Joanna Kosman

„Nowe układy bioanalityczne bazujące na DNAzymach o aktywności
peroksydazowej”
Joanna Kosman
Stypendystka projektu pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za
strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu
Operacyjnego Kapitał Ludzki
DNAzymy o aktywności peroksydazy chrzanowej odkryto niespełna 15 lat temu, lecz
ich wielki potencjał aplikacyjny sprawia, że cieszą się coraz większym powodzeniem wśród
badaczy na całym świecie [1]. W porównaniu z enzymami białkowymi, układy oparte na DNA
posiadają wiele korzyści, takich jak łatwa synteza, oczyszczanie, a także odporność na
wysokie temperatury. Dodatkowo cząsteczki DNA ulegają procesowi hybrydyzacji czyli
łączenia się komplementarnych nici, co jest ważną cechą pod względem projektu układu.
Wszystkie te cechy sprawiają, że DNAzymy z powodzeniem zastępują peroksydazę
chrzanową w metodach bioanalitycznych.
Rys. 1. Schemat reakcji indykatorowych katalizowanych przez DNAzym o aktywności
peroksydazowej
Oligonukleotyd DNA by móc wykazywać aktywność peroksydazową musi przyjąć
strukturę G-kwadrupleksu, a następnie utworzyć kompleks z heminą. Istnieje powiązanie
pomiędzy topologią uformowanego G-kwadrupleksu a aktywnością enzymatyczną DNAzymu
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
[2]. Najwyższą aktywność wykazują G-kwadrupleksy o strukturze równoległej (wszystkie nici
skierowane w tym samym kierunku), przykładem może być oligonukleotyd o akronimie
PS2.M (5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’). DNAzymy o aktywności peroksydazowej
katalizują reakcję pomiędzy nadtlenkiem wodoru a substratem, który w wyniku reakcji
produkować będzie sygnał analityczny. Najczęściej stosowane są takie substraty, jak ABTS,
który w wyniku reakcji peroksydazowej zmienia barwę i luminol, który powoduje zjawisko
chemiluminescencji (Rys. 1)
Struktury
G-kwadrupleksów
mogą
się
również
tworzyć
na
zakończeniach
chromosomów, tzw. telomerach, które zabezpieczają przed stratą informacji genetycznej w
trakcie replikacji DNA. Proces namnażania się DNA jest tak skonstruowany, że w trakcie
każdej replikacji jedna z nici zostaje skrócona i gdyby nie obecność telomerów, z każdym
procesem replikacji DNA następowałaby strata informacji genetycznej. Długość telomerów
jest ściśle określona, a co za tym idzie każda komórka może przejść tylko określoną ilość
podziałów ( u człowieka jest to np. ok. 50). Wyjątkiem od tej reguły są komórki macierzyste,
które ze względu na swą funkcję, muszą przechodzić wielokrotne podziały. Takie komórki
posiadają enzym telomeraza, który wydłuża telomery. Enzym ten jest też obecny w prawie
90% komórek nowotworowych i jest jednym z mechanizmów zapewniających im.
nieśmiertelność. Telomeraza, może więc być traktowana jako marker nowotworów. Mój
doktorat poświęcony jest opracowaniu nowej metody wykrywania telomerazy przy pomocy
DNAzymów o aktywności peroksydazowej.
Jak wspomniano wcześniej, G-kwadrupleksy mogą się tworzyć na telomerach
(o sekwencji złożonej z powtórzeń (TTAGGG)n), a co za tym idzie mogą posłużyć do
zbudowania na nich DNAzymów peroksydazowych i dzięki temu do określenia aktywności
telomerazy. Schemat metody detekcji telomerazy przedstawiono na Rysunku 2. Badania
dowiodły jednak, że DNAzymy tworzone na niciach telomerowych cechują się niską
aktywnością w porównaniu z tym, który tworzony jest przez oligonukleotyd PS2.M.
Konieczna jest więc optymalizacja warunków środowiska, które mogą wpłynąć na przyjęcie
przez sekwencje telomerowi struktury G-kwadrupleksu powiązanej z wyższą aktywnością
peroksydazową.
Rys. 2. Schemat kolorymetrycznej (reakcja z ABTS) detekcji aktywności telomerazy
przy użyciu DNAzymu o aktywności peroksydazowej.
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
W trakcie optymalizacji przeprowadziłam badania na wpływu na aktywność, takich
czynników jak: rodzaj kationu, rodzaj buforu, stężenie składników, rodzaj surfaktantu, tempo
schładzania czy temperatura pomiaru. Optymalizacja warunków środowiskowych pozwoliła
na podniesienie aktywności peroksydazowej DNAzymu utworzonego na nici telomerowej, na
tyle, że możliwe jest wykorzystanie tego układu w detekcji telomerazy. Wynik optymalizacji
zostały opublikowane w Central European Journal of Chemistry [3]. Badania nad
opracowaniem tej metody wkroczyły w stadium pracy z ekstraktem z komórek
nowotworowych.
Rysunek 3. Porównanie aktywnośći DNAzymów opartych na różnych sekwencjach (
Tel1 i Tel2 na sekwencjach telomerowcyh) w środowisku różncyh surfaktantów.
Drugim elementem moich badań jest znalezienie nowych substratów dla reakcji
peroksydazowej.
Poszukuję
substratów,
które
w
wyniku
reakcji
peroksydazowej
wykazywałyby fluorescencję. Ta technika pomiarowa jest o wiele czulsza niż kolorymetria.
Badam takie substraty, jak: Amplex Red, tiamina, MNBDH. Również te substraty posłużą do
opracowania metody oznaczania telomerazy. Jednak pierwszym etapem musi być
zoptymalizowanie warunków środowiskowych dla poszczególnych substratów.
Kolejną techniką jaką wykorzystują w badaniach związanych z DNAzymami jest
Powierzchniowy Rezonans Plazmonowy (SPR). Technika ta pozwala na obserwacje
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
interakcji pomiędzy biomolekułami. W badaniach tych wykorzystuję reakcję enzymatycznego
wydzielania srebra przez DNAzym peroksydaozwy. Badania te prowadzę w ramach
współpracy z Institute of Photonic Technology w Jenie (Niemcy). Pierwszy staż odbyłam w
tej instytucji w lutym 2012 roku, natomiast w sierpniu 2012 odbędę drugi staż, na którym
prowadzić będę badania związane z techniką LSPR (Localized Surface Plasmon
Resonance) i reakcją wydzielania srebra przez DNAzym na nanocząstkach złota. Końcowym
etapem
planowanej
współpracy
jest
opracowanie
metody
detekcji
telomerazy
z
wykorzystaniem reakcji wydzielania srebra (monitorowanie techniką LSPR)
Badania związane z wykorzystaniem DNAzymów w bioanalityce mają bardzo duży
potencjał. Ich szczególne właściwości pozwalają na konstruowanie zupełnie nowych, jeszcze
lepszych narzędzi diagnostycznych. Jest to ważne z punktu widzenia telomerazy, jako
markera nowotworów. Jedną z przyczyn tak dużej śmiertelności w przypadku chorób
nowotworowych jest zbyt późne wykrywanie choroby. Nie da się więc przecenić wagi badań
związanych z diagnostyką, która umożliwiłaby detekcję nowotworów we wcześniejszym
stadium. Moje eksperymenty wpisują się w ten właśnie kanon badań. Opracowane metody
detekcji telomerazy na bazie DNAzymów o aktywności peroskydazowej będą mogły być
wykorzystane do zastąpienia tradycyjnej metody protokołu TRAP, która wymaga
zastosowania techniki PCR, co wiąże się z jej wysokimi kosztami. Szczególnie dużym
potencjałem cechuje się metoda z wykorzystaniem techniki LSPR i nanocząstek złota.
Technika ta związana jest z wysoką czułością. Zaznaczyć trzeba, że moje badania skupiają
się nad sekwencją telomerową. Możliwe jest jednak wykrywanie innych sekwencji (np.
wirusów HIV, HCV, H5N1) z wykorzystaniem sondy opartej na oligonukleotydzie PS2.M.
Opracowanie warunków środowiskowych, odpowiednich substratów, a także technik
pomiarowych pozwoli w przyszłości na wykrywanie dowolnej sekwencji DNA dzięki
peroksydazowej aktywnośći DNAzymu.
Literatura:
1. P. Travascio, Y. Liu, D. Sen, Chem. Biol. 5, 505 (1998).
2. D. King, J. Wu, N. Wang, W. Yang, H. Shen, Talanta, 80, 458 (2009).
3. J. Kosman, B. Juskowiak, Cent. Eur. J. Chem. 10, 368 (2012)
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego