Reduktaza Glutationowa – ulotka informacyjna
Transkrypt
Reduktaza Glutationowa – ulotka informacyjna
REDUKTAZA GLUTATIONOWA ZESTAW ODCZYNNIKÓW TYLKO DO ZASTOSOWAŃ BADAWCZYCH Składniki Nr kat. GR 2368 5 x 5 ml 1. Bufor 2. Substrat 3. NADPH 1x 5x 5x 70 ml 5 ml 3 ml ZNACZENIE KLINICZNE Oznaczanie reduktazy glutationowej (Glutathione Reductase) znalazło zastosowanie przy wykrywaniu chorób wątroby i złośliwych zmian nowotworowych, oceny sposobu żywienia (stanu ryboflawiny - witaminy B2) i wykrywaniu uwarunkowanych genetycznie stanów deficytów (deficjencji). NB. Należy zachować ostrożność, aby mieć pewność, że ujawnione stany niedoborów enzymatycznych nie są spowodowane ubytkiem ryboflawiny. Zasada Oznaczenia(1) Reduktaza glutationowa jest katalizatorem redukcji glutationu (GSSG) w obecności NADPH, który ulega utlenieniu i przemianie w NADP+. Wielkością mierzoną jest zmniejszenie absorbancji dla światła o długości fali 340 nm. + NADPH + H + GSSG GR + NADP + 2 GSH (GSH = Zredukowany Glutation) PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Surowica krwi, osocze lub erytrocyty. Przygotowanie erytrocytów. Objętość 0.5 ml pełnej krwi odwirowywać przez 5 min przy prędkości 2000 obr./min. Oddzielić osocze i kożuszek leukocytarny (buffy coat), zwracając uwagę na to, aby nie usunąć zbyt wielu erytrocytów, co powodowałoby ryzyko uzyskania próbki komórek, która nie byłaby reprezentatywna dla danego materiału. Trzykrotnie wypłukać erytrocyty zawieszając je w 0.9% NaCl, odwirowując przez 5 min przy prędkości 2000 obr./min po każdym płukaniu. Spowodować lizę komórek zawieszając je w zimnej redestylowanej H20, tak aby objętość wynosiła 0.5 ml. Odstawić na 10 min w miejsce o temperaturze od +2 do +8°C. Lizat odwirowywać przez 5 min przy prędkości 2000 obr./min w celu usunięcia zrębu (stroma). Objętość 100 Τl lizatu rozpuścić w 1.9 ml 0.9% roztworu NaCl w celu przeprowadzenia oznaczenia. 1. Bufor Fosforan potasu EDTA 2. Substrat GSSG 3. NADPH Stężenia w teście 250 mmol/l pH 7.3 0.5 mmol/l 2.2 mmol/l 0.17 mmol/l ŚRODKI OSTROŻNOŚCI I OSTRZEŻENIA Tylko do prowadzenia badań diagnostycznych w warunkach in vitro. Nie pipetować przy użyciu ust. Zachować typowe środki ostrożności obowiązujące przy kontakcie z odczynnikami stosowanymi w warunkach laboratoryjnych. Na żądanie dostępne są arkusze danych dotyczących zdrowia i bezpieczeństwa Health and Safety Data Sheets. Odczynniki mogą być używane tylko zgodnie z ich przeznaczeniem, przez odpowiednio wykwalifikowany personel laboratoryjny, w odpowiednich warunkach laboratoryjnych. STABILNOŚĆ I PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW REAKCJI 1. Bufor Zawartość gotowa do użycia. Zachowuje stabilność do upływu daty ważności, pod warunkiem, że jest przechowywany w temperaturze od +2 do +8°C. 2. Substrat Zrekonstytuować zawartość jednej fiolki substratu 2 przy użyciu 5 ml bufora 1. Zachowuje stabilność przez 2 dni, pod warunkiem, że jest przechowywany w temperaturze od +2 do +8°C. 3. NADPH Zrekonstytuować jedną fiolkę NADPH 3 przy użyciu 3 ml redestylowanej H20. Zachowuje stabilność przez 2 dni, pod warunkiem, że jest przechowywany w temperaturze od +2 do +8°C. PROCEDURA DLA SUROWICY/OSOCZA Długość fali: Kuweta: Temperatura: Pomiar: 340 nm droga światła 1 cm 37°C względem powietrza Pipetować do kuwety Próbka Substrat Dobrze wymieszać. 200 Τl NADPH Wymieszać i jednocześnie uruchomić czasomierz. Pomiar początkowej absorbancji przeprowadzić po 1 minucie. Pomiar powtórzyć ponownie po 2, 3, 4 i 5 minutach. OBLICZENIA Aktywność reduktazy glutationowej może być obliczona na podstawie wzoru podanego poniżej: U/l = 4983 x -A 340 nm/min PROCEDURA DLA ERYTROCYTÓW Długość fali światła: Kuweta: Temperatura: Pomiar: Pipetować do kuwety 40 µl 1000 µl Rozcieńczony lizat Substrat Dobrze wymieszać 200 µl NADPH Wymieszać i jednocześnie uruchomić czasomierz. Pomiar początkowej absorbancji przeprowadzić po 1 minucie. Pomiar powtórzyć ponownie po 2, 3, 4 i 5 minutach. OBLICZENIA Aktywność reduktazy glutationowej może być obliczona na podstawie wzoru podanego poniżej: a) b) U/l pełnej krwi = 4983 x -A 340 nm/min x Współczyn-nik Rozcieńczenia (20) Przeprowadzić konwersję do u/g Hemoglobiny Przykład Stwierdzono, że próbka zawiera hemoglobinę, której poziom wynosi 16 g/dl lub 160 g/l. Wartość reduktazy glutationowej: 1488 U/l. Stąd wartość dla próbki = 40 Τl 1000 Τl 340 nm droga światła 1 cm 37ºC. względem powietrza 1488 ─── = 160 9.3 u/gHb INSTRUKCJA - REDUKTAZA GLUTATIONOWA - GR 2368 Strona 2 / 2 KONTROLA JAKOŚCI W celu uzyskania kontroli dokładności i powtarzalności:Zalecamy użycie kontrolnych surowic reduktazy glutationowej Randox Glutathione Reductase Control Sera GR 2608. SPECYFICZNOŚĆ Reduktaza Glutationowa wykazuje wysoką specyficzność dla Glutationu (GSSG). ZAKRES REFERENCYJNY (2) Osocze/Surowica 33 - 73 U/l Erytrocyty 4.7 -13.2 U/gHb Zaleca się, aby każde laboratorium określiło swój własny zakres prawidłowy, ponieważ mogą występować lokalne różnice. LINIOWOŚĆ Jeżeli zmiana absorbancji na minutę przekracza 0.06 przy długości fali światła 340 nm, wówczas 0.1 ml próbki należy rozcieńczyć przy użyciu 0.9 ml bufora 1. Wynik pomnożyć przez 10. CZUŁOŚĆ Jako wartość progową wykrywania należy przyjąć poziom 10 U/l. LITERATURA 1. Goldberg D.M. & Spooner RJ (1983) w „Methods of Enzymatic Analysis” (Bergmeyen, H.V. Ed.) 3rd edn. vol 3, pp 258-265, Verlog Chemie, Deerfield Beach, Fl. 2. Melissinos, K.G.,Delidov, A.Z., Varsov, A.G., Begietti, S.S., Drivas, G.J., Nephron, 28: 76-79, (1981). Wersja zweryfikowana 18/10/00AM RANDOX Laboratories Ltd., Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom, BT29 4QY Tel:CRUMLIN(028) 9442 2413 Telex:748135 RANDOX G Fax.No.INT.44 28 9445 2912 UK(028) 9445 2912 αβχδ αβχ