przepis do ćwiczenia 9

Ćwiczenie 9
Biochemiczne mechanizmy obrony przed stresem oksydacyjnym - oznaczanie aktywności
wybranych enzymów antyoksydacyjnych
Oznaczanie aktywności katalazy (CAT)
Odczynniki:
• Bufor fosforanowy 0,067M (pH 7,0)
• H2O2 2mM w buforze fosforanowym - 20 mM H2O2: sporządzić 3% roztwór nadtlenku
wodoru (Pcode: 101308050 – 30,8% H2O2) – rozcieńczyć odczynnik z Sigmy – 10,27 razy
(1 µl H2O2 i 9.27 µl buforu fosforanowego), pobrać 22,7 µl 3% roztworu H2O2 i zmieszać z
977 µl buforu fosforanowego. Uzyskaną mieszaninę rozcieńczyć 10 x
na 1 gr (5 zespołów) potrzeba:
• zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści roślin poddanych stresowi i kontrolnych:
2x 100 mg
• Bufor fosforanowy 0,067M (pH 7,0) 8 ml ekstrakcja + 15ml referencja
• H2O2 2mM w buforze fosforanowym – 30 ml
Sprzęt:
• Spektrofotometr
• wirówka
• wytrząsarka
• łaźnia wodna
• łaźnia lodowa
• probówki eppendorfa 1,5ml
• Probówki PP zakręcane (bo do wrzącej łaźni wodnej) (co najmniej 7-15ml)
• Kuwety szklane
• pipety szklane i automatyczne
Materiał roślinny:
• wierzba poddana stresowi
• wierzba – osobniki kontrolne.
Procedura:
• przygotować 2 probówki
• do pierwszej odważyć ok 20 mg zhomogenizowanego wcześniej proszku z roślin poddanych
stresowi a do drugiej z roślin kontrolnych
• zanotować masę naważki
• proszek zalać 800 ul buforu fosforanowego (pH 7,0)
• wytrząsać przez 30 min
• proszek odwirować przez 10 min a nadsącz użyć do oznaczenia aktywności enzymatycznej
katalazy
• przygotować 3 nowe probówki
23
•
•
•
•
do 2 z nich dodać 3ml buforu fosforanowego z H2O2 (próbka stresowa i kontrolna) a do
trzeciej 3 ml buforu fosforanowego bez H2O2 (referencja).
Następnie do każdej probówki dodać 40 ul ekstraktu enzymatycznego dokładnie zamieszać i
pobrać 2 ml do kuwety. UWAGA ekstrakt dodawać bezpośrednio przed pomiarem.!!!!
Zmierzyć na spektrofotometrze czas potrzebny do zmiany wartości absorbancji o 0,05
jednostki przy 240 nm (używać kuwet kwarcowych) – pomiar przez minimum 3 min
jednostkę enzymatyczną (unit) obliczyć jako ilość enzymu potrzebna do podniesienia
absorbancji o 0,05 jednostki na 1 min
Oznaczanie aktywności peroksydazy (POD)
Odczynniki:
• H2O2 1% w 0.1M buforze fosforanowym, pH 6.5 - 20 mM H2O2: sporządzić 1% roztwór
nadtlenku wodoru (Pcode: 101308050 – 30,8% H2O2) – rozcieńczyć odczynnik z Sigmy
30,8 x buforem fosforanowym 0,1M pH 6,5
• 0,1 M bufor fosforanowy II (pH 6,5)
• Pirogallol: 0.05 M w 0.1M buforze fosforanowym (pH 6.5)
na 1 gr (5 zespołów) potrzeba:
• zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści roślin poddanych stresowi i kontrolnych:
2x 100 mg
• H2O2 1% w 0.1M buforze fosforanowym, pH 6.5 5 ml
• 0,1 M bufor fosforanowy II (pH 6,5) 8 ml
• Pirogallol: 0.05 M w 0.1M buforze fosforanowym (pH 6.5) 15 ml
Sprzęt:
• Spektrofotometr
• wirówka
• wytrząsarka
• łaźnia wodna
• łaźnia lodowa
• probówki eppendorfa 1,5ml
• Probówki PP zakręcane (bo do wrzącej łaźni wodnej) (co najmniej 7-15ml)
• Kuwety szklane
• pipety szklane i automatyczne
Materiał roślinny:
• wierzba poddana stresowi
• wierzba – osobniki kontrolne.
Procedura:
• przygotować 2 probówki
• do pierwszej odważyć ok 20 mg zhomogenizowanego wcześniej proszku z roślin poddanych
stresowi a do drugiej z roślin kontrolnych
• zanotować masę naważki
• proszek zalać 800 ul buforu fosforanowego II (pH 6,5)
• wytrząsać przez 30 min
24
•
•
•
•
•
•
•
proszek odwirować przez 10 min a nadsącz użyć do oznaczenia aktywności enzymatycznej
peroksydazy
przygotować 3 nowe probówki
do każdej dodać 3 ml roztworu pirogalolu i 0,1ml ekstraktu enzymatycznego
takim roztworem napełnić kuwetę z referencja i wyzerować dla 430 nm
do probówek testowych z próbkami dodać 0,5 ml roztworu H2O2 zamieszać i przelać 2 ml
uzyskanego roztworu do kuwety testowej
notować zmiany absorbancji co 30 s przez 3 min pomiaru względem referencji przy 430 nm
jednostkę enzymatyczną (unit) peroksydazy obliczyć jako zmianę absorbancji / min przy
430 nm.
25