Białka rekombinowane i ukierunkowana mutageneza (2011/2012)

INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
Instrukcja do ćwiczenia nr 5
Ligacja i transformacja
CEL
Wprowadzenie zmutowanego genu blgB do wektora pET DUET-1/dsbC oraz transformacja
komórek E. coli, szczep DH5α przy pomocy szoku cieplnego lub elektroporacji.
MATERIAŁY
W EKTOR
 pET DUET-1/dsbC trawiony enzymami restrykcyjnymi NdeI i KpnI
GEN
 blgB L1A,I2S,V92F trawiony enzymami restrykcyjnymi NdeI i KpnI
ODCZYNNIKI
 ligaza T4 (ThermoScientific)
 bufor do ligazy T4 (ThermoScientific)
ZESTAWY
 GeneElute PCR Clean-Up Kit (Sigma) – zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach
enzymatycznych
WYKONANIE ĆWICZENIA
LIGACJA
1. W małych probówkach (obj. 200 µl) przygotować mieszaninę ligacyjną wg schematu
zamieszczonego poniżej:
PODGRUPY A I B
woda destylowana
produkt PCR3 (blgB L1A,I2S,V92F)
wektor pET DUET-1/dsbC
bufor T4 (10 x stęż.)
ligaza T4 (5u/µl)
końcowa objętość próbki
x µl
x µl (50–100ng)
x µl (50–100ng)
x µl
1,0 µl
x µl
2. Mieszaninę dobrze wymieszać przez pipetowanie i inkubować próbki w temperaturze
37°C przez 2 godziny.
PODGRUPA A
3. Oczyścić DNA z mieszaniny ligacyjnej przy pomocy zestawu GeneElute PCR CleanUp, używając do wymycia DNA z kolumny 40 µl sterylnej wody.
PODGRUPA B
4. Zinaktywować ligazę T4 poprzez 5-minutową inkubację mieszaniny ligacyjnej
w temperaturze 70°C. Można w tym celu wykorzystać termocykler.
1
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
TRANSFORMACJA
PODGRUPA A
Transformacja komórek przy pomocy elektroporacji
1. Do sterylnej probówki przelać 2 ml LB bez antybiotyku i umieścić cieplarce (37°C).
2. Umieścić na lodzie 3 kuwety do elektroporacji, 3
elektrokompetentnymi oraz 2 opisane probówki zawierające:
probówki
z
komórkami
a) oczyszczoną mieszaninę po ligacji – 30 µl,
b) sterylną wodę – 30 µl (kontrola)
c) 50 ng wektora pETDUET-1/dsbC – 30 µl (kontrola)
3. Włączyć aparat do elektroporacji i ustawić poszczególne parametry wg wskazań:
napięcie 2,5 kV, pojemność 25 µF, opór 200 Ώ
4. Po rozmrożeniu przenieść komórki do opisanych probówek z DNA, dokładnie wymieszać,
inkubować na lodzie 30–60 s.
5. Mieszaniny przenieść do oznakowanych kuwet do elektroporacji, przykryć pokrywką
i bardzo dokładnie osuszyć. Umieścić kuwetę w aparacie.
6. Dostarczyć impuls elektryczny. Jak najszybciej usunąć kuwetę z aparatu i dodać do
komórek 1 ml ciepłego LB.
7. Czynność powtórzyć dla drugiej próbki.
8. Zawartość kuwet przenieść do sterylnych probówek (obj. 1,5 ml) i inkubować przez 30
minut w temperaturze 37°C.
9. Po inkubacji zawiesinę bakterii zwirować przy 5000 obr/min. przez 1 minutę. Usunąć 1 ml
nadsączu a osad bakterii zawiesić w pozostałej objętości płynu.
10. Komórki wysiać na szalki z ampicyliną (w przypadku transformacji mieszaniną ligacyjną
lub wektorem) oraz na szalki bez antybiotyku (w przypadku kontroli z użyciem wody)
i umieścić na 12 do 24 godzin w cieplarce (37°C).
PODGRUPA B
Transformacja komórek przy pomocy szoku cieplnego
1. Umieścić na lodzie 3 probówki z komórkami kompetentnymi (przygotowanymi na
poprzednich ćwiczeniach) i 2 opisane probówki zawierające:
a) mieszaninę ligacyjną,
b) sterylną wodę – objętość wody powinna być równa objętości mieszaniny ligacyjnej
(kontrola).
c) 50 ng wektora pETDUET-1/dsbC – 30 µl (kontrola)
2. Po rozmrożeniu komórek bakteryjnych przenieść je do probówek zawierających DNA
i wodę. Mieszaniny delikatnie zamieszać i inkubować na lodzie 20 minut.
3. W tym czasie upewnić się czy temperatura w termobloku wynosi 42°C oraz umieścić 2 ml
pożywki LB bez antybiotyku w cieplarce (37°C).
4. Poddać komórki szokowi cieplnemu umieszczając je na 45 sekund w termobloku.
5. Ponownie umieścić komórki na lodzie na 2 minuty.
2
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
6. Dodać do probówek 1 ml ciepłego LB bez antybiotyku i pozostawić w temperaturze 37°C
na 30 minut.
7. Po inkubacji zawiesinę bakterii zwirować przy prędkości 5000 rpm przez 1 minutę.
Usunąć 1 ml nadsączu a osad bakterii zawiesić w pozostałej objętości płynu.
8. Komórki wysiać na szalki z ampicyliną (w przypadku transformacji mieszaniną ligacyjną
lub wektorem) oraz na szalki bez antybiotyku (w przypadku kontroli z użyciem wody)
i umieścić na 12 do 24 godzin w cieplarce (37°C).
WYTYCZNE DO SPRAWOZDANIA NR 1
Po piątych ćwiczeniach w sprawozdaniu proszę zamieścić krótki opis przeprowadzonych
doświadczeń, w tym podać informację o ilości DNA użytego do ligacji oraz wykorzystanej
metodzie transformacji bakterii.
PYTANIA DO SPRAWOZDANIA NR 1
1.
W oparciu o informacje na temat genotypu bakterii E. coli ze szczepu DH5α proszę
wyjaśnić dlaczego szczep ten jest powszechnie wykorzystywany do powielania
i przechowywania wektorów plazmidowych?
2.
Jaki jest mechanizm oporności bakterii na antybiotyki ampicylinę, tetracyklinę oraz
kanamycynę?
3