Biomarkery, ogólna teoria stresu

Ekotoksykologia
Miary toksyczności
Biomarkery
Ogólna teoria stresu
Wpływ substancji toksycznych na populacje
Prof. dr hab. Ryszard Laskowski
Instytut Nauk o Środowisku UJ
Ul. Gronostajowa 7, Kraków
pok. 2.1.2
http://www.eko.uj.edu.pl/laskowski
Toksykologia a ekotoksykologia
• Toksykologia:
– wypracowana metodyka (obserwacja
pojedynczych organizmów lub komórek)
– jasne miary toksyczności (dawka letalna i
LD50, stężenie letalne i LC50, etc.)
• Ekotoksykologia:
– czy można stosować metody stosowane w
toksykologii?
Pamiętajmy: „...wyższe poziomy organizacji niż
pojedynczy osobnik...” – populacja to nie to samo co
organizm!
0.4
Gęstość prawdopodobieństwa
• Osobniki różnią się
tolerancją na warunki
środowiskowe –
rozkład cech w
populacji można z
reguły opisać tzw.
krzywą Gaussa
(rozkład normalny)
0.3
0.2
0.1
0
-5
-3
-1
1
Wartość cechy
3
5
Częstość
W ekotoksykologii na ogół interesuje nas rozkład
wrażliwości na stężenia substancji toksycznych w
populacji
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
20
40
60
80
0
100 0.5
Stężenie substancji chemicznej
Rozkład log-normalny: brak wartości
poniżej zera, prawo-skośny
1
1.5
2
Logarytm stężenia substancji chemicznej
Ten sam rozkład po
zlogarytmowaniu osi odciętych
2.5
Skumulowane
prawdopodobieństwo reakcji
Krzywa skumulowanego rozkładu (dystrybuanta) lognormalnego jako podstawa jednej z najważniejszych
technik w (eko)toksykologii: wyznaczanie LC50 - stężenia
powodującego 50% śmiertelność w populacji
1.0
LC50 - bardzo dobra
miara w toksykologii:
• duża dokładność
• dobre podstawy
statystyczne
0.5
Czy równie przydatna
w ekotoksykologii?
0
EC 10
LC50 (LD 50)
Logarytm stężenia (dawki)
W poszukiwaniu dobrych miar toksyczności
Analiza wariancji (ANOVA)
zalety: dość jasne wyniki
wady: nic nie wiadomo o
zależności dawka-reakcja
Analiza regresji z porównaniem
nachyleń możliwość porównania
toksyczności różnych substancji oraz
wyznaczenia wartości LC50
100
Śmiertelność
Wartość cechy
y = b1x + b2
B
A
50
y = a1x + a2
0
A
B
C
Substancja chemiczna
LC50(B)
LC 50(A)
Stężenie substancji chemicznej
To samo w ekotoksykologii...
• NOEC – „No Observed Effect Concentration”
• LOEC – „Lowest Observed Effect Concentration”
...nie ma sensu!
1.02
1.02
Kontrola
Kontrola
0.99
NOEC
0.96
LOEC
0.93
0.09
Wartość cechy
Wartość cechy
0.99
0.09
0.87
0.84
0.84
0.1
1
10
100 1000
Stężenie (dawka)
LOEC
0.93
0.87
0
NOEC
0.96
0
0.1
1
10
100 1000
Stężenie (dawka)
Wyniki uzyskane przy pomocy sześciu różnych testów a posteriori, zastosowanych
do porównania średnich z dziesięciu prób pobranych losowo z dwóch populacji: X o
średniej µX=90 oraz Y o średniej µY=100 i równych odchyleniach standardowych
sX=sY=10; n=10, α=0.05, β=0.11. Ta sama litera w kolumnie oznacza brak istotnej
różnicy przy założonym poziomie ufności 95%.
Próba
Metoda
Scheffégo Bonferroniego Newmana
-Keulsa
Średnia
Tukeya LSD
Duncana
X1
86.5
A
A
A
A
A
A
X2
89.4
AB
A
A
AB
AB
AB
X3
89.5
AB
A
A
AB
AB
AB
X4
91.9
AB
AB
A
AB
AB
ABC
X5
94.5
AB
ABC
A
AB
AB
ABCD
Y1
97.7
AB
BC
A
AB
AB
BCD
Y2
99.6
AB
BC
A
AB
B
CD
Y3
99.6
AB
BC
A
AB
B
CD
Y4
101.7
B
C
A
B
B
D
Y5
102.1
B
C
A
B
B
D
Przykłady świadczące o nieadekwatności
kryteriów NOEC i LOEC
Gatunek
Paramametr
(subst. toks.)
LOEC EC50
[mg/kg] [mg/kg]
Cognettia
sphagnetorum
Przyrost masy (Cu)
100
8
Folsomia candida
Reprodukcja (Cu)
800
658
Folsomia candida
Reprodukcja (LAS)
400
91
Platynothrus peltifer
Reprodukcja (LAS)
1000
467
Eisenia fetida
Liczba kokonów (LAS)
800
558
Eisenia fetida
Liczba kokonów (DMT)
10
5,3
Eisenia fetida
Liczba potomstwa (DMT)
10
7,1
Na problemach statystycznych
niestety nie koniec:
czas
1.000.000 lat
100.000 lat
10.000 lat
1.000 lat
biomy
100 lat
ekosystemy
10 lat
1 rok
populacje
1 dzień
osobnik
tkanki, narządy
1 godzina
1 sekunda
struktury subkomórkowe
przestrzeń
1mm 1mm
1m
1km
1.000 km
10.000 km
Zacznijmy od rzeczy „najprostszych”:
od osobnika
Podział zasobów energetycznych na wszelkie potrzeby osobnika
NORMALNE WARUNKI
ŚRODOWISKOWE
produkcja
30%
termoregulacja
30%
inne koszty lokomocja
utrzymania
20%
20%
STRES (niska temperatura)
produkcja
10%
inne
koszty
utrzymania
20%
lokomocja
20%
termoregulacja
50%
Co powodują substancje toksyczne?
•Toksyczność (głównie blokada enzymów)
•Konieczność metabolizowania
(detoksykacji) i wydalania, ew. gromadzenia
WNIKANIE
MIEJSCA
DZIAŁANIA
NIE
IKA
WN
WNIKANIE
MIEJSCA
METABOLIZOWANIA
WNIKANIE
MIEJSCA
GROMADZENIA
USUWANIE
Budżet energetyczny organizmu
Normalne warunki środowiskowe
Stres (substancja toksyczna)
Produkcja
10%
Produkcja
30%
Detoksykacja
2%
Inne koszty
utrzymania
68%
Detoksykacja
22%
Inne koszty
utrzymania
68%
Budżet energetyczny jest ograniczony:
tempa metabolizmu nie można zwiększać
w nieskończoność
• metabolizm maksymalny:
– ssaki – ok. 5-8 × BMR
– ptaki – ok. 10-15 × BMR
– zwierzęta zmiennocieplne są ograniczone
temperaturą ciała
Prawdopodobieństwo śmierci
„Ogólna teoria stresu”
A
B
Teoretyczna trajektoria wyznaczająca zależność
prawdopodobieństwa śmierci organizmu od
wielkości inwestycji w produkcję
Tempo produkcji
Koszty powstają na wielu etapach.
Jaka gospodarka jest w tych warunkach
optymalna?
Ekskrecja
Pożywienie
Pula
aktywna
Pula
pasywna
Aktywna detoksykacja
(nakłady energetyczne)
Ekskrecja
Gospodarowanie energią
Respiracja
R(w)
P r ze łą cz ni k
Asymilacja
Ciało o masie w
A(w)
Produkcja
u2P(w)
Reprodukcja
P(w)
Wzrost
u1P(w)
u3P(w)
u4P(w)
Immobilizacja
Dekontaminacja
Środowisko nieskażone
1.0
0.8
400
Wielkość
size
Prawdopodobieństwo przeżycia
Historia życia organizmu
0.6
0.4
growth
curve
krzywa
wzrostu
300
200
100
0
0
20
40
60
80
100
age
Wiek
0.2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Wiek
wzrost
reprodukcja
imobilizacja
dekontaminacja
Niska toksyczność puli pasywnej
1.0
concentration of metal
concentration
Stężenie
20
0.8
0.6
stężenie
metalu
active pool
passive pool
p. pasywna
10
p. aktywna
0
Wielkość
size
Prawdopodobieństwo przeżycia
W skażonym środowisku część energii
trzeba przeznaczyć na detoksykację
0.4
0.2
growth curve
krzywa
wzrostu
300
200
100
0
20
0
40
age
60
80
100
Wiek
0
0
10
wzrost
20
30
reprodukcja
40
50
Wiek
60
imobilizacja
70
80
90
dekontaminacja
Stężenie w pożywieniu = 4.0 jednostki
1.0
Stężenie
20 stężenie substancji toksycznej
0.8
0.6
pula akytwna
10
pula pasywna
0
Wielkość
Prawdopodobieństwo przeżycia
Gdy substancja jest silnie toksyczna koszty
detoksykacji mogą być wysokie
0.4
krzywa wzrostu
300
200
100
0.2
0
0
20
40
60
Wiek
80
100
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Wiek
wzrost
reprodukcja
imobilizacja
dekontaminacja
Czy detoksykacja jest faktycznie kosztowna?
Na poziomie subkomórkowym u osobników eksponowanych na substancje
toksyczne obserwuje się spadek zawartości nukleotydów adenylowych
oraz tzw. ładunku energetycznego nukleotydów (AEC).
2
ATP + ADP + AMP
1,0
10
AEC
nukleotydy
9
0,9
8
0,8
7
*
*
F. polyctena
F. aquilonia
0,7
0,6
6
F. polyctena
5
AEC
nukleotydy adenylowe ( mM . g-1masy ciała)
AEC =
ATP + ADP
F. aquilonia
kontrola
Cd
0,5
Czy energetyczne koszty detoksykacji są
znaczące dla organizmu?
tempo respiracji (ml CO2 h-1 )
Tempo respiracji u wijów
(Lithobius mutabilis)
poddanych działaniu
pestycydu (dimetoat)
stężenie dimetoatu w glebie (mg kg-1)
Przesłanki wskazują, że koszty detoksykacji mogą być
istotne i mogą decydować o przeżywalności organizmów.
-1
Konsumpcja (mg dzień )
W skażonym środowisku może też być
mniej dostępnej energii
Wyniki doświadczenia nad ślimakami
Helix aspersa karmionymi pożywieniem
skażonym metalami ciężkimi
12
Cynk
10
8
6
4
2
0
0
20
100 500 2500 12500
-1
-1
15
Konsumpcja (mg dzień )
-1
Konsumpcja (mg dzień )
Stężenie w pożywce (mg kg )
Miedź
12
9
6
3
0
0
2
10
50
250 1250
-1
Stężenie w pożywce (mg kg )
13
Ołów
11
9
7
5
3
0
20
100 500 2500 12500
-1
Stężenie w pożywce (mg kg )
Życie wymaga kompromisów; także przy „decyzji”, jak
wiele energii przeznaczać na detoksykację
1
1
Prawdopodobieństwo
przeżycia
Produkcja
rMAX
0
0
0
Inwestycje w detoksykację
1
Biomarkery zatrucia organizmu
• Biomarker: „każda odpowiedź biologiczna na
obecność substancji toksycznej w
środowisku, na poziomie osobnika lub
niższym, wykazująca odchylenie od normy”
• Rodzaje biomarkerów:
–
–
–
–
–
biochemiczne
fizjologiczne
histologiczne
morfologiczne
behawioralne
Przykłady biomarkerów
Poziom
organizacji
Przykłady biomarkerów
Biochemia
hamowanie AChE; indukcja monooksygenaz;
indukcja metalotionein; indukcja hsp; AEC
Fizjologia
zmniejszenie grubości skorupy jaja; maskulinizacja
(„imposex”); feminizacja embrionów
Tkanki
patologiczne zmiany w tkankach (nerkach,
wątrobie i in.)
Osobnik
Morfologia: asymetria fluktuująca; tempo wzrostu
Behawior: spadek konsumpcji; utrata orientacji;
wzrost lub spadek aktywności lokomotorycznej
Ładunek energetyczny adenylatów (AEC)
Związek biomarkerów z cechami historii życiowej
0,75
0,74
0,73
0,72
0,71
0,70
30
R2 = 0.796
35
40
45
50
Śmiertelność
AEC koreluje ujemnie ze
śmiertelnością larw much domowej (Musca domestica)
Przykład zmian histopatologicznych pod
wpływem kadmu: wątroba szczura
Wątroba szczura kontrolnego (x300)
Brzóska i in. 2003. Liver and kidney functions
and histology in rats exposed to cadmium and
ethanol. Alcohol and Alcoholism, 38: 2-10.
Wątroba szczura eksponowanego
na kadm (x300); cytoplazma
gąbczasta, wypełniona wakuolami,
chromatyna jądrowa bardziej
zwarta, nekrozy pojedynczych
hepatocytów
Wpływ substancji na jakie cechy
powinniśmy zatem mierzyć?
• To zależy od pytania:
– jeśli zależy nam na wykryciu efektów „za
wszelką cenę” najwrażliwsze cechy historii
życiowej lub biomarkery
– jeśli zależy nam na precyzyjnej ocenie
skutków na poziomie populacji miary
dynamiki populacji (r, λ, K)
– jeśli celem jest ochrona populacji przed
wyginięciem prawdopodobieństwo
ekstynkcji i czas do ekstynkcji
Które cechy historii życia lub biomarkery
są najwrażliwsze na substancje toksyczne?
Gatunek
LC50 (14 dni)
EC50 (prod.
kokonów)
EC50 (NRR)
Eisenia fetida
3172
mg Zn kg-1
1898
Lumbricus
terrestris
Lumbricus
rubellus
Aporrectodea
caliginosa
2378
1029
542
1734
599
168
1695
442
252
>2000
Spurgeon i in. 2000. Relative sensitivity of life-cycle and biomarker responses in four
earthworm species exposed to zinc. Environmental Toxicology and Chemistry, 19: 1800-1808.
Wpływ Keponu na poszczególne cechy historii życiowej Eurytemora
affinis przy wzrastających stężeniach substancji w wodzie; w wierszach
opisano zmiany wartości cech dla kolejnych stężeń w stosunku do ich
wartości przy poprzednim stężeniu, np. przy podwyższeniu stężenia z 0
do 5 µg dm-3, z 5 do 10 µg dm-3 itd. (wg Allana i Danielsa, 1982).
Wartości LC50 na podstawie testu 48 h, parametry populacyjne – 21 dni.
Wzrost
stężenia
(µg dm-3)
05
5 10
Wpływ na r
%
LC50
12,5
25
Przeżywalność
brak
brak
10 15 37,5
redukcja
15 20 50
niewielka
redukcja
redukcja
20 25 62,5
Wiek
reprodukcyjny
Wielkość
miotu
brak
niewielkie
opóźnienie
opóźnienie
brak
znaczna
redukcja
brak
opóźnienie
znaczna
redukcja
brak
brak
Liczba
miotów
brak
brak
znaczna
redukcja
znaczna
redukcja
znaczna
redukcja
Gdy chcemy dowiedzieć się o wpływie
zanieczyszczeń na populację, lepiej
stosować miary dynamiki populacji
n
R0 = ∑ l x mx
− rx
1 = ∑ e l x mx
x =0
Nt
ln
N0
ri =
∆t
λ - dominująca wartość
własna macierzy
Lesliego
K – pojemność środowiskowa
Wpływ substancji toksycznych na populacje:
wzrost wykładniczy (zmiana r)
Wpływ substancji toksycznych na populacje:
wzrost logistyczny (zmiana K)
K(tox)
Opanowane terminy:
• LD50 – Lethal Dose for 50% individuals = dawka
śmiertelna dla 50% osobników;
• LC50 – Lethal Concentration for 50% individuals =
stężenie śmiertelne dla 50% osobników;
• EC50 – 50% Effect Concentration = stężenie
powodujące 50% efekt w mierzonej zmiennej (np.
spadek płodności lub długości życia o 50% itp.);
• NOEC – No Observed Effect Concentration = najwyższe
stężenie, przy którym nie obserwuje się istotnych
efektów działania substancji toksycznej;
• LOEC – Lowest Observed Effect Concentration =
najniższe stężenie, przy którym pojawia się istotny efekt
działania substancji toksycznej.