Inżynieria białka I, Ćwiczenie nr 5

Inżynieria białek I (2012/2013)
Ćwiczenie nr 5
CELE
1. Wprowadzenie zmutowanego genu blgB do wektora pET DUET-1/dcbC
2. Transformacja komórek E. coli, szczep DH5α przy pomocy szoku cieplnego
i elektroporacji
MATERIAŁY
W EKTOR
 pET DUET-1/dsbC trawiony enzymami restrykcyjnymi NdeI i KpnI
GENY
 blgB I56F trawiony enzymami restrykcyjnymi NdeI i KpnI
 blgB V92F trawiony enzymami restrykcyjnymi NdeI i KpnI
ODCZYNNIKI
 ligaza T4 (Fermentas)
 bufor do ligazy T4 (Fermentas)
ZESTAWY
 Clean-up (A&A Biotechnology) – zestaw do oczyszczania DNA z żelu agarozowego
WYKONANIE ĆWICZENIA
LIGACJA
I.
W małych probówkach (obj. 200 µl) przygotować mieszaninę ligacyjną wg schematu
zamieszczonego poniżej:
PODGRUPY A I B
woda destylowana
x µl
produkt PCR3 (blgB I56F) x µl (50–100ng)
wektor pET DUET-1/dsbC x µl (50–100ng)
bufor T4 (10 x stęż.)
x µl
ligaza T4 (5u/µl)
1,0 µl
końcowa objętość próbki
x µl
II.
Mieszaninę dobrze wymieszać przez pipetowanie i inkubować próbki w temperaturze
37°C przez 2 godziny.
III.
PODGRUPA A
Zinaktywować ligazę T4 poprzez 20-minutową inkubację mieszaniny ligacyjnej
w temperaturze 65°C. Można w tym celu wykorzystać termocykler.
PODGRUPA B
Oczyścić DNA z mieszaniny ligacyjnej przy pomocy zestawu Clean-Up, używając do
wymycia DNA z kolumny 30 µl sterylnej wody.
1
TRANSFORMACJA
PODGRUPA A
Transformacja komórek przy pomocy szoku cieplnego
1. Umieścić na lodzie 2 probówki z komórkami kompetentnymi (przygotowanymi na
poprzednich ćwiczeniach) i 2 opisane probówki zawierające:
a) mieszaninę ligacyjną,
b) sterylną wodę (objętość wody powinna być równa objętości mieszaniny ligacyjnej).
2. Po rozmrożeniu komórek bakteryjnych przenieść je do probówek zawierających DNA
i wodę. Mieszaniny delikatnie zamieszać i inkubować na lodzie 20 minut.
3. W tym czasie upewnić się czy temperatura w termobloku wynosi 42°C oraz umieścić 2 ml
pożywki LB bez antybiotyku w cieplarce (37°C).
4. Poddać komórki szokowi cieplnemu umieszczając je na 45 sekund w termobloku.
5. Ponownie umieścić komórki na lodzie na 2 minuty.
6. Dodać do probówek 1 ml ciepłego LB bez antybiotyku i pozostawić w temperaturze 37°C
na 30 minut.
7. Po inkubacji zawiesinę bakterii zwirować przy prędkości 5000 rpm przez 1 minutę.
Usunąć 1 ml nadsączu a osad bakterii zawiesić w pozostałej objętości płynu.
8. Komórki wysiać na szalki z ampicyliną i umieścić na 12–24 godzin w cieplarce (37°C).
PODGRUPA B
Transformacja komórek przy pomocy elektroporacji
1. Do sterylnej probówki przelać 2 ml LB bez antybiotyku i umieścić cieplarce (37°C).
2. Umieścić na lodzie 2 kuwety do elektroporacji, 2 probówki z komórkami
elektrokompetentnymi oraz 2 opisane probówki zawierające:
a) mieszaninę lligacyjną (30 µl),
b) sterylną wodę we DNA (30 µl).
3. Włączyć aparat do elektroporacji i ustawić poszczególne parametry wg wskazań:
napięcie 2,5 kV, pojemność 25 µF, opór 200 Ώ
4. Po rozmrożeniu przenieść komórki do opisanych probówek z DNA, dokładnie wymieszać,
inkubować na lodzie 30–60s.
5. Mieszaniny przenieść do oznakowanych kuwet do elektroporacji, przykryć pokrywką
i bardzo dokładnie osuszyć. Umieścić kuwetę w aparacie.
6. Dostarczyć impuls elektryczny. Jak najszybciej usunąć kuwetę z aparatu i dodać do
komórek 1 ml ciepłego LB.
7. Czynność powtórzyć dla drugiej próbki.
8. Zawartość kuwet przenieść do sterylnych probówek (obj. 1,5 ml) i inkubować przez 30
minut w temperaturze 37°C.
9. Po inkubacji zawiesinę bakterii zwirować przy 5000 obr/min. przez 1 min. Usunąć 1 ml
nadsączu a osad bakterii zawiesić w pozostałej objętości płynu.
10. Komórki wysiać na szalki z ampicyliną i umieścić na 12–24 godzin w cieplarce (37°C).
2
Wytyczne do sprawozdania nr 1
Sprawozdanie powinno zawierać:
a) krótki wstęp teoretyczny,
b) cel i opis doświadczeń przeprowadzonych na ćwiczeniach 1–5,
c) wyniki poszczególnych doświadczeń oraz komentarz do wyników,
d) sekwencje i charakterystykę starterów wprowadzających mutację do genu
blgB oraz umożliwiających wklonowanie zmodyfikowanych genów do wektora
pET DUET-1/dsbC,
e) odpowiedzi na pytania zamieszczone poniżej,
f) bibliografię.
PYTANIA
1. Jakie jest optymalne stężenie żelu agarozowego do rozdziału fragmentów
DNA liczących 100–400 pz?
2. Co wchodzi w skład buforów do elektroforezy TAE i TBE. Czym oprócz składu
różnią się te bufory.
3. Na jakiej wysokości należy się spodziewać prążków pochodzących od
barwników wykorzystywanych w buforach obciążających – błękitu
bromofenolowego i cyjanolu ksylanowego – w dwuprocentowym żelu
agarozowym, odpowiednio, w buforach TBE i TAE?
4. W oparciu o informacje na temat genotypu bakterii E. coli ze szczepu DH5a
proszę wyjaśnić dlaczego szczep ten jest powszechnie wykorzystywany do
powielania i przechowywania wektorów plazmidowych?
5. Jaki jest mechanizm oporności bakterii na antybiotyki ampicylinę, tetracyklinę
oraz kanamycynę?
6. W jakim celu do wektora pET-Duet1 obok genu blg B wprowadzony został gen
dsb C?
3