materiały - Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej

Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2014/15
Znaczenie promieniowców w biotechnologii leków
Promieniowce (rząd: Actinomycetales) są bakteriami powszechnie występującymi
w środowisku glebowym, stąd ich izolacja i hodowla zostały przeprowadzone już w początkowej
fazie rozwoju mikrobiologii – w drugiej połowie XIX wieku (w 1877 roku wyizolowano pierwszy
gatunek Actinomyces bovis wywołujący promienicę u cieląt). Początkowo promieniowcom nie
przypisywano ważniejszej roli aż do czasu, gdy zespół Selmana A. Waksmana wyizolował z hodowli
Streptomyces griseus najważniejszy od czasu odkrycia penicyliny antybiotyk: streptomycynę
(1943 r.). Dzięki jej produkcji na masową skalę (od roku 1948) możliwe stało się zwalczanie gruźlicy,
choroby dotychczas niewyleczalnej znanymi chemioterapeutykami lub penicyliną. Kolejne odkrycia
metabolitów promieniowców o aktywności antybiotycznej potoczyły się lawinowo i rozpoczęły
trwającą przez ponad dwie dekady złotą erę antybiotykoterapii. Obecnie, spośród ponad 10 tysięcy
odkrytych i scharakteryzowanych antybiotyków tylko około 100 ma zastosowanie lecznicze i jest
produkowane na skalę przemysłową. Zdecydowana większość antybiotyków naturalnych jest
metabolitami promieniowców – ok. 2/3 wszystkich znanych antybiotyków, w tym aż 90%
stosowanych w lecznictwie. Wśród promieniowców najwięcej antybiotyków produkują szczepy
należące do rodzaju Streptomyces sp. (około połowa wszystkich stosowanych antybiotyków, w tym
wiele antybiotyków przeciwnowotworowych).
Tabela. Ważniejsze antybiotyki naturalne i ich półsyntetyczne pochodne stosowane w medycynie
lub w skali laboratoryjnej będące metabolitami promieniowców
ANTYBIOTYKI
AMINOGLIKOZYDOWE
streptomycyna
neomycyna
gentamycyna
tobramycyna
kanamycyna
amikacyna
erytromycyna
Streptomyces griseus
Streptomyces fradiae
Micromonospora purpurea
Streptomyces tenebrarius
Streptomyces kanamyceticus
antybiotyk półsyntetyczny
Saccharopolyspora erythraea
półsyntetyczna pochodna
erytromycyny
półsyntetyczna pochodna
erytromycyny
Streptomyces ambofaciens
antybiotyk półsyntetyczny
Streptomyces noursei
antybiotyk półsyntetyczny
Streptomyces natalensis
Streptomyces hygroscopicus
azytromycyna
klarytromycyna
MAKROLIDY
spiramycyna
roksitromycyna
nystatyna
rifampicyna
natamycyna
rapamycyna
1
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2014/15
tetracyklina
TETRACYKLINY
LINKOZAMIDY
ANTYBIOTYKI
POLIPEPTYDOWE
chlorotetracyklina
(aureomycyna)
oksytetracyklina
rolitetracyklina
doksycyklina
minocyklina
limecyklina
linkomycyna
klindamycyna
wankomycyna
aktynomycyna D
D-cykloseryna
chloramfenikol
bleomycyna
fosfomycyna
INNE
cykloheksimid
(aktidion)
amfoterycyna B
nowobiocyna
doksorubicyna
(adriamycyna)
Streptomyces aureofaciens, S.
viridifaciens
Streptomyces aureofaciens, S.
viridifaciens, S. psammoticus
Streptomyces rimosus
antybiotyk półsyntetyczny
antybiotyk półsyntetyczny
antybiotyk półsyntetyczny
antybiotyk półsyntetyczny
Streptomyces lincolnensis
antybiotyk półsyntetyczny
Streptomyces orientalis
Streptomyces antibioticus
liczne szczepy Streptomyces sp.
(obecnie otrzymywana w wyniku
pełnej syntezy chemicznej)
Streptomyces venezuelae
(obecnie otrzymywany w wyniku
pełnej syntezy chemicznej)
Streptomyces verticillus
liczne szczepy Streptomyces sp.
(obecnie otrzymywana w wyniku
pełnej syntezy chemicznej)
Streptomyces griseus
Streptomyces nodosus
liczne szczepy Streptomyces sp.
Streptomyces pauceticus var.
caesius
W 1 gramie gleby znajduje się około 104-106 konidiów promieniowców (106-108 komórek
bakterii, 102-104 zarodników grzybów). Promieniowce preferują gleby obojętne lub lekko zasadowe
(cecha ta odróżnia je od grzybów, co wykorzystuje się praktycznie podczas ich izolacji na przykład
poprzez dodatek węglanu wapnia), o niskim uwodnieniu. Bardzo obficie występują w torfie i
kompoście, gdzie bytują na rozkładających się szczątkach roślinnych. Wśród promieniowców
przeważają gatunki tlenowe (np. Nocardia sp.), choć występują też gatunki względnie beztlenowe
(np. Actinomyces sp.). Większość promieniowców jest saprofitami, a jedynie nieliczne gatunki mogą
być chorobotwórcze dla człowieka lub zwierząt – wywołują promienicę (przede wszystkim
Actinomyces israeli). U koni i owiec opisano także dermatozę wywoływaną przez gatunek
Dermatophilus congolensis. Przewlekła ekspozycja na zarodniki promieniowców u rolników może
doprowadzić do rozwoju choroby o podłożu alergicznym, tzw. „płuca farmera”. Zarodniki
promieniowców obficie występują także w powietrzu zamkniętych pomieszczeń np. w biurach.
2
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2014/15
Powietrze o wysokiej wilgotności względnej (powyżej 70%) może zawierać 5,3-7 x 104 jednostek CFU
promieniowców w 1 m3, co stanowi do 25-40% ogólnej liczby bakterii w powietrzu. Najczęściej
identyfikowane gatunki promieniowców to Streptomyces sp. i Nocardia sp. Wydzielanie
aromatycznych substancji lotnych przez promieniowce może skutkować objawami tzw. „Zespołu
Chorego Budynku”.
Rola promieniowców w ekosystemach glebowych jest ogromna. Wynika ze zdolności tych
bakterii do
rozkładu
wielu
substancji
nie
rozkładanych
przez
inne
mikroorganizmy
(długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, ligniny, chityna, kwasy huminowe, węglowodory
aromatyczne). Szczególnie rozpowszechnionym w glebie i osadach dennych rodzajem
promieniowców zdolnym do rozkładu celulozy jest Micromonospora sp. innym często spotykanym
rodzajem o takich właściwościach jest Streptosporangium sp. Produkty metabolizmu są zwykle
wydzielane na zewnątrz komórek. Metabolity te często mają charakter związków zapachowych (np.
geosmina, czyli 1,10-dimetylo-9-dekalol, nadająca glebie charakterystyczną ziemistą woń).
Promieniowce należą do bakterii właściwych, gramdodatnich, tworzących strzępki.
Charakterystyczna morfologia ich kolonii powoduje, iż makroskopowo promieniowce bardziej
przypominają grzyby strzępkowe niż bakterie. Promieniowce tworzą kolonie zbudowane z
rozgałęzionych nitek przypominające morfologię grzybni. Z uwagi na to pozorne podobieństwo
początkowo promieniowce zaliczono do grzybów: nazwa pierwszego odkrytego rodzaju
promieniowców Actinomyces sp., od którego nazwę przyjął cały rząd, oznacza „promienisty grzyb”.
Kolonie promieniowców nadal nazywa się tradycyjnie „grzybniami”, choć od dawna promieniowce
stanowią jednostkę systematyczną bakterii, a nie grzybów (rząd Actinomycetales oficjalnie
wyodrębniono w 1916 roku). Rozmnażanie promieniowców przebiega poprzez fragmentację
strzępek „grzybni” bądź też poprzez produkcję egzospor (konidiów). Morfologia kolonii, tryb życia,
wymagania troficzne, cykl życiowy i rozmnażanie przypominają więc grzyby strzępkowe pomimo, że
budowa pojedynczych komórek jest typowa dla bakterii. Strzępki tworzone przez promieniowce są
jednak mniejsze (1-5 mm) i są mniej zróżnicowane morfologicznie w porównaniu ze strzępkami
grzybów będących typowymi plechowcami. Również morfologia promieniowców w hodowli
wgłębnej, płynnej przypomina morfologię kolonii grzybów strzępkowych (nitkowate kłaczki lub
kuleczki). W hodowli wgłębnej nie dostrzega się zróżnicowania morfologii strzępek. Natomiast w
warunkach
hodowli
powierzchniowej
(podłoże
zestalone)
promieniowce
tworzą
dwa
charakterystyczne typy strzępek. W pierwszym etapie powstaje tzw. grzybnia substratowa
(wegetatywna, podstawowa). Składa się z delikatnej siateczki zbudowanej ze strzępek wnikających
wgłąb podłoża. Strzępki często składają się z syncytiów, czyli komórek z wieloma nukleoidami
3
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2014/15
nieprzydzielonych ścianami komórkowymi. Po kilkudniowej hodowli w kolonii powstaje grzybnia
generatywna (wtórna, powietrzna). Ma bardziej zwartą strukturę wystającą ponad powierzchnię
grzybni substratowej. W grzybni powietrznej przebiega sporulacja, czyli wytwarzanie zarodników.
Proces ten przebiega na strzępkach zwanych sporoforami. Nie są to specjalne twory, a jedynie
rodzaj strzępek różniący się morfologicznie od pozostałych; mogą przybierać różne kształty – prosty,
wrzecionowaty, spiralny, falisty - będące jedną z cech diagnostycznych dla poszczególnych rodzajów
i gatunków promieniowców.
Zarodniki promieniowców (artrospory, konidia) są bardzo odporne na zewnętrzne warunki
środowiska, zwłaszcza wysuszenie, i mogą w stanie anabiozy przetrwać wiele lat. Są jednak dość
wrażliwe na wysoką temperaturę – giną po około 10 minutach w temperaturze 70°C. Wyjątkiem są
zarodniki gatunku Thermoactinomyces vulgaris, które przypominają składem chemicznym
endospory laseczek przetrwalnikujących (wysoka zawartość kwasu dipikolinowego). Gatunek ten
jest termofilem występującym w gnijącym sianie i kompoście. Na odpowiednim podłożu i w
optymalnych warunkach termicznych następuje kiełkowanie spor i wyrastanie nowych kolonii
substratowych. Kiełkowanie rozpoczyna się od pęcznienia spor. Cały proces kiełkowania trwa, w
zależności od rodzaju promieniowca i od warunków zewnętrznych, od 3 do 8 godzin. Spory
promieniowców wykazują duże zróżnicowanie morfologiczne i są jedną z najważniejszych cech
diagnostycznych. Mogą tworzyć łańcuszki, jak u Streptomyces sp., lub też występować pojedynczo
np. u Micromonospora sp. U niektórych gatunków spory nie są wytwarzane w grzybni powietrznej,
lecz
powstają
w
specjalnych
sporangiach
(np.
Actinoplanes
sp.,
Ampullariella
sp.,
Streptosporangium sp.). większość zarodników promieniowców jest nieruchliwa, choć u niektórych
rodzajów zarodniki są urzęsione i mają zdolność ruchu (np. Actinoplanes sp.).
Analiza molekularna (sekwencja rDNA) wykazała bardzo skomplikowaną naturę
promieniowców. Są między innymi spokrewnione z takimi rodzajami jak Mycobacterium,
Corynebacterium, Brevibacterium. Taksonomia promieniowców wyróżnia osiem podgrup
obejmujących 41 rodzajów (tom IV w kluczu Bergey’a):

Nocardioform Actinomycetes (13 rodzajów, w tym Nocardia sp.);

Multilocular Actinomycetes (3 rodzaje, np. Frankia sp.);

Actinoplanetes (5 rodzajów, w tym Micromonospora sp.);

Streptomycetes (4 rodzaje, w tym Streptomyces sp.);

Maduromycetes (7 rodzajów);

Thermomonospora (4 rodzaje);
4
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2014/15

Thermoactinomycetes (1 rodzaj Thermoactinomycetes sp. wytwarzający endospory podobnie jak laseczki przetrwalnikujące z grupy Bacillus);

inne (4 rodzaje).
W literaturze opisano około 500 szczepów promieniowców. 90% promieniowców
izolowanych z gleby należy do grupy Streptomycetes (dosłownie: poskręcany grzyb) obejmującej 4
rodzaje, w tym główny rodzaj Streptomyces sp. To właśnie do tej grupy należy większość
promieniowców o znaczeniu biotechnologicznym. Promieniowce Streptomycetes produkują lotne
związki organiczne nadające charakterystyczną woń zaoranej ziemi, spleśniały zapach ziemi w
piwnicy, a także gnijącej słomy. Część z nich jest termofilna i dlatego często występuje w oborniku i
kompoście. Klasyfikacja izolowanych szczepów promieniowców na podstawie opracowanych kluczy
jest bardzo trudna. Wiele cech diagnostycznych (np. barwa grzybni, wytwarzanie pigmentu)
wykazuje duże zróżnicowanie nawet w obrębie jednego szczepu w zależności od składu podłoża
hodowlanego. W literaturze powszechnie uznawane są cztery główne klucze. Powstały one jako
wynik wieloletnich badań w ramach międzynarodowego projektu ISP (International Streptomyces
Project). Uproszczony klucz do identyfikacji promieniowców bazuje na dwóch etapach:
1 etap: oznaczenie cech morfologicznych:
 typy sporoforów:
I Rectus-flexibilis
II Retinaculum-apertum
III Spira
IV Verticillus
 typy powierzchni zarodników:
1 gładkie
2 brodawkowate
3 kolczaste
4 owłosione
 barwa grzybni powietrznej: A biała
B żółta
C czerwona
D fioletowa
E niebieska
F zielona
G szara
2 etap: identyfikacja szczepu za pomocą testów uzupełniających:
 pigment melanoidowy:
a wytwarza
b nie wytwarza
 źródła węgla: 1 L-arabinoza
2 sacharoza
3 D-ksyloza
4 inozytol
5
5 D-mannitol
6 D-fruktoza
7 L-ramnoza
8 rafinoza