pobierz plik - Wydział Biologii UW

Autoreferat rozprawy doktorskiej
mgr Katarzyny Filimonow
„Determinacja losu komórek i udział białek powierzchniowych w powstawaniu pierwotnej
endodermy w przedimplantacyjnym zarodku myszy”
Praca doktorska wykonana pod kierunkiem prof. dr. hab. Marka Maleszewskiego i dr Anety
Suwińskiej w Zakładzie Embriologii, Wydział Biologii UW
W czasie rozwoju przedimplantacyjnego zarodka myszy powstają trzy linie
komórkowe: trofektoderma (TE), epiblast (Epi) i pierwotna endoderma (PE). W dalszym
rozwoju zarodka linia TE bierze udział w tworzeniu zarodkowej części łożyska. Z linii Epi
powstają wszystkie tkanki ciała płodu i większość błon płodowych, a komórki linii PE biorą
udział w tworzeniu błony płodowej – pęcherzyka żółtkowego.
Pierwszy etap różnicowania komórkowego zachodzi w zarodku 16-komórkowym,
w którym komórki zewnętrzne rozpoczynają różnicowanie w kierunku TE. W dalszym
rozwoju zarodka powstaje jama, która spycha komórki wewnętrzne w jeden koniec, gdzie
tworzą one węzeł zarodkowy (ICM), będący mieszaniną komórek prekurosorowych Epi i PE.
Tuż przed implantacją zarodka dochodzi do segregacji komórek Epi i PE w obrębie ICM, tak
że komórki PE tworzą pojedynczą warstwę komórek, a Epi znajdują się w głębi ICM. W ten
sposób dochodzi do kolejnego etapu różnicowania, w wyniku którego w obrębie węzła
zarodkowego powstaje linia pluripotentna – Epi i druga po TE linia pozazarodkowa – PE.
W pierwszym etapie moich badań podjęłam się sprawdzenia, kiedy ostatecznie
determinowany jest los komórek ICM. Wykorzystując technikę filmowania poklatkowego
wykazałam, że ostateczna decyzja o różnicowaniu komórek prekursorowych Epi
podejmowana jest stopniowo, przy czym większość komórek tej linii ulega determinacji
do stadium 4,5-dniowej blastocysty. W tym czasie jednak pojedyncze komórki PE, a także
pojedyncze komórki Epi pozostają niezdeterminowane w tworzeniu tych linii i aż do końca
piątego dnia rozwoju mogą ulec przeprogramowaniu.
W drugiej części moich badań sprawdzałam, czy białka powierzchniowe komórek ICM
regulują różnicowanie PE. Badania te przeprowadziłam z wykorzystaniem zarodkowych
komórek macierzystych (komórki ES), będących modelem komórek ICM, które różnicowałam
w kierunku PE za pomocą kwasu retinowego (RA). Zaobserwowałam, że białka adhezyjne
kadheryna E i Pecam-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule) zanikają we wczesnych
etapach różnicowania komórek ES w kierunku PE. Dlatego podjęłam próbę określenia czy
białka te regulują powstawanie PE w blastocyście.
Wiadomo, że we wczesnych blastocystach Pecam-1 wykrywane jest we wszystkich
komórkach ICM, a następnie jego obecność ograniczona jest tylko do komórek Epi.
Sprawdziłam, czy brak Pecam-1 w komórkach ES spowoduje preferencyjne tworzenie przez
nie linii PE w blastocyście. Stwierdziłam, że komórki ES ze zmniejszoną ilością Pecam-1 nie
różnicują w kierunku PE, ale podobnie jak niezmodyfikowane komórki kontrolne, integrują
się z Epi. Oznacza to, że samo pozbawienie komórek ES białka Pecam-1 nie sprzyja ich
różnicowaniu w PE.
Podjęłam się także zbadania lokalizacji kadheryny E w komórkach blastocysty oraz
sprawdzenia jej roli w tworzeniu PE. Wykazałam, że we wczesnych blastocystach poziom
kadheryny E pomiędzy komórkami prekursorowymi PE oraz Epi jest podobny. Natomiast
w późnych blastocystach pomiędzy komórkami PE jest mniej kadheryny E niż pomiędzy
komórkami Epi. Wykazałam, że w komórkach PE, które znajdują się na powierzchni ICM,
lokalizacja kadheryny E jest spolaryzowana – brak jej w apikalnej części błony, a jest obecna
w jej części bocznej i podstawnej. Dodatkowo, zaobserwowałam jądrową lokalizację
kadheryny E w komórkach PE, co może mieć znaczenie w ochronie komórek tej linii przed
apoptozą. Wykazałam, że po segregacji komórek ICM, ilość mRNA kadheryny E w komórkach
linii PE jest mniejsza niż w komórkach Epi. Zatem poziom kadheryny E podczas segregacji
komórek ICM jest regulowany na poziomie transkrypcji.
Zbadałam również wpływ obniżenia poziomu kadheryny E (przy użyciu dsRNA) na
kierunek różnicowania blastomerów. Nie zaobserwowałam jednak preferencyjnej lokalizacji
komórek wywodzących się z blastomerów z obniżoną ilością kadheryny E. Wynik ten może
sugerować, że zmiany poziomu kadheryny E nie są bezpośrednio odpowiedzialne za
różnicowanie PE. Sprawdziłam także, że w moim układzie doświadczalnym brak kadheryny E
nie był kompensowany ekspresją kadheryny N.
Obniżona ilość kadheryny E, przy jednoczesnej obecności kadheryny N, wimentyny
oraz białka Snail są cechami procesu EMT (ang. epithelial – mesenchymal transition). Tuż po
implantacji blastocysty PE rozprzestrzenia się po wewnętrznej stronie TE. Dlatego też
sugeruje się, że w powstawanie PE zaangażowany jest proces EMT. Zaobserwowałam,
że wimentyna obecna jest w komórkach PE jedynie w późnych blastocystach, w stadium
okołoimplantacyjnym. Kadheryny N nie zaobserwowałam w żadnym z badanych przeze mnie
stadiów rozwoju zarodka. Wykazałam natomiast, że zarówno we wczesnych, jak i późnych
blastocystach w jądrach komórkowych komórek ICM obecny jest czynnik transkrypcyjny
Snail, będący inhibitorem ekspresji kadheryny E. Jego obecność, w połączeniu z wykrytym
przeze mnie obniżeniem ilości kadheryny E między komórkami ICM oraz obecnością
wimentyny w komórkach PE wskazywać może, że w komórkach tej linii może zachodzić
proces przemiany nabłonkowo-mezenchymalna (EMT) lub proces do niej podobny.