Æwiczenie 3 - oczyszczanie bia³ek

Ćwiczenie 3
ANALIZA I OCZYSZCZANIE BIAŁEK
Część doświadczalna obejmuje:
- rozdział białek zawartych w surowicy krwi metodą elektroforezy w Ŝelu agarozowym
- rozdział hemoglobiny od chromianu potasu metodą sączenia Ŝelowego na kolumnie
Sephadex G-15 (odsalanie hemoglobiny)
WPROWADZENIE
Poznanie funkcji określonego białka wymaga jego wyizolowania i oczyszczenia (oddzielenia)
od tysięcy innych białek obecnych w badanych ekstraktach komórkowych lub tkankowych. Białko
moŜna oddzielić od innych cząsteczek, w tym równieŜ od innych białek, wykorzystując róŜnice w:
rozpuszczalności, wielkości cząsteczek, w wielkości ładunku, a takŜe róŜnic w powinowactwie
do specyficznych grup chemicznych. RóŜnice między poszczególnymi białkami w ich rozpuszczalności wykorzystywane są w metodzie frakcjonowania białek poprzez wysalanie lub wytrącanie na skutek obniŜania stałej dielektrycznej roztworu. Białka zawierające małe cząsteczki (np.
siarczan amonu uŜywany do wysalania) moŜna oddzielić metodą dializy przez błonę półprzepuszczalną (np. błona celulozowa) bądź metodą filtracji Ŝelowej. Chromatografia metodą filtracji Ŝelowej umoŜliwia rozdział cząsteczek róŜniących się wielkością. Powszechnie stosowanymi Ŝelami są
preparaty handlowe takie jak: Sephadex, Sepharose czy Biogel. Sephadex produkuje się z naturalnego dekstranu wytwarzanego przez Leuconostoc mesenteroides (paciorkowce heterofermentatywne; fakultatywne anaeroby). Ten wielkocząsteczkowy glikan zawiera 90-95% wiązań α-1-6 glikozydowych, a pozostałe wiązania są typu 1-3 (Ryc. 1). RóŜne rodzaje Sephadex uzyskuje się z dekstranu o róŜnej masie cząsteczkowej, który dodatkowo sieciuje się w reakcji z epichlorohydryną.
Liczba wytworzonych mostków określa rozmiary oczek w utworzonej w ten sposób sieci. Im więcej
poprzecznych mostków znajduje się w sieci, tym mniejsze są jej oczka. W ten sposób produkuje się
serię Ŝeli Sephadex o róŜnych liczbach G róŜniących się rozmiarami oczek, umoŜliwiających
frakcjonowanie i rozdział analizowanych związków w szerokim zakresie mas cząsteczkowych
(Tabela I) . śelem o najmniejszych oczkach jest Sephadex G-10, natomiast o największych G-200.
Do oddzielenia związków o małej masie cząsteczkowej od wielkocząsteczkowych białek najlepiej
nadają się kolumny Sephadex G-10 lub G-15, natomiast do rozdziału białek róŜniących się wielko-
1
ścią – kolumny Sephadex G-50 do G-200 (Ryc. 2). Na ryc. 2 pokazano zasadę rozdziału substancji
róŜniących się wielkością cząsteczek na kolumnie Sephadex.
Ryc. 1. Fragment struktury Ŝelu Sephadex (widoczne są wiązania α-1-6 glikozydowe oraz mostki
powstałe w reakcji z epichlorohydryną) (Kłyszejko- Stefanowicz 2005)
Tabela I. Charakterystyka Ŝeli Sephadex G (Kłyszejko-Stefanowicz 2005)
2
Ryc. 2. Rozdział cząsteczek o róŜnej wielkości na kolumnie Sephadex (Koolman, Röhm 2005)
Chromatografia jonowymienna wykorzystuje róŜnice w ładunkach wypadkowych poszczególnych białek. Białka, które w określonym pH będą naładowane ujemnie moŜna rozdzielać na anionitach np. na dietyloaminoetylocelulozie (DEAE-celuloza), białka naładowane dodatnio moŜna rozdzielać na kationitach np. karboksymetylocelulozie (CM-celuloza). W chromatografii powinowac-
3
twa wykorzystuje się powinowactwo wielu białek do specyficznych grup chemicznych. W ten sposób moŜna związać określone białko enzymatyczne do nośnika chromatograficznego, do którego
wcześniej został sprzęgnięty substrat, analog substratu bądź specyficzny inhibitor tego enzymu.
Białka regulujące ekspresję genów moŜna związać do odpowiedniej sekwencji nukleotydowej DNA
unieruchomionej na nośniku chromatograficznym itd. Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) wykorzystuje materiały wypełniające kolumnę o znacznie większym rozdrobnieniu niŜ w klasycznych chromatografiach cieczowych i dlatego aby uzyskać odpowiednią szybkość
przepływu konieczne jest zastosowanie zwiększonego ciśnienia.
Powszechną metodą rozdziału białek jest elektroforeza w róŜnych nośnikach. Cząsteczka obdarzona ładunkiem wypadkowym porusza się w polu elektrycznym, a szybkość jej wędrówki (v)
zaleŜy od natęŜenia pola elektrycznego (E), od wypadkowego ładunku cząsteczki białka (z) i
współczynnika tarcia (f).
v = Ez/f
Współczynnik tarcia zaleŜy od wielkości i kształtu cząsteczki migrującej oraz od lepkości środowiska.
Rozdział elektroforetyczny prowadzi się prawie zawsze w Ŝelu lub na bibule. Dawniej jako nośników, oprócz bibuły chromatograficznej, uŜywano takŜe Ŝelowanej skrobi oraz folii z octanu celulozy; obecnie poza octanem celulozy powszechnie uŜywa się Ŝeli agarozowych i poliakryloamidowych, umoŜliwiających najwyŜszą rozdzielczość.
Agaroza jako antykonwekcyjny nośnik do elektroforezy została zaproponowana przez Hjertena w 1961 r. Od
tego czasu jest niezastąpionym nośnikiem, zwłaszcza do róŜnego typu immunoelektroforez, a takŜe do rozdziału i analiz kwasów nukleinowych. Rozdziały elektroforetyczne tych biopolimerów w agarozie moŜna wykonywać zarówno na skalę analityczną jak i preparatywną.
Agaroza jest polisacharydem (główny składnik agaru) zbudowanym z powtarzających się reszt β-Dgalaktopiranozy i 3,6-anhydro-α-L-galaktopiranozy połączonych wiązaniami 1-3 oraz 1-4. Ryc. 3 przedstawia powtarzającą się podjednostkę agarozy
O
HO
CH2OH
O
O
O
O
HO
HO
O
Ryc. 3. Budowa agarozy (powtarzający się fragment)
Obie reszty galaktozowe w agarozie mogą być w róŜnym stopniu podstawione grupami siarczanowymi, metoksylowymi, karboksylowymi i pirogronianowymi. Agaroza uŜywana do elektroforezy powinna charakteryzować się jak najniŜszą zawartością zjonizowanych grup (siarczanowych, karboksylowych), które otoczone
są dodatnio naładowanymi przeciwjonami. W polu elektrycznym ruchliwe przeciwjony, wraz z towarzyszącą
im otoczką, migrują w kierunku katody. Taki przepływ solwentu (nazywany elektroendoosmozą), zaleŜny jest
od liczby zjonizowanych grup w agarozie i zachodzi w kierunku przeciwnym niŜ wędrówka rozdzielanych
4
białek, wpływając niekorzystnie na jakość ich rozdziału. Wielkość elektroendosmozy jest wyznaczana na
podstawie wędrówki substancji nie posiadającej ładunku elektrycznego np. dekstranu i jest wyraŜana jako
względna ruchliwość elektroforetyczna (Mr) dekstranu w odniesieniu do ruchliwości elektroforetycznej albuminy. PoniewaŜ dekstran wędruje w kierunku przeciwnym do albuminy, wartość Mr ma znak ujemny. W
sprzedaŜy występują trzy podstawowe typy agarozy: o niskiej (Mr <0.02), średniej (Mr < 0.13) i wysokiej
(Mr > 0.25) elekroendosmozie. Do elektroforezy białek uŜywa się dwóch pierwszych typów agarozy. W stęŜeniach > 0.1% i w temperaturze niŜszej od 400 C agaroza zestala się, tworząc Ŝel. Po ogrzaniu do temperatury >900C, „topi się” przechodząc w postać zolu. Podczas ochładzania poszczególne łańcuchy polisacharydowe tworzą podwójne helisy, które następnie łączą się w pęczki i tworzą stabilny Ŝel o oczkach, których
wielkość uzaleŜniona jest od stęŜenia agarozy. Elektroforezę białek i kwasów nukleinowych wykonuje się
najczęściej w 1 – 2% Ŝelach agarozowych.
Warunki elektroforezy (pH i siłę jonową) dobiera się najczęściej tak, aby sumaryczny ładunek
elektryczny poszczególnych białek obecnych w próbie poddanej elektroforezie był ujemny i tak
Ŝeby róŜniły się one tylko wielkościami ładunku netto. W praktyce najczęściej stosuje się bufory
zasadowe, których pH jest wyŜsze od wartości pI najbardziej zasadowych białek. W tych warunkach wszystkie rozdzielane białka poruszają się w jednym kierunku (do anody) lecz z róŜną
szybkością, zaleŜną od stopnia jonizacji. NaleŜy dodać, Ŝe na jakość rozdziału wpływ ma równieŜ
rodzaj uŜytego buforu.
Po zakończeniu elektroforezy białka na elektroforegramie denaturuje się (utrwala) w mieszaninie kwasu octowego i metanolu (lub etanolu), wskutek czego białka stają się nierozpuszczalne.
Unieruchomione białka moŜna teraz wybarwiać. Do wybarwiania uŜywa się róŜnych barwników
oddziałujących jonowo z białkami (są to najczęściej barwniki sulfonowe, pochodne lub analogiczne
do stosowanych w przemyśle tekstylnym do barwienia wełny). Nadmiar niezwiązanego barwnika
odmywa się, a wybarwione elektroforegramy poddaje się analizie jakościowej lub ilościowej. PoniewaŜ ilość związanego barwnika jest proporcjonalna do zawartości białka w danym prąŜku, dlatego mierząc densytometrycznie intensywność zabarwienia poszczególnych pasm moŜna oznaczyć względne stęŜenie białek w rozdzielonych frakcjach (Tabela IIB). Metoda ta znajduje zastosowanie do analizy klinicznej białek surowicy krwi. Wzajemne proporcje białek surowicy krwi
utrzymują się w określonych granicach, a zmiany tych proporcji są charakterystyczne dla róŜnych
stanów patologicznych.
WYKONANIE
Elektroforetyczny rozdział białek zawartych w surowicy krwi z uŜyciem aparatu
i zestawu odczynników firmy Cormay (Gel protein 100)
1, Zestaw odczynników do elektroforezy firmy Cormay (Gel protein 100)
A, Płytki z agarozą (folie)
5
B, Bufor Tris-barbital (bufor weronalowy) – koncentrat. Do elektroforezy rozcieńczyć wodą destylowaną zawartość ampułki 76 ml do 100 ml. Trwałość roztworu roboczego – około dwa tygodnie w temp. pokojowej.
C, Koncentrat barwnika (Czerń amidowa 10 B). Przygotować roztwór roboczy przez rozcieńczenie wodą destylowaną 1 ampułki 100 ml koncentratu do 300 ml. Trwałość roztworu roboczegopowyŜej miesiąca w temp. pokojowej.
D, Roztwór odbarwiający- koncentrat. 10 ml koncentratu rozcieńczyć woda destylowaną do 1000
ml. Trwałość – 1 miesiąc w temp. pokojowej.
E, Utrwalacz (135 ml 96% etanolu, 30 ml stęŜ. kwasu octowego i 135 ml wody destylowanej.
Roztwór trwały około 3 miesiące w szczelnie zamkniętym naczyniu w temp. pokojowej.
2, Surowica krwi do analizy, rozcieńczona 7-krotnie, bezpośrednio przed uŜyciem, roboczym buforem
3, Zasilacz prądu stałego (do 150 V) i komora do elektroforezy Cormay S20.
Folia poliestrowa
z Ŝelem agarowym
(po stronie wewnętrznej)
Miejsce naniesienia
i kierunek wędrówki
rozdzielanych białek
anoda
Pokrywa komory
katoda
Zbiorniki z buforem
Ryc. 4. Schemat aparatu do elektroforezy firmy Cormay
Postępowanie:
1. Przygotowanie aparatury i prób do rozdziału
a, Ustawić poziomo komorę do elektroforezy i wlać po 150 ml buforu (B) do kaŜdego z naczyń
elektrodowych
b, Delikatnie wyjąć płytkę z agarozą z opakowania (nie dotykać powierzchni Ŝelu!) i połoŜyć na
bibule Ŝelem do góry. Wykonać tę czynność bezpośrednio przed naniesieniem próbek, tak by
uniknąć wysuszenia Ŝelu agarozowego
c, Osuszyć miejsce naniesienia próbek przez przyłoŜenie paska bibuły. Po kilku sekundach usunąć wilgotną bibułę
6
d, W osuszonym miejscu umieścić folię ze szczelinami (studzienkami) do nanoszenia próbek.
Dwie skrajne szczeliny powinny pokrywać się ze znakami orientacyjnymi na folii. Delikatnie
docisnąć folię do powierzchni Ŝelu
e, Nanieść po 5 µl rozcieńczonej surowicy do kaŜdej studzienki i pozostawić na kilka minut w
celu przedyfundowania białek do Ŝelu
e, Usunąć nadmiar surowicy przez przyłoŜenie paska bibuły. Zdjąć ostroŜnie bibułę i folię
g, Zgiąć delikatnie płytkę z agarozą i umieścić ją w komorze tak, aby końce były zanurzone w naczyniach elektrodowych, Ŝel był skierowany do dołu, a miejsca naniesienia znajdowały się
od strony katody (-)
2, Rozdział elektroforetyczny
a, Zamknąć komorę pokrywą i połączyć przewodami z zasilaczem
b, Włączyć zasilacz i prowadzić elektroforezę 20 – 30 minut przy napięciu 100 V
c, Po zakończeniu elektroforezy wyłączyć zasilacz, wyjąć płytkę i zanurzyć ją na 15 minut w
utrwalaczu w pozycji pionowej
d, Bardzo dokładnie wysuszyć płytkę suszarką fryzjerską lub w suszarce laboratoryjnej w 800 C
3, Wybarwianie elektroforegramów
a, Zanurzyć płytkę w barwniku na 10 minut, a następnie odbarwić w 2 – 3 kolejnych kąpielach w
odbarwiaczu (odczynnik firmy Cormay’a).
b, Odbarwioną płytkę wypłukać w wodzie destylowanej i wysuszyć.
Opracowanie wyników:
Dokonać oceny wizualnej rozdzielonych frakcji, przygotować dokumentację rozdziału (rysunek lub kserokopię płytki, opisać rozdzielone frakcje białkowe). Przy opracowywaniu wyników
naleŜy zwrócić uwagę, Ŝe kaŜda z wybarwionych frakcji zawiera po kilka białek, które nie róŜnią
się ruchliwością elektroforetyczną (patrz Tabela IIA). Wyniki te świadczą więc o tym, Ŝe białka
zawarte w poszczególnych frakcjach (albuminy, α1-, α2-, β- i γ-globuliny) mają podobne wartości
pI (Tabela II)
7
Tabela II. Białka osocza krwi (Koolman, Röhm 2005)
8
Usuwanie chromianu potasowego z roztworu hemoglobiny (odsalanie) metodą
sączenia Ŝelowego na kolumnie Sephadex G-15
W laboratoriach biochemicznych często zachodzi potrzeba oddzielenia od białek cząsteczek o
małej masie (soli) np. usuwanie siarczanu amonu po wysalaniu białek. Odsolić białka lub zmienić
ich środowisko moŜna na drodze dializy. Wielkość porów w stosowanej do tego celu błonie półprzepuszczalnej umoŜliwia przenikanie cząsteczek o małej masie, podczas gdy cząsteczki białka o
znacznie większej masie nie przenikają przez błonę (Rys. 5). Jednak dializa jest czasochłonna i
wymaga wielokrotnej wymiany roztworu dializacyjnego, dlatego obecnie moŜna ją z powodzeniem
zastąpić sączeniem Ŝelowym na kolumnie Sephadex G-10 lub G-15
Ryc. 5. Schemat dializy (Koolman, Röhm 2005)
WYKONANIE
Odczynniki i sprzęt:
- kolumna Sephadex G-15 w 0,9% roztworze NaCl
- 1% roztwór chromianu (VI) potasu (m.cz. 194 Da); roztwór hemoglobiny (m.cz. 67 000 Da) w
0,9% roztworze NaCl
- butla z tubusem
- probówki z zaznaczoną objętością 2 ml- 20 szt
- spektrofotometr
Postępowanie:
A, Przy zamkniętym wypływie kolumny nałoŜyć na jej górną, odsłoniętą powierzchnię 1 ml roztworu uzyskanego po zmieszaniu 0,5 ml 1% chromianu (VI) potasu z 0,5 ml roztworu hemoglobiny. Po naniesieniu próby otworzyć wylot kolumny i poczekać aŜ cała naniesiona próba wniknie do nośnika (Uwaga ! nie dopuścić do wniknięcia powietrz do nośnika (zapowietrzenia) kolumny). Zamknąć wylot kolumny i ostroŜnie nanieść około 3 ml roztworu do elucji, a następnie
9
podłączyć butlę z roztworem elucyjnym. Otworzyć wylot kolumny i zbierać do probówek frakcje o
objętości 2 ml (zebrać około 15 frakcji). Doświadczenie zakończyć po wypłynięciu z kolumny
chromianu (VI) potasu. Następnie kolumnę dokładnie przemyć roztworem 0,9% NaCl (dwiema
objętościami kolumny). Zmierzyć absorbancję poszczególnych frakcji przy długości fali λ = 410
nm (chromian (VI) potasu), a następnie przy 540 nm (hemoglobina) względem roztworu elucyjnego
W opracowaniu naleŜy zestawić uzyskane wyniki w tabeli oraz przedstawić graficznie wyniki rozdziału.
Zagadnienia do przygotowania:
- metody chromatograficzne stosowane w oczyszczaniu białek (chromatografia jonowymienna,
chromatografia adsorpcyjna, filtracja Ŝelowa, chromatografia powinowactwa, HPLC)
- elektroforeza i ogniskowanie izoelektryczne – metody rozdziału białek wykorzystujące
róŜnice w ich pI
- dializa i sączenie Ŝelowe (filtracja Ŝelowa) – zasada i zastosowanie
- oczyszczanie białka, jako niezbędny etap w poznawaniu jego sekwencji aminokwasowej, struktury przestrzennej, w ustalaniu jego funkcji, szukaniu kodującego go genu i szukaniu ewolucyjnego pokrewieństwa z innymi białkami
- oznaczanie sekwencji aminokwasowej białek metodą degradacji Edmana
Piśmiennictwo:
Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa, 2005
Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005
10