Identyfikacja szczepów Prototheca izolowanych z przypadków

Identyfikacja szczepów Prototheca izolowanych
z przypadków mastitis od krów mlecznych z terenu Polski
Zofia Bakuła1, Alicja Ratajczyk1, Henryk Krukowski2, Andrzej Lisowski3, Łukasz Wlazło2,
Mariola Bochniarz4, Tomasz Piech4, Władysław Wawron4, Tomasz Jagielski1*
1Zakład
Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
2Katedra Higieny Zwierząt i Środowiska, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie
3Katedra Hodowli i Ochrony Zasobów Genetycznych Bydła, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie
4Katedra i Klinika Rozrodu Zwierząt, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie
*Autor korespondencyjny, tel. 22 55 41 312, e-mail: [email protected]
Wstęp i cel
Do rodzaju Prototheca należą jednokomórkowe, pozbawione chloroplastów, drożdżakopodobne glony,
o szerokim występowaniu w środowisku. Spośród 7 obecnie poznanych gatunków, 5 (P. zopfii, P. wickerhamii,
P. blaschkeae, P. cutis oraz P. miyajii) opisywanych jest jako oportunistyczne patogeny człowieka i zwierząt,
a choroby przez nie wywoływane określane są jako prototekozy. Najczęściej obserwowaną postacią prototekozy
wśród zwierząt jest zapalenie wymienia (mastitis) u bydła, wywoływane głównie przez P. zopfii genotyp 2 oraz
P. blaschkeae. Celem pracy było zbadanie częstości występowania Prototheca spp. w próbach mleka pobranych od
krów na terenie 5 województw w Polsce w latach 2004-2015.
Materiały i metody
Badanie objęło próby mleka od 134 krów mlecznych z 7 gospodarstw na terenie 4 województw w Polsce.
Próby (64 od 20 przypadków mastitis) o dodatnim wyniku Terenowego Odczynu Komórkowego (TOK, Mastirapid®)
kierowano na posiew na pożywce Sabouraud’a z glukozą (SDA, Sigma). Dodatkowo, pobrano 76 prób kontrolnych
(TOK ujemny) od 19 krów zdrowych. Wyrosłe na pożywce SDA (72 godz., temp. 25oC) szczepy przypominające
morfologią glony Prototheca identyfikowano wstępnie przy użyciu metod fenotypowych (API, Biomerieux).
Genomowy DNA izolowano stosując zestaw Bacterial & Yeast Genomic DNA Purification Kit (EURx). Identyfikacja
gatunkowa prowadzona była w oparciu o genotypowo-specyficzny test PCR, różnicujący między P. zopfii genotyp 1,
P. zopfii genotyp 2 i P. blaschkeae, tj. najczęstszymi czynnikami etiologicznymi bydlęcego mastitis.
Wyniki
Ogółem wyhodowano 43 szczepy, z których wszystkie
pochodziły z przypadków mastitis (od 17 krów).
Od 3 krów z mastitis (5 prób) nie wyizolowano
szczepów Prototheca. Próby pochodzące od krów
kontrolnych (76) nie wykazały obecności szczepów
Prototheca spp. w mleku. Wśród szczepów klinicznych
42 (97,7%) zidentyfikowano jako P. zopfii genotyp 2,
a jeden (2,3%) reprezentował gatunek P. blaschkeae.
500
400
300
200
Ryc. 1. Identyfikacja gatunkowa dla trzech wzorcowych szczepów
Prototheca przy wykorzystaniu metody PCR. Zamplifikowane produkty
wizualizowano w żelu agarozowym. Wzorzec molekularny oznaczony
jako 1 odpowiada P. zopfii gen. 1, 2 - P. zopfii gen. 2, 3 - P. blaschkeae.
A-C – produkt PCR w reakcji ze starterami specyficznymi dla: P. zopfii
gen. 1 (A), P. zopfii gen. 2 (B) i P. blaschkeae (C); K – kontrola; L –
marker wielkości.
150
100
[bp]
L 1K 2K 3K 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C
Wnioski
Wśród glonów Prototheca, najczęściej izolowanym z prób mleka krowiego o dodatnim wyniku TOK, jest P. zopfii gen.
2. Obserwacja ta potwierdza wiodącą rolę P. zopfii gen. 2 jako czynnika etiologicznego mastitis u krów mlecznych
w Polsce.
Badanie zostało sfinansowane ze środków przyznanych grantem N.C.N. «SONATA» (2014/15/D/NZ7/01797)