Izolacja i analiza kolagenu 1.Izolacja: Materiały i odczynniki: Skóra z

Izolacja i analiza kolagenu
1.Izolacja:
Materiały i odczynniki:
Skóra z ryby łososiowatej
1,5% roztwór kwasu mlekowego
0,4g kwasu cytrynowego
Instrukcja:
1.Oddzielić części grzbietowe, pośrednie i brzuszne.
2.Każdą z części skóry płukać bieżącą wodą.
3.Przygotować 50 ml 1,5% roztwór kwasu mlekowego z dodatkiem 0,4g kwasu cytrynowego.
4. Do kolby włożyć skórę i zalać wcześniej przygotowanym roztworem.
5. Pozostawić w lodówce na 7dni.
6.Przesączyć i pozostawić do analizy.
2. Identyfikacja:
Identyfikacja kolagenu nastąpi na zajęciach razem z identyfikacją keratyny.
Materiały i odczynniki:
Wyizolowany kolagen
Marker
4x Bufor obciążający
10x bufor elektrodowy
Żel poliakrylamidowy 15%
Coomassie Blue G-250
Roztwór odbarwiający
Instrukcja:
1.Do 100 μl wyizolowanego kolagenu dodać 300 μl roztworu 1.5M Tris-HCl + 0.4% SDS, pH
8.8, wirować przez 3 min
2.Pobrać 9 μl próbki i dodać 3 μl 4x buforu obciążającego.
3. Umieścić próbki w termobloku rozgrzanym wcześniej do 95 oC na 5 min., zwortexować i
zwirować.
4.Przygotować 300ml 1x bufor elektrodowy poprzez rozcieńczenie 10x buforu elektrodowego
wodą destylowaną w stosunku 1:10.
5. Przygotować żel poliakrylamidowy usuwając grzebień do formowania studzienek.
6.Umieścić żel w aparacie do elektroforezy i wlać 300ml 1x buforu elektrodowego.
7.Nanieść po 10 μl próbki do studzienki.
8.Rozpocząć elektroforezę (V=const, 75V, po ok.30 min zmienić na 150V).
9.Po zakończeniu elektroforezy wyjąć żel, opłukać wodą.
10.Żel barwić za pomocą Coomassie Blue G-250 przez 15 min.
11.Odbarwić żel roztworem odbarwiającym 2x 20 min.
12.Zidentyfikować kolagen.
3.Sprawozdanie
1.Krótki przebieg doświadczenia.
2.Skan żelu z zidentyfikowanym kolagenem.
3.Widmo CD kolagenu
4.Wnioski