Total RNA FAST Purification KIT

Total RNA FAST Purification KIT
Total RNA FAST Purification KIT
Zestaw do izolacji całkowitego RNA z hodowli komórkowych, hodowli
bakteryjnych, tkanek roślinnych i tkanek zwierzęcych.
Zestaw zawiera:
Bufor do lizy - Lysis Buffer
Bufor do precypitacji - Precipitation Buffer
DEPC ddH2O
Zestaw nie zawiera:
izopropanolu 100%
etanolu 70%
Przed przystąpieniem do procedury:
 należy rozpuścić skrystalizowane bufory, poprzez zanurzenie probówek w gorącej
wodzie. Roztwory buforów muszą być klarowne.
 Izolacja RNA z tkanki roślinnej i tkanki zwierzęcej wymaga użycia: ciekłego azotu oraz
sterylnych narzędzi: moździerza, tłuczka, metalowej szpatułki i pincety.
 Materiał wykorzystywany do izolacji RNA, nie może być wielokrotnie zamrażany
i rozmrażany – powinien być to materiał natychmiast po zebraniu zamrożony
w (-20) °C – (-80) °C (np. tkanka zwierzęca, osad hodowli bakteryjnej, osad hodowli
komórkowej) lub w ciekłym azocie (tkanka roślinna).
 Zalecane ilości materiału do izolacji RNA w zależności od pochodzenia materiału:
RODZAJ MATERIAŁU
świeża hodowla bakteryjna
hodowla komórkowa
tkanka zwierzęca
tkanka roślinna
materiał liofilizowany
ILOŚĆ MATERIAŁU
~ 1 mL
~ 2 mln komórek
10 – 15 mg
5 – 10 mg
< 10 mg
1
:
 Izolacja RNA wymaga szczególnej staranności i powinna być przeprowadzona
z wykorzystaniem sterylnych narzędzi laboratoryjnych.
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
Uwagi
Total RNA FAST Purification KIT
Przygotowanie tkanki roślinnej i zwierzęcej do izolacji RNA
1. Wysterylizowane moździerze i tłuczki schłodzić ciekłym azotem. Do schłodzonego
i wypełnionego azotem moździerza przenieść zamrożoną tkankę roślinną lub
zwierzęcą.
2. Materiał ucierać w azocie, aż powstanie miałki materiał. Nie dopuścić, by materiał się
rozmroził.
3. Do opisanych, schłodzonych w azocie 1.5 mL probówek Eppendorf, przełożyć
schłodzoną szpatułką zhomogenizowany materiał – na tym etapie należy odważyć
materiał do izolacji.
4.
Probówki natychmiast zamrozić w ciekłym azocie.
Przygotowanie komórek bakteryjnych do izolacji RNA
1. Pobrać 1 mL zawiesiny bakteryjnej do 1.5 mL probówki Eppendorf.
2. Komórki bakteryjne zwirować w temp. pokojowej 3 min/5 000 x g. Dokładnie usunąć
supernatant (pożywkę bakteryjną).
3. Osad komórek bakteryjnych można wykorzystać bezpośrednio do izolacji RNA lub
natychmiast zamrozić w – 20 °C.
2. Zamrożony materiał należy delikatnie rozmrozić pozostawiając probówki w temp.
pokojowej przez 1 min.
3. Następnie dodać 600 µl Lysis Buffer i dokładnie zworteksować zawartość probówki.
4. Następnie dodać 200 µl Precipitation Buffer i odwracać probówki 10 razy do góry
dnem. Inkubować przez 5 min w – 20 °C (nie należy wydłużać czasu inkubacji).
5. Probówki wirować w temperaturze pokojowej przez 5 min/20 000 x g.
6. Ostrożnie przenieść supernatant w objętości ok. 600 µl do nowych probówek i dodać
600 µl izopropanolu (w stosunku objętościowym 1:1). Inkubować w temp. pokojowej
przez 5 min w celu wytrącenia DNA.
7. Zwirować probówki w temp. pokojowej przez 5 min/500 x g (wówczas w osadzie
pozostanie DNA).
2
:
1. W celu izolacji RNA przygotować odpowiednią ilość materiału w oddzielnych
probówkach.
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
Protokół izolacji całkowitego RNA
Total RNA FAST Purification KIT
8. Nie naruszając osadu, przenieść supernatant do nowych probówek i inkubować przez
minimum 30 min w - 20 °C, aby wytrącić RNA (na tym etapie można próby zamrozić).
9. Po wskazanym czasie probówki wirować w temp. + 4 °C przez 10 min/20 000 x g.
Ostrożnie usunąć supernatant.
10. Pozostały osad zawierający RNA przemyć, dodając 1 mL etanolu 70% (zmrożony).
Próby wirować w temp. + 4 °C przez 3 min/20 000 x g.
Uwaga! Jeśli próby były mrożone, na tym etapie mogą wytrącić się sole. Wówczas próby
należy podgrzać do temp. pokojowej.
11. Ponownie odrzucić supernatant. Probówki można ponownie zwirować
przez 1 min/20 000 x g i dokładnie usunąć pozostałości etanolu. Osad suszyć przez
5 min przy probówkach otwartych w temp. pokojowej.
12. Osad rozpuścić przez worteksowanie w 30 µl DEPC ddH2O. Natychmiast po
rozpuszczeniu osadu RNA umieścić probówki w lodzie.
13. Zmierzyć spektrofotometrycznie zawartość i czystość wyizolowanego RNA, po czym
zamrozić próby RNA w - 80 ºC.
W sytuacji gdy preparat RNA jest zanieczyszczony genomowym DNA należy
przeprowadzić trawienie DNazą I. Poniżej przedstawiamy zalecany protokół reakcji.
1.
Do sterylnej, wolnej od RNaz probówki dodać:
total RNA
10-15 µg
Bufor reakcyjny 10x
5.0 µl
DNaza I [1 U/µl]
2.5 µl (2.5 U)
DEPC ddH2O
do 50 µl
2. Inkubować w 37 °C przez 20 min.
3. Dodać 8 µl 50 mM EDTA i inkubować w 75 °C przez 10 min.
4. Schłodzić do 4 °C.
3
:
Protokół oczyszczania RNA DNazą I
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
14. Do reakcji odwrotnej transkrypcji należy pobierać 5 µg RNA.
Warunki przechowywania: +4 0C
Krystalizacja odczynników jest procesem naturalnym. Zalecamy rozpuszczanie skrystalizowanych składników buforów
w gorącej wodzie, przed przystąpieniem do procedury.
Zalecamy również zabezpieczanie parafilmem butelek z buforami po każdej izolacji.
UWAGA! Pewne składniki buforów mogą działać silnie drażniąco. Podczas pracy ze wszystkimi związkami chemicznymi należy
przestrzegać ogólnie obowiązujących przepisów BHP. Ten produkt został zaprojektowany i wykonany wyłącznie do celów
badawczych. Nie został przetestowany w kierunku zastosowania do celów diagnostycznych i do bezpośredniej produkcji leków
oraz do celów związanych z produkcją leków.
4
:
__________________________________________________________________________________________________________________________
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
Total RNA FAST Purification KIT