Syngen Plasmid Maxi SPIN Kit

Syngen Plasmid Maxi SPIN Kit
Wydajność:
wielkość próbki - do 60 ml hodowli w LB (nie stosować więcej bakterii niż dozwolono)
zdolność wiązania w martycy - do 500 μg
Co potrzeba:
1. probówki 50 ml do wirowania przy 6.000 x g
2. izopropanol
3. 70% etanol
4. 100% etanol
5. 3M octan potasu lub sodu (pH 5.2)
6. przygotuj bufor PP1 dodając do 33/66 ml koncentratu PP1 12/24 ml 100% etanolu
7. dodj RNazę A do buforu PSZ, po dodaniu przechowuj w +4°C
Procedura:
1. Zwiruj hodowlę przez 10 minut w 5000 x g.
2. Dodaj 5 ml buforu PSZ (z dodaną RNazą A i zawieś pellet na worteksie lub pipetując.
3. Dodaj 5 ml buforu PSL i odwróć probówkę 10 razy do góry dnem. Nie worteksuj!
4. Inkubuj 5 minut na stole, aż do sklarowania lizatu. Nie przekraczaj 5 minut.
5. Dodaj 6 ml buforu PSN i natychmiast ale delikatnie odwróć probówkę 10 razy do góry dnem. Nie
worteksuj!
6. Umieść filtr bez tłoczka w falkonce 50 ml.
7. Wlej cały lizat do filtra i odczekaj 5 minut.
8. Delikatnie włóż tłoczek do filtra i przeciśnij cały lizat do falkon ki 50 ml. Wyrzuć filtr.
9. Dodaj 6 ml 100% etanolu i dobrze wymieszaj pulsacyjnie na worteksie.
10. Umieść kolumnę PS w nowej falkonce 50 ml i nanieś połowę lizatu z etanolem na kolumnę.
Zwiruj przez 3 min. przy 4500 x g. Wylej przesącz.
Powtórz krok 10.
11. Dodaj 4 ml buforu PP1 do kolumny PS i odczekaj 5 minut.
Zwiruj przez 2 min. przy 4500 x g. Wylej przesącz.
12. Dodaj 5 ml 10% etanolu do kolumny PS.
Zwiruj przez 2 min. przy 4500 x g. Wylej przesącz.
Powtórz krok 12.
13. Zwiruj przez dodatkowe 10 min. przy 4500-6000 x g, aby wysuszyc membranę w kolumnie.
14. Włóż kolumnę PS do czystej probówki wirówkowej 50 ml.
Dodaj 1 ml buforu PSE lub wody (pH 7.5-8.0) na środek membrany w kolumnie PS i odczekaj 3 minuty.
15. Zwiruj przez 2 min. przy 4500-6000 x g. Przenieś przesącz do 2-ml eppendorfki.
16. Oszacuj objętość przesączu i dodaj 0.1 objętości 3M octanu sodu lub potasu oraz 0.7 objętości
izopropanolu i zmieszaj na worteksie.
17. Zwiruj przy co najmniej 14.000 rpm przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
18. Ostrożnie zlej supernatant i przemyj osad 500 ul etanolu 70% w temperaturze pokojowej.
19. Zwiruj przy co najmniej 14.000 rpm przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
20. Ostrożnie zlej supernatant lub zbierz go pipetą. Wysusz pellet w otwartej probówce na stole.
Opcjonalnie można zastosować ogrzewanie w 70°C przez 10 minut. Przesuszenie osadu może utrudnić jego
rozpuszczenie, a niedosuszenie spowoduje zanieczyszczenie izolatu przez etanol – inhibitor reakcji.
21. Rozpuść pellet DNA w bufforze TE (nie dostarczono) lub buforze elucyjnym PSE lub wodzie.