materiały

Ćwiczenie 7
Miareczkowanie penicyliny metodą biologiczną
Cel ćwiczenia: wyznaczenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) penicyliny dla
szczepów Escherichia coli, Bacillus cereus. Określenie nieznanego stężenia antybiotyku
metodą biologiczną.
Podłoża:
Bulion odżywczy
wyciąg mięsny
3g
pepton
10 g
NaCl
5g
glukoza
10 g
woda
do 1000 ml
Bulion LB (Luria broth, Luria-Bertani broth, Lysogeny broth)
wyciąg drożdżowy 5 g
pepton trypton
10 g
NaCl
10 g
woda
do 1000 ml
Szczepy wzorcowe: E. coli, B. cereus
Miareczkowanie penicyliny metodą seryjnych rozcieńczeń:
1. Rozlać aseptycznie do 12 probówek po 2 ml jałowego bulionu LB (dla E. coli) lub
bulionu odżywczego (dla B. cereus). Zatkać probówki sterylnymi korkami i opisać je
kolejnymi numerami.
2. Przygotować następujące kontrole, opisać probówki: kontrola jałowości (probówka
11) oraz kontrola wzrostu szczepu testowego (probówka 12).
3. Do pierwszej probówki dodać 2 ml roztworu penicyliny o stężeniu 0,5 j./ml i
dokładnie wymieszać.
4. Wykonać szereg rozcieńczeń roztworu penicyliny w bulionie – przenieść jałowo 2 ml
mieszaniny z pierwszej probówki do drugiej, ponownie dokładnie wymieszać i
analogicznie postępować z kolejnymi probówkami aż do 10. Z ostatniej, dziesiątej,
probówki usunąć 2 ml w celu zachowania stałej objętości hodowli. Obliczyć stężenie
penicyliny w poszczególnych probówkach, wyniki zanotować w tabeli.
5. Przygotować rozcieńczenie hodowli szczepu wzorcowego 1:1000 w odpowiednim
bulionie.
6. Dodać do probówek nr 1-10 oraz 12 (czyli do wszystkich z wyjątkiem kontroli
jałowości) po 2 krople rozcieńczonej zawiesiny szczepu. Wszystkie probówki zatkać
jałowym korkiem.
1
7. Inkubować probówki w cieplarce (temp. 30°C lub 37°C, 24 h). Określić minimalne
stężenie hamujące (MIC – minimal inhibitory concentration) dla wybranego szczepu.
8. Analogicznie wykonać szereg rozcieńczeń dla penicyliny o nieznanym stężeniu.
Wyznaczyć stężenie roztworu wyjściowego na podstawie otrzymanych wyników.
……….
Ryc. Schemat przygotowania rozcieńczeń próbki
Wyniki:
Tabela. Obserwacja wzrostu w szeregu rozcieńczeń penicyliny o znanym stężeniu
nr
probówki
stężenie
penicyliny
[j./ml]
wzrost
szczepu
testowego
[TAK/NIE]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Minimalne stężenie hamujące wzrost …………………… wynosi: ……………………
Tabela. Obserwacja wzrostu w szeregu rozcieńczeń penicyliny o nieznanym stężeniu
nr
probówki
wzrost
szczepu
testowego
[TAK/NIE]
1
2
3
4
5
6
stężenie
penicyliny
[j./ml]
2
7
8
9
10
11
12
Stężenie penicyliny w próbce ……… wynosiło……………………
Uzasadnienie odpowiedzi:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
3