WPŁYW WYBRANYCH PYRETROIDÓW NA STĘŻENIE GRUP

Proceedings of ECOpole
Vol. 2, No. 2
2008
Anna KRZEPIŁKO1
WPŁYW WYBRANYCH PYRETROIDÓW
NA STĘśENIE GRUP TIOLOWYCH W EKSTRAKTACH
Z KOMÓREK DROśDśY Saccharomyces cerevisiae
EFFECT OF SELECTED PYRETHROIDS ON CONCENTRATION
OF THIOL GROUPS IN Saccharomyces cerevisiae YEAST CELL EXTRACTS
Streszczenie: Pyretroidy, zaliczane do insektycydów, są estrami alkoholi pierwszo- lub drugorzędowych,
zawierającymi przynajmniej jedno wiązanie podwójne i kwasu chryzantemowego [kwasu 3-(2,2-dimetylowinylo)2,2-dimetylocyklopropanokarboksylowego]. Typowy mechanizm działania pyretroidów polega na blokowaniu
kanałów jonowych w układzie nerwowym owadów. Związki te oddziałują niespecyficznie takŜe na inne
organizmy i powodują nieprawidłowe procesy metaboliczne, wpływają na aktywność róŜnych enzymów. Te
niespecyficzne skutki działania pyretroidów mogą być powiązane z generowaniem wolnych rodników. Celem
prezentowanej pracy było określenie zmian zawartości grup tiolowych w ekstraktach z komórek droŜdŜy
Saccharomyces cerevisiae. Komórki droŜdŜy hodowano na poŜywce YPG do fazy logarytmicznej lub
stacjonarnej, inkubowano z róŜnymi stęŜeniami pyretroidów: bifentryny, cypermetryny i deltametryny przez dwie
godziny. Następnie przygotowano ekstrakty z komórek droŜdŜy i oznaczono w nich zawartość grup tiolowych za
pomocą odczynnika Ellmana zawierającego DTNB. StęŜenie grup tiolowych wyraŜono w ekwiwalencie mM
GSH. Stwierdzono, Ŝe inkubacja komórek droŜdŜy z pyretroidami powoduje obniŜenie stęŜenia grup tiolowych
w ekstraktach. Następnie wykonano barwienie komórek droŜdŜy na obecność zredukowanego glutationu
barwnikiem fluorescencyjnym mBCl. Inkubacja komórek z pyretroidami powodowała zmniejszenie intensywności
fluorescencji, co sugeruje zmniejszenie stęŜenia zredukowanego glutationu. Uzyskane wyniki sugerują, Ŝe zmiany
stęŜenia grup tiolowych mogą być przydatnym markerem stresu oksydacyjnego w badaniach nad toksycznością
pyretroidów.
Słowa kluczowe: pyretroidy, droŜdŜe, grupy tiolowe
Pestycydy, w tym takŜe pyretroidy, wywołują w komórkach róŜnych organizmów
objawy typowe dla stresu oksydacyjnego, stąd teŜ często stosowanymi markerami
określającymi ich toksyczność są parametry charakterystyczne dla stresu oksydacyjnego,
jak poziom peroksydacji lipidów, aktywności katalazy, dysmutazy ponadtlenkowej,
peroksydazy glutationowej, stęŜenia róŜnych antyoksydantów [1]. Wielu autorów postuluje,
Ŝe pestycydy obok typowego dla siebie mechanizmu działania mogą oddziaływać
toksycznie na komórki poprzez generowanie wolnych rodników [2]. Wolne rodniki mogą
reagować ze wszystkimi typami molekuł występujących w komórce. Białka są szczególnie
naraŜone na reakcje wolnorodnikowe, które mogą powodować róŜne typy uszkodzeń:
modyfikacje reszt aminokwasowych, zmiany struktury grup prostetycznych, agregację lub
fragmentację molekuł. Jedną z charakterystycznych zmian świadczącą o stresie
oksydacyjnym jest utlenianie grup tiolowych białek [3]. W utrzymaniu grup tiolowych
białek w formie zredukowanej bierze udział glutation [4]. Grupa tiolowa glutationu
uczestniczy w reakcji detoksykacji podczas zatrucia komórek związkami elektrofilowymi
[5]. Takimi związkami jest wiele pestycydów, w tym takŜe pyretroidy. Pyretroidy są
estrami alkoholi pierwszo- lub drugorzędowych (zawierających przynajmniej jedno
wiązanie podwójne) i kwasu chryzantemowego [kwasu 3-(2,2-dimetylowinylo)-2,21
Wydział Nauk Rolniczych w Zamościu, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, ul. Szczebrzeska 102,
22-400 Zamość, tel. 084 677 27 24, email: [email protected]
452
Anna Krzepiłko
dimetylocyklopropanokarboksylowego] lub halogenowych analogów tego kwasu [6].
Podstawowy mechanizm ich działania polega na blokowaniu kanałów przewodnictwa
jonowego w komórkach nerwowych, co prowadzi do śmierci owadów [7]. Jednak związki
te, podobnie jak i inne ksenobiotyki, mogą wpływać na procesy metaboliczne
w komórkach, a jednym z opisywanych w literaturze mechanizmów ich niespecyficznego
działania jest generowanie wolnych rodników. Celem prezentowanej pracy było określenie
zmian zawartości grup tiolowych w białkach ekstraktu z komórek droŜdŜy Saccharomyces
cerevisiae inkubowanych z róŜnymi stęŜeniami pyretroidów.
Materiał i metody
Organizmem modelowym w przeprowadzonych doświadczeniach był dziki szczep
droŜdŜy SP4 o genotypie alfa leu 1 arg 4 [8]. Hodowle droŜdŜy prowadzono na poŜywce
płynnej YPG. Do logarytmicznej lub stacjonarnej hodowli droŜdŜy dodawano roztworów
pyretroidów i inkubowano przez 2 godziny. Następnie przygotowano ekstrakty z komórek
droŜdŜy [8]. W otrzymanych ekstraktach oznaczono stęŜenie białka [9] i stęŜenie grup
tiolowych [3]. Zredukowany glutation w pojedynczych komórkach wykrywano metodą
barwienia za pomocą mBCL [10, 11]. Pyretroidy uŜyte w doświadczeniach zakupiono
w Instytucie Przemysłu Organicznego (Warszawa).
Wyniki
W prezentowanej pracy zastosowano metodę fluorescencyjnego barwienia komórek za
pomocą monochlorobimanu (tab. 1), aby stwierdzić, czy pod wpływem pyretroidów
zachodzą zmiany stęŜenia zredukowanego glutationu. Oceniono jasność fluorescencji
komórek droŜdŜy inkubowanych z róŜnymi stęŜeniami pyretroidów, a następnie
wybarwionych mBCL. Stwierdzono, Ŝe fluorescencja komórek kontrolnych z hodowli
stacjonarnej jest intensywniejsza niŜ z hodowli logarytmicznej. Inkubacja komórek
z wybranymi pyretroidami: bifentryną, cypermetryną i deltametryną o stęŜeniach 10, 40,
50 µg·cm–3 powodowała obniŜenie intensywności fluorescencji zarówno w komórkach
z hodowli logarytmicznej, jak i stacjonarnej. Jedynie przy stęŜeniu 10 µg·cm–3
zaobserwowano róŜnice intensywności fluorescencji pomiędzy komórkami z róŜnych faz
hodowli. Komórki z hodowli logarytmicznej fluoryzowały bardzo słabo, podczas gdy
w hodowli stacjonarnej moŜna było zaobserwować intensywniejszą fluorescencję. Przy
większych stęŜeniach pyretridów (40; 50 µg·cm–3) obserwowano bardzo słabą fluorescencję
komórek w obu fazach hodowli. Barwienie komórek droŜdŜy tym fluorescencyjnym
barwnikiem pozwoliło na stwierdzenie, Ŝe w komórkach pod wpływem pyretroidów
nastąpiło obniŜenie stęŜenia GSH, poniewaŜ natęŜenie fluorescencji jest proporcjonalne do
stęŜenia zredukowanego glutationu w komórce [11].
Następnie oznaczono stęŜenie grup tiolowych w ekstraktach z komórek droŜdŜy
(tab. 2). W ekstrakcie z komórek droŜdŜy w stacjonarnej fazie wzrostu średnie stęŜenie
grup tiolowych wyraŜone zostało w mMGSH, wynosiło 0,67 mM·mg–1 białka i było około
1,24 razy większe niŜ z hodowli logarytmicznej. Inkubacja komórek z pyretroidem
powodowała obniŜenie stęŜenia grup tiolowych w ekstraktach, zarówno w logarytmicznej,
jak i stacjonarnej fazie wzrostu.
Pyretroidy silniej zmniejszały stęŜenie grup –SH w ekstraktach pochodzących
z komórek z hodowli logarytmicznej. Inkubacja logarytmicznej hodowli droŜdŜy
Wpływ wybranych pyretroidów na stęŜenie grup tiolowych w ekstraktach z komórek droŜdŜy …
453
z pyretroidami o stęŜeniu 50 µg·cm–3 powodowała obniŜenie badanego parametru do około
45% wartości kontrolnej w przypadku bifentryny, 49% dla cypermetryny i 52% dla
deltametryny. Natomiast w hodowli stacjonarnej to samo stęŜenie pyretroidu powodowało
obniŜenie stęŜenia grup tiolowych do około 82% dla bifentryny, dla 69% cypermetryny
i 62% dla deltametryny w porównaniu z kontrolą.
Komórki droŜdŜy są znacznie bardziej wraŜliwe na działanie pyretroidów
w logarytmicznej fazie wzrostu, przypuszczalnie dlatego, Ŝe aktywność systemu
antyoksydacyjnego jest mniejsza niŜ w fazie stacjonarnej [13]. Pyretroidy powodują
obniŜenie aktywności katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej w komórkach S. cerevisiae
[14], co sugeruje, Ŝe mogą one powodować stres oksydacyjny. Uzyskane w tej pracy
wyniki sugerują, Ŝe zmiany stęŜenia grup tiolowych mogą być przydatnym markerem
stresu oksydacyjnego w badaniach nad toksycznością pyretroidów.
Tabela 1
Oznaczanie wewnątrzkomórkowego stęŜenia GSH metodą barwienia monochlorobimanem
Table 1
Cellular GSH determination by staining method’s using monochlorobimane
Intensywność fluorescencji komórek
hodowla logarytmiczna kontrola
wyraźna
hodowla stacjonarna kontrola
intensywna
stęŜenie
Bifentryna
Cypermetryna
Deltametryna
pyretroidu
hodowla
hodowla
hodowla
hodowla
hodowla
hodowla
[µg·cm–3]
logarytmiczna
stacjonarna
logarytmiczna
stacjonarna
logarytmiczna
stacjonarna
10
bardzo słaba
słaba
słaba
słaba
bardzo słaba
słaba
bardzo
40
bardzo słaba
bardzo słaba
bardzo słaba
bardzo słaba
bardzo słaba
słaba
bardzo
50
bardzo słaba
bardzo słaba
bardzo słaba
bardzo słaba
bardzo słaba
słaba
Tabela 2
Pomiar stęŜenia grup tiolowych w ekstraktach z komórek droŜdŜy inkubowanych z róŜnymi stęŜeniami
pyretroidów
Table 2
Concentration of thiol groups in extracts from yeast cells incubated with various concentrations of pyrethroids
StęŜenie grup –SH w ekstrakcie z komórek droŜdŜy [mM GSH ·cm–3 białka]
kontrola hodowla logarytmiczna
0,54
kontrola hodowla stacjonarna
0,67
stęŜenie
Bifentryna
Cypermetryna
Deltametryna
pyretroidu
hodowla
hodowla
hodowla
hodowla
hodowla
hodowla
logarytmiczna
stacjonarna
logarytmiczna
stacjonarna
logarytmiczna
stacjonarna
[µg·cm–3]
10
0,36
0,65
0,50
0,67
0,45
0,65
20
0,31
0,64
0,37
0,65
0,44
0,57
40
0,25
0,56
0,33
0,57
0,29
0,52
50
0,24
0,55
0,26
0,46
0,28
0,42
Podziękowania
Praca finansowana ze środków budŜetowych na naukę w latach 2005-2008 jako
projekt badawczy nr 2 P06T 09128.
454
Anna Krzepiłko
Literatura
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
Banerjee B.D., Seth V. i Ahmed R.S.: Environ. Health, 2001, 16(1), 1-40.
Giray B., Gurbay A. i Hincal F.: Toxicol. Lett., 2001, 118(3), 139-146.
Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. WN PWN, Warszawa 2003.
Penninckx M.: Enzyme Mikrob. Technol., 2000, 26, 737-742.
Penninckx M.: FEMS Yeast Res., 2002, 2(3), 295-305.
RóŜański L.: Vademecum pestycydów. Agra-Enviro Lab., Poznań 1996.
Gabbianelli R., Falcioni G., Nasuti C. i Cantalamessa F.: Toxicology, 2002, 175, 91-101.
Biliński T., Krawiec Z., Liczmański A. i Litwińska J.: Biochem. Biophys. Res. Commun, 1985, 130(2),
533-539.
Lowry O.H., Rosebrough W.J., Farr A.L. i Randall R.J.: J. Biol. Chem., 1951, 193, 265-275.
Oksvold M.P., Skarpen E., Widerberg J. i Huitfeldt H.S.: J. Histochem. Cytochem., 2002, 50(3), 289-303.
Ublacker G. A., Johnson J.A., Siegel F.L. i Mulcahy R.T.: Cancer Res., 1991, 51(7), 1783-1788.
Fortuniak A., Zadzinski R., Bilinski T. i Bartosz G.: Biochem. Mol. Biol. Int., 1996, 38(5), 901-910.
Jakubowski W., Bilinski T. i Bartosz G.: Free Radic. Biol. Med., 2000, 28(5), 659-664.
Krzepiłko A.: Ecol. Chem. Eng., 2007, 14(2), 191-196.
EFFECT OF SELECTED PYRETHROIDS ON CONCENTRATION
OF THIOL GROUPS IN Saccharomyces cerevisiae YEAST CELL EXTRACTS
Summary: Pyrethroids are esters of primary or secondary alcohols containing at least one double bond and
chrysanthemic acid (2,2-dimethyl-3-(2-methylpropenyl)-cyclopropanecarboxylic acid). Pyrethroids are
insecticides whose typical mechanism of action is the blocking of ion channels in the nervous system of insects.
These compounds also have non-specific effects on other organisms. They cause abnormal metabolic processes,
affect the activity of various enzymes and can have genotoxic effects. These non-specific effects of pyrethroids
may involve free radical generation. The aim of this study was to assess changes in the content of thiol groups in
Saccharomyces cerevisiae yeast cell extracts. The cells were cultivated on YPG medium to the logarithmic or
stationery phase and incubated for two hours with various concentrations of the pyrethroids bifenthrin,
cypermethrin and deltamethrin. Then extracts were prepared from the yeast cells and their thiol group content was
determined using Ellman's reagent (DTNB). Concentration of thiol groups was expressed as mM of GSH
equivalent. It was found that incubating yeast cells with pyrethroids caused a reduction in concentration of thiol
groups in the extracts. Subsequently the yeast cells were stained to test for the presence of reduced glutathione
using the fluorescent stain mBCl. Incubating the cells with pyrethroids caused a decrease in fluorescence intensity,
which suggests a decreased concentration of reduced glutathione. The results obtained suggest that changes in
concentration of thiol groups can be a useful oxidative stress marker in studies on pyrethroid toxicity
Keywords: pyrethroids, yeast, thiol group