REDUKTAZA GLUTATIONOWA

REDUKTAZA
GLUTATIONOWA
ZESTAW ODCZYNNIKÓW
TYLKO DO ZASTOSOWAŃ BADAWCZYCH
Składniki
Nr kat.
GR 2368 5 x 5 ml
1. Bufor
2. Substrat
3. NADPH
1x
5x
5x
70 ml
5 ml
3 ml
ZNACZENIE KLINICZNE
Oznaczanie reduktazy glutationowej (Glutathione Reductase) znalazło zastosowanie przy wykrywaniu chorób wątroby i złośliwych zmian nowotworowych, oceny sposobu
Ŝywienia (stanu ryboflawiny - witaminy B2) i wykrywaniu
uwarunkowanych genetycznie stanów deficytów (deficjencji).
NB. NaleŜy zachować ostroŜność, aby mieć pewność, Ŝe
ujawnione stany niedoborów enzymatycznych nie są spowodowane ubytkiem ryboflawiny.
(1)
Zasada Oznaczenia
Reduktaza glutationowa jest katalizatorem redukcji glutationu (GSSG) w obecności NADPH, który ulega utlenieniu
+
i przemianie w NADP . Wielkością mierzoną jest zmniejszenie absorbancji dla światła o długości fali 340 nm.
+
NADPH + H + GSSG
GR
+
NADP + 2 GSH
(GSH = Zredukowany Glutation)
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Surowica krwi, osocze lub erytrocyty.
Przygotowanie erytrocytów.
Objętość 0.5 ml pełnej krwi odwirowywać przez 5 min przy
prędkości 2000 obr./min. Oddzielić osocze i koŜuszek
leukocytarny (buffy coat), zwracając uwagę na to, aby nie
usunąć zbyt wielu erytrocytów, co powodowałoby ryzyko
uzyskania próbki komórek, która nie byłaby reprezentatywna dla danego materiału. Trzykrotnie wypłukać erytrocyty
zawieszając je w 0.9% NaCl, odwirowując przez 5 min przy
prędkości 2000 obr./min po kaŜdym płukaniu.
Spowodować lizę komórek zawieszając je w zimnej
redestylowanej H20, tak aby objętość wynosiła 0.5 ml.
Odstawić na 10 min w miejsce o temperaturze od +2 do
+8°C. Lizat odwirowywać przez 5 min przy prędkości 2000
obr./min w celu usunięcia zrębu (stroma). Objętość 100 l
lizatu rozpuścić w 1.9 ml 0.9% roztworu NaCl w celu
przeprowadzenia oznaczenia.
1. Bufor
Fosforan potasu
EDTA
2. Substrat
GSSG
3. NADPH
StęŜenia w teście
250 mmol/l pH 7.3
0.5 mmol/l
2.2 mmol/l
0.17 mmol/l
Wymieszać i jednocześnie uruchomić czasomierz. Pomiar
początkowej absorbancji przeprowadzić po 1 minucie.
Pomiar powtórzyć ponownie po 2, 3, 4 i 5 minutach.
OBLICZENIA
Aktywność reduktazy glutationowej moŜe być obliczona
na podstawie wzoru podanego poniŜej:
U/l = 4983 x -A 340 nm/min
PROCEDURA DLA ERYTROCYTÓW
ŚRODKI OSTROśNOŚCI I OSTRZEśENIA
Tylko do prowadzenia badań diagnostycznych w warunkach in vitro. Nie pipetować przy uŜyciu ust. Zachować typowe środki ostroŜności obowiązujące przy kontakcie z odczynnikami stosowanymi w warunkach laboratoryjnych.
Długość fali światła:
Kuweta:
Temperatura:
Pomiar:
Na Ŝądanie dostępne są arkusze danych dotyczących
zdrowia i bezpieczeństwa Health and Safety Data Sheets.
Pipetować do kuwety
Odczynniki mogą być uŜywane tylko zgodnie z ich
przeznaczeniem, przez odpowiednio wykwalifikowany
personel laboratoryjny, w odpowiednich warunkach
laboratoryjnych.
STABILNOŚĆ I PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW
REAKCJI
1. Bufor
Zawartość gotowa do uŜycia. Zachowuje stabilność do
upływu daty waŜności, pod warunkiem, Ŝe jest przechowywany w temperaturze od +2 do +8°C.
2. Substrat
Zrekonstytuować zawartość jednej fiolki substratu 2 przy
uŜyciu 5 ml bufora 1. Zachowuje stabilność przez 2 dni,
pod warunkiem, Ŝe jest przechowywany w temperaturze
od +2 do +8°C.
3. NADPH
Zrekonstytuować jedną fiolkę NADPH 3 przy uŜyciu 3 ml
redestylowanej H20. Zachowuje stabilność przez 2 dni,
pod warunkiem, Ŝe jest przechowywany w temperaturze
od +2 do +8°C.
PROCEDURA DLA SUROWICY/OSOCZA
Długość fali:
Kuweta:
Temperatura:
Pomiar:
340 nm
droga światła 1 cm
37°C
względem powietrza
Pipetować do kuwety
Próbka
Substrat
40 l
1000 l
Dobrze wymieszać.
NADPH
200 l
340 nm
droga światła 1 cm
37ºC.
względem powietrza
40 µl
1000 µl
Rozcieńczony lizat
Substrat
Dobrze wymieszać
200 µl
NADPH
Wymieszać i jednocześnie uruchomić czasomierz. Pomiar
początkowej absorbancji przeprowadzić po 1 minucie.
Pomiar powtórzyć ponownie po 2, 3, 4 i 5 minutach.
OBLICZENIA
Aktywność reduktazy glutationowej moŜe być obliczona
na podstawie wzoru podanego poniŜej:
a)
b)
U/l pełnej krwi = 4983 x -A 340 nm/min x Współczynnik Rozcieńczenia (20)
Przeprowadzić konwersję do u/g Hemoglobiny
Przykład
Stwierdzono, Ŝe próbka zawiera hemoglobinę, której
poziom wynosi 16 g/dl lub 160 g/l.
Wartość reduktazy glutationowej: 1488 U/l.
Stąd wartość dla próbki =
1488
─── =
160
9.3 u/gHb
INSTRUKCJA - REDUKTAZA GLUTATIONOWA - GR 2368
Strona 2 / 2
KONTROLA JAKOŚCI
W celu uzyskania kontroli dokładności i powtarzalności:Zalecamy uŜycie kontrolnych surowic reduktazy
glutationowej Randox Glutathione Reductase Control
Sera GR 2608.
SPECYFICZNOŚĆ
Reduktaza Glutationowa wykazuje wysoką specyficzność
dla Glutationu (GSSG).
(2)
ZAKRES REFERENCYJNY
Osocze/Surowica 33 - 73 U/l
Erytrocyty
4.7 -13.2 U/gHb
Zaleca się, aby kaŜde laboratorium określiło swój własny
zakres prawidłowy, poniewaŜ mogą występować lokalne
róŜnice.
LINIOWOŚĆ
JeŜeli zmiana absorbancji na minutę przekracza 0.06 przy
długości fali światła 340 nm, wówczas 0.1 ml próbki naleŜy
rozcieńczyć przy uŜyciu 0.9 ml bufora 1.
Wynik pomnoŜyć przez 10.
CZUŁOŚĆ
Jako wartość progową wykrywania naleŜy przyjąć poziom
10 U/l.
LITERATURA
1. Goldberg D.M. & Spooner RJ (1983) w „Methods of
rd
Enzymatic Analysis” (Bergmeyen, H.V. Ed.) 3 edn. vol
3, pp 258-265, Verlog Chemie, Deerfield Beach, Fl.
2. Melissinos, K.G.,Delidov, A.Z., Varsov, A.G., Begietti,
S.S., Drivas, G.J., Nephron, 28: 76-79, (1981).
Wersja zweryfikowana 18/10/00AM
RANDOX Laboratories Ltd., Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom, BT29 4QY
Tel:CRUMLIN(028) 9442 2413 Telex:748135 RANDOX G Fax.No.INT.44 28 9445 2912 UK(028) 9445 2912
abcd abc