępności wody w środowisku (Hirschberg i in. 2001). Białko to wykazuje także właściwości antyutleniające w stosunku do β-karotenu i kwasu linolenowego, więc może znaleźć zastosowanie jako ekologiczny konserwant. Ma też zdolność neutralizacji wolnych rodników, mających istotne znaczenie w indukcji choroby Alzheimera, nowotworów, choroby wieńcowej oraz procesu starzenia się organizmu, mogłoby więc być brane pod uwagę jako czynnik hamujący lub opóźniający tego typu zmiany chorobowe (Yen-Wenn i in. 2003). 1.4. Podsumowanie W ciągu ostatniego dziesięciolecia znacznie wzrosło zainteresowanie białkami obecnymi w produktach ubocznych przemysłu krochmalniczego ze względu na ich wielokierunkowe potencjalne zastosowanie. Obecnie udowodniono, w skali laboratoryjnej, przydatność tych związków jako biodetergentów, emulsyfikatorów, insektycydów, bakteriocydów, leków, katalizatorów reakcji chemicznych, konserwantów itp., a nawet z powodzeniem zastosowano je jako dietetyczne dodatki do żywności dla ludzi. Ponieważ białka pozyskiwane z ziemniaka mają naturalne pochodzenie, są uważane za bardziej bezpieczne i mogą stanowić alternatywę dla chemicznych dodatków do żywności, m. in. konserwantów lub środków pieniących. Odpad pokrochmalniczy jest bogatym źródłem patatyny i inhibitorów proteaz, powstającym w ogromnych ilościach. Przetworzenie 100 t ziemniaków daje 75 m3 płynnych odpadów zawierających biologicznie aktywne białko, które może być źródłem dodatkowych dochodów. Literatura 1. Billings P., Jin T., Ohnishi N., Liao D., Habres J. 1991. The interaction of the potato-derived chymotripsin inhibitor with C3H/10T1/2 cells. – Carcinogenesis 12: 653-657; 2. Blanco-Aparicio C., Molina M. A., Fernández-Salas E., Frazier M. L., Mas J. M., Querol E., Avilés F. X., de Llorens R. 1998. Potato carboxypeptidase inhibitor, a T-knot protein, is an epidermal growth factor antagonist that inhibits tumor cell growth. – J. Biol. Chem. 273: 12370-12377; 3. Fear G., Komarnytsky S., Raskin I. 2007. Protease inhibitors and their peptidomimetic derivatives as potential grugs. – Pharmacology and Therapeutics 113: 354368; 4. Garcia-Carreño F. L. 1996. Protease inhibitors. – Trends Food Sci. Tech. 7(6): 197-204; 5. Gonzalez J. M., Lindemood J. B., Desai N. 1991. Recovery of proteins from potato plant waste effulents by complexation with carboxymethylcelulose. – Food Hydrocolloids 4: 355-363; 6. Hirschberg H., Simons J., Ziemniak Polski 2010 nr 2 Dekker N., Egmond M. 2001. Cloning, expression, purification and characterization of patatin, a novel phospholipase A. – Eur. J. Bioch. 268: 5037-5044; 7. Jorgensen M., Bauw G., Welinder K.G. 2006. Molecular Properties and Activities of Tuber Proteins from Starch Potato Cv. Kuras. – J. Agric. Food Chem. 54 (25): 9389-9397; 8. Kim J. Y., Seong-Cheol Parka, Mi-Hyun Kima, Hak-Tae Limb, Yoonkyung Parka, Kyung-Soo Hahm 2005. Antymicrobial activity studies on a trypsin-chymotripsin protease inhibitor obtained from potato. – Bioch. Biophys. Res. Communic. 330: 921-927; 9. Kim M., Park S., Kim J., Lee S., Lim H., Cheong H., Hahm K., Park Y. 2006. Purification and characterization of heat-stable serine protease inhibitor from the tubers of new potato variety „Golden Valley”. – Bioch. Biophys. Res. Communic. 346: 681-686; 10. Lawrence P., Koundal K. 2002. Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects. – Electr. J. Biotech. 5: 93-109; 11. Ledoigt G., Griffaut B., Debiton E., Vian C., Mustel A., Evray G., Maurizis J. C., Madelmoth J.C. 2006. Analysis of secreted protease inhibitors after water stress in potato tubers. – Intern. J. Biol. Macromol. 38: 268-271; 12. Pots A., Gruppen H., Hessing M., van Boekel M. A. J. S., Voragen A. G. J. 1999. Isolation and Characterization of Patatin Isoforms. – J. Agric. Food Chem. 47: 4587-4592; 13. Pouvreau L., Gruppen H., Piersma S., van den Broek L., van Koningsveld G., Voragen A. 2001. Relative abdundance and inhibitory distribution of protease inhibitors in potato fruit juice cv. Elkana. – J. Agric. Food Chem. 49: 2864-2874. 14. Ralet M., Gueguen J. 2000 A. Fractionation of potato proteins: 5 Solubility, Thermal coagulation and Emulsifying properties. – Food Sci. Tech. 33: 380-387; 15. Ralet M., Gueguen J. 2000 B. Foaming properties of potato raw proteins and isolated fractions. – Food Sci. Tech. 34: 266-269; 16. Ruseler-van Embden J., van Lieshout L., Smith S., van Kessel I., Laman D. 2004. Potato tuber proteins efficiently inhibit human faecal proteolytic activity: implication for treatment of per-anal dermatitis. – Eur. J. Clinical Invest. 34: 303-311; 17. Sharma N., Gruszewski H., Park S.W., Holm D., Vivanco J. 2004. Purification of an isoform of patatin with antimicrobial activity against Phytophtora infestans. – Plant Phys. Bioch. 42: 647-655; 18. Tonon C., Daleo G., Oliva C. 2001. An acidic β-1,3 gucanase from potato tubers appears to be patatin. – Plant Phys. Bioch. 39: 847-854; 19. Tripathi G. R., Park J., Park Y., Hwang I., Park Y., Hahm K.S., Cheong H. 2006. Potide-G derived from potato (Solanum tuberosum L.) is activeagainst potato virus YO (PVYO) infection. – J. Agric. Food Chem. 54(22): 8437-8443; 20. Vikelouda M., Kiosseoglou V. 2004. The use of carboxymethylcellulose to recover potato proteins and control their functional properties. – Food Hydrocolloids. 2004. 18: 21-27; 21. Yen-Wenn L, Chuan-Hsiao H., Mei-Hsien L., Feng-Lin H., Wen-Hi H. 2003. Patatin, the tuber storage protein of potato (Solanum tuberosum L.), exhibits antioxidant activity in vitro. – J. Agric. Food Chem. 51: 4389–4393; 22. Zwijnenberg H., Kemperman A., Borringter M., Lotz M., Dijkstehuis J., Poulsen P., Koops G. 2002. Native protein recovery from potato fruit juice by ultrafiltration. – Desalination 144: 331-334