docS. cerevisiae
download 
Reklamacja Transkrypt
S. cerevisiae
Organizmy modelowe drożdże Saccharomyces cerevisiae i nie tylko Co można badać na drożdżach? • Praktycznie wszystkie podstawowe aspekty biologii molekularnej, biologii komórki, genetyki Transdukcja sygnału Czego nie można badać na drożdżach • Różnicowanie i rozwój • Neurobiologia • Regulacja przez małe niekodujące RNA (siRNA, miRNA) • Alternatywny splicing Drożdże i cykl komórkowy Nobel dla drożdży Drożdże i cykl komórkowy Nobel 2001 Cykl komórkowy Mutanty cdc S. cerevisiae • Cykl komórkowy podobny do wyższych Eukaryota • Fazy G1, S, G2, M i wrzeciono podziałowe • Lee Hartwell – zastosowanie genetyki drożdży do badania cyklu komórkowego (1970-73) • Mutanty temperaturowrażliwe (ts), analizowane za pomocą mikroskopii (zdjęcia poklatkowe) • populacja zatrzymuje się w tej fazie, której dotyka mutacja • stwierdzenie, której fazy cyklu dotyczy defekt w mutancie Mutanty cdc S. cerevisiae http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2001/hartwell-lecture.pdf Mutanty wee i cdc u S. pombe • Podziały komórki skoordynowane z wzrostem komórek • Mutant wee – komórki zaczynają się dzielić, kiedy są jeszcze małe – zaburzona kontrola startu cyklu Regulacja cyklu • wee1 – inhibitor podziałów • • utrata funkcji - małe komórki cdc25, cdc2 – aktywatory • utrata funkcji – duże komórki Regulacja cyklu komórkowego Od drożdży do człowieka • mutację cdc2 S. pombe można odwrócić wprowadzając na plazmidzie ludzki gen CDK1 (Cyclin Dependent Kinase) Drożdże i transkrypcja Kolejny Nobel dla drożdży Drożdże i transkrypcja Drożdże i transkrypcja Drożdże i transkrypcja Drożdże i transkrypcja Łatwość hodowli – przydatne w projektach oczyszczania i krystalizacji białek Drożdże i mitochondria Profil metaboliczny S. cerevisiae • Fakultatywne aeroby • Efekt Pasteura – tlen hamuje fermentację, ale… • Efekt Crabtree – w obecności glukozy (C6) fermentacja anaerobowa nawet w obecności tlenu • Glukoza hamuje oddychanie • Etanol jest następnie wykorzystywany (jeżeli nadal jest tlen) • Strategia “akumulacja i konsumpcja” S. cerevisiae i mitochondria – co szczególnego? • Przeżywa bez funkcji oddechowej (fakultatywny tlenowiec, fermentacja) • • Mutanty z defektywnym oddychanie, – petite (lata 1960.) Przeżywa bez genomu mitochondrialnego (“petite positive”) glukoza glicerol (fermentacja) (oddychanie) Fenotyp petite u S. cerevisiae • • Zmiany w mtDNA • 0 ρ • ρ • mit – całkowita utrata mtDNA – częściowa utrata mtDNA, znaczne delecje i reamplifikacja - mutacje punktowe, prawidłowa struktura genomu Zmiany w nDNA – mutanty pet Oddziaływania jądrowo mitochondrialne • Proteom mitochondrium ~500-800 białek • 8-9 kodowane w mtDNA • Ponad 150 genów jądrowych niezbędnych do utrzymania mitochondrialnego systemu genetycznego jądro mitochondrium Ucieczka genów Ewolucja nowych funkcji Utrata genów Kompleks III Kompleks IV syntaza ATP III Błona wewnętrzna IV V Matrix Cox1 polimeraza RNA Cox3 Atp6 Cox2 Atp9 Atp8 Cob on Rpo41 lati s n Tra 24 tRNA Mtf1 21S rRNA mtDNA Cob, Cox1, Cox2, Cox3, Atp6, Atp8, Atp9, Var1 LSU Transkrypcja Translacja SSU 15S rRN A 9S RNA Var1 + Rybosom Rpm2 RNaza P Bartosz Zapisek, 2011. Nie tylko S. cerevisiae • • S. cerevisiae był od dziesiątków lat standardowym modelem genetyki mitochondrialnej • metabolizm fakultatywnie aerobowy • przeżywa bez mtDNA (petite positive) Pod wieloma względami jest nietypowy • przeżywa bez mtDNA (petite positive) • nietypowa organizacja, ekspresja i replikacja mtDNA • brak genów kompleksu I (dehydrogenaza NADH) w mtDNA • genom po epizodzie duplikacji całego genomu (WGD) i utracie redundantnych paralogów Drożdże jako model dla genetyki człowieka Genomy S. cerevisiae ~1,2 x 107 bp ~6500 genów H. sapiens ~3 x 109 bp ~25 000 genów ~1800 genów wykazuje homologie z genami H. sapiens (30%) ~ 4000 genów wykazuje homologie z genami S. cerevisiae (13%) Wiele podstawowych funkcji komórki jest zachowanych. Niekiedy możliwa wymienność białek drożdżowych i ludzkich (np. Ras, Oxa1) Baza danych Przykładowe drożdżowe modele chorób • Progerie Wernera i Blooma • Choroby związane z defektami naprawy DNA (HNPCC, ataksjatelangiektazja) • Ataksja Friedreicha • Zaburzenia komunikacji jądrowo - mitochondrialnej (PEO) • Choroby wywołane mutacjami w mtDNA (NARP) • Poszukiwanie leków za pomocą drożdży C1orf31, COA6 • C1orf31 - zachowywany w ewolucji gen, funkcja u człowieka nieznana • Mutacje u chorych na choroby serca (kardiomiopatia przerostowa) związane z defektami mitochondrialnymi • Homolog drożdżowy - COA6 COA6 • Zaangażowany w składanie kompleksu IV (oksydaza cytochromowa) Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069 Fenotyp odwracany przez dodanie 2+ Cu • W sekwencji białka motywy, które mogą wiązać jony miedzi Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069 Model mutacji znalezionych u pacjenta • Mutacje u chorych w konserwowanych pozycjach • Fenotyp zgodny z defektem oddychania komórkowego Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069 Model w układzie wielokomórkowym • • Wyciszenie homologicznego genu w zarodkach ryby Danio (TB wyciszenie, MMC - kontrola) • nie wymaga funkcjonalnego serca przez pierwsze 4-5 dni rozwoju • u ssaków byłby to efekt letalny Fenotyp - defekt rozwoju serca Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069 Zaburzenia komunikacji jądrowomitochondrialnej • • Mutacje w genach kodujących białka odpowiedzialne za utrzymanie mtDNA • ANT1 (transporter ADP/ATP) • POLG (polimeraza DNA) Choroby dziedziczone autosomalnie, objawiają się delecjami w mtDNA lub deplecją mtDNA PEO • PEO -postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (porażenie mięśni gałki ocznej) • Postać dominująca (adPEO) lub recesywna (arPEO) • Objawy • opadanie powiek (ptosis), • niezdolność do poruszania gałkami oczu, • ogólne osłabienie mięśni, • zaburzenia neurologiczne, Inne choroby związane z mutacjami POLG • Zespół Alpersa (ciężka postępująca choroba neurodegeneracyjna) • SANDO (sensory ataxic neuropathy, dysarthria, and ophthalmoparesis) Mutacje i modele drożdżowe • POLG (mitochondrialna polimeraza DNA) • • drożdżowy homolog MIP1 ANT1 (mitochondrialny transporter ATP/ADP • drożdżowy homolog AAC2 http://tools.niehs.nih.gov/polg Homologia POLG i MIP1 • Mutacje w MIP1 powodują niestabilność genomu mitochondrialnego • spontaniczne delecje • mutacje punktowe • całkowita utrata mitochondrialnego DNA Homologia POLG i MIP1 • Mutacje w MIP1 powodują niestabilność genomu mitochondrialnego • spontaniczne delecje • mutacje punktowe • całkowita utrata mitochondrialnego DNA Choroby wywołane mutacjami w mtDNA • Np. NARP – Neurogenic Ataxia Retinitis Pigmentosa • Mutacja w genie ATP6 • W komórkach 70-90% zmutowanego DNA • Obniżona aktywność syntezy ATP Drożdżowe modele chorób mitochondrialnych • S. cerevisiae – jedyny organizm modelowy, u którego można wprowadzać DNA do mitochondriów – ukierunkowana mutageneza mtDNA Rak, M. et al. J. Biol. Chem. 2007;282:34039-34047 Poszukiwanie nowych leków Identyfikacja substancji aktywnych Drożdże na szalce (murawa) Testowane związki nakraplane na krążki filtrów Drugs are deposited on filters kontrola negatywna Związki aktywne Długowieczność i starzenie Długowieczność drożdży • Zastosowanie drożdży S. cerevisiae jako modelu zjawisk związanych ze starzeniem proponowano od lat 60. (Mortimer & Johnson) • Dwa mechanizmy • starzenie replikatywne – limit podziałów komórki-matki (~30) • starzenie chronologiczne – przeżywalność w fazie spoczynkowej hodowli (wyczerpane źródła energii) Mechanizmy kontrolujące długowieczność mogą być konserwowane w ewolucji Drożdże i biologia systemów Drożdże w XXI wieku Projekty na skalę genomową • Delecje (analiza fenotypowa) • Nadekspresja białek (MORF) • Zmiany ekspresji genów (mikromacierze, fuzje reporterowe) • Lokalizacja białek w komórce (fuzje z GFP) • Interakcje białek (system dwuhybrydowy) • Interakcje genetyczne (np. syntetyczne letalne) • Mapowanie QTL Merz & Westermann, 2009 Problem analiz wysokoprzepustowych Geny pet (niezbędne do oddychania) Problem analiz wysokoprzepustowych • Powtarzalność wyników w różnych badaniach jest niewielka • Znaczny wpływ tła genetycznego i warunków doświadczalnych Analizy wysokoprzepustowe – roboty laboratoryjne ©Singer Instruments, UK Wykorzystanie kolekcji delecyjnych CP - Common Primer - wspólny starter UPTAG, DNTAG - “kody kreskowe”, unikatowe sekwencje Steinmetz & Davis, 2004, Nat. Rev. Genet. 5: 190–201 Steinmetz & Davis, 2004, Nat. Rev. Genet. 5: 190–201 Fenotyp a analiza ekspresji • • Dwa najczęstsze podejścia genomiki funkcjonalnej: • analiza ekspresji (transkryptomika) - zmiany poziomu mRNA w różnych warunkach • analiza fenotypowa - defekt wzrostowy (fitness) w określonych warunkach Czy wyniki (zidentyfikowane geny) się pokrywają? Fenotyp a ekspresja Wzrost na galaktozie Giaever et al. Nature 418, 387–391 (2002) Fenotyp a ekspresja Tolerancja wysokiego stężenia soli Giaever et al. Nature 418, 387–391 (2002) Fenotyp a ekspresja • Nakładanie się znaczącej zmiany ekspresji i defektu wzrostu • <7% dla wzrostu na galaktozie i 1M NaCl • ~7% dla wzrostu na niefermentowalnych źródłach węgla • ~16% dla sporulacji Poszukiwanie interakcji genetycznych • Oddziaływania łagodzące (np. supresja) • • selekcja bezpośrednia Oddziaływania syntetyczne • syntetyczna letalność: • • pojedyncze mutacje gen1 i gen2 nie są letalne, ale podwójny mutant gen1, gen2 nie przeżywa syntetyczne wzmocnienie • pojedyncze mutacje gen1 i gen2 słaby fenotyp, podwójny mutant gen1, gen2 silny fenotyp (np. spowolnienie wzrostu) Ujęcie ilościowe Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25 SGA • Synthetic Gene Array • Kolekcja delecji, krzyżowana z badanym genem • Sporulacja, • Selekcja haploidów MATa • Selekcja pojedynczych i podwójnych mutantów Boone et al. Nature Reviews Genetics, 2007 vol. 8 (6) pp. 437 SGA http://www.utoronto.ca/boonelab/sga_technology/index.shtml dSLAM Diploid-based synthetic lethality analysis with microarrays (dSLAM) Rekonstrukcja sieci interakcji Dixon et al. 2009, Systematic mapping of genetic interaction networks. Annu Rev Genet 43:601-25 Interakcje genetyczne – ujęcie systemowe • Interakcje genetyczne wskazują na związki funkcji • Mogą wiązać elementy tego samego szlaku/kompleksu, ale też różnych szlaków, powiązanych funkcją • Zestaw interakcji (pozycja na mapie interaktomu genetycznego) może wskazywać na funkcję genu Sieci interakcji • Sieć interakcji syntetycznych letalnych jest rzadka – około 1% • Interakcje syntetyczne są jednak częste pomiędzy genami o powiązanej funkcji (18%-25%) Dixon et al. 2009, Systematic mapping of genetic interaction networks. Annu Rev Genet 43:601-25 Interakcje genetyczne a fizyczne • Interakcje fizyczne i genetyczne rzadko się nakładają, choć częściej, niż przewidywano by dla pełnej losowości • Nakładanie się interakcji genetycznych i fizycznych częste dla interakcji pozytywnych (epistaza) • Interakcje negatywne z reguły pomiędzy różnymi kompleksami fizycznymi Dixon et al. 2009, Systematic mapping of genetic interaction networks. Annu Rev Genet 43:601-25 Wyniki – sieci interakcji genetycznych Costanzo i wsp., (2010) Science 327, 425 Genomika cech wieloczynnikowych • Dziedziczenie wieloczynnikowe - fenotyp zależy od interakcji alleli wielu genów oraz środowiska • W odróżnieniu od fenotypów mendlowskich mają zwykle charakter zmienności ciągłej (ilościowej), a nie dyskretnej • QTL - Quantitative Trait Loci - loci cech ilościowych - obszary genomu w istotny sposób wpływające na fenotyp cechy wieloczynnikowej Genomika cech wieloczynnikowych • Ważne zagadnienie dla • genetyki człowieka • częste choroby, zmienność prawidłowa • genetyki roślin uprawnych • genetyki zwierząt hodowlanych • teorii ewolucji • Głównie analizy statystyczne • Czy można zastosować proste organizmy modelowe? QTL u drożdży • QTL u drożdży można badać wykorzystując szczepy o różnym tle genetycznym • S. cerevisiae - bardzo duża zmienność, nawet wśród szczepów laboratoryjnych QTL u drożdży - 3 strategie • Bulk Segregant Analysis (BSA) - masowa analiza segregantów • Individual Segregant Analysis (ISA) - analiza pojedynczych segregantów (równoległa) • Reciprocal Hemizygosity Scanning (RHS) - analiza hemizygotycznych delecji QTL u drożdży Wilkening et al. (2014), Genetics, 196:853-865 QTL u drożdży Wilkening et al. (2014), Genetics, 196:853-865 QTL u drożdży - metoda ISA Wilkening et al. (2014), Genetics, 196:853-865 QTL u drożdży • Metoda ISA pozwala na mapowanie cech, których nie można selekcjonować (np. kształt kolonii) • Skuteczność zależy od liczby pojedynczych segregantów, które można przeanalizować • Obecnie do ~1000 Genotypowanie szczepów • Co można dziś • Do 384 bibliotek/tydzień • <15€/próbka • 30x pokrycie Wilkening et al. BMC Genomics 2013 14:90 Inne zastosowanie metody ISA Mapa częstości rekombinacji homologicznej w skali genomu Wilkening et al. BMC Genomics 2013 14:90 Ewolucja eksperymentalna Ewolucja eksperymentalna • Możliwość prowadzenia wielu hodowli równolegle przez wiele pokoleń Ewolucja wielokomórkowości • Selekcja w hodowlach S. cerevisiae w kierunku szybkiego opadania osadu • Pojawiają się grupy komórek (“płatki śniegu”) Ewolucja wielokomórkowości wyjściowe - jednokomórkowe po 14 pokoleniach selekcji po 60 pokoleniach selekcji Ewolucja specjalizacji • Pod koniec w zgrupowaniach pojawił się podział funkcji – niektóre komórki inicjują programowaną śmierć by ułatwić podział grupy przez fragmentację Wzrost kolonii Podział kolonii
