Pobierz dokument
Transkrypt
Pobierz dokument
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 342518 (22) Data zgłoszenia: 08.05.1998 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) 08.05.1998, PCT/US98/09023 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 19.11.1998, WO98/51298 PCT Gazette nr 46/98 192596 (13) B1 (11) (51) Int.Cl.8 C07D 241/04 C07D 225/02 C07D 223/10 C07D 211/76 C07D 209/46 A61K 31/495 A61P 13/08 Pochodna piperazyny, zawierająca ją kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie pochodnej piperazyny oraz związek pośredni do jej wytwarzania (73) Uprawniony z patentu: ORTHO-McNEIL PHARMACEUTICAL INC., Raritan,US (30) Pierwszeństwo: 12.05.1997,US,60/046,236 (72) Twórca(y) wynalazku: Linda Jolliffe,Belle Mead,US William Murray,Belle Mead,US Virginia Pulito,Flemington,US Alan Reitz,Lansdale,US Xiaobing Li,San Diego,US Linda Mulcahy,Flamington,US Cynthia Maryanoff,Forest Grove,US Frank Villani,Perkasie,US (43) Zgłoszenie ogłoszono: 18.06.2001 BUP 13/01 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.11.2006 WUP 11/06 (74) Pełnomocnik: Dorota Orlińska, POLSERVICE Sp. z o.o. PL 192596 B1 (57) 1. Pochodna piperazyny o wzorze I w którym: A oznacza (CH2)n, gdzie n oznacza 1 lub 2 R1 oznacza C1-4-alkil, R2 oznacza wodór, d1-4-alkil, -CH2C6H5, E oznacza albo gdzie : m oznacza 2-4, R3 oznacza tlen, R4, R5, R6 oznaczają wodór, oraz jego farmaceutycznie akceptowalne sole. 2 PL 192 596 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest pochodna piperazyny zawierająca ją kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie tych pochodnych i związek pośredni stosowany przy ich wytwarzaniu. Związki według wynalazku hamują selektywnie wiązanie się z receptorem adrenergicznym α-1a, receptorem, który uczestniczy w łagodnym przeroście sterczą. Związki według wynalazku zmniejszają ponadto ciśnienie wewnątrzcewkowe w modelu in vivo, a zatem są użyteczne przy leczeniu tej choroby. Łagodny przerost gruczołu krokowego (BHP), niezłośliwe powiększenie się gruczołu krokowego, jest najpowszechniejszym łagodnym nowotworem u mężczyzn. Około 50% mężczyzn powyżej 65 lat ma w pewnym stopniu BHP, a jedna trzecia z nich ma objawy kliniczne związane z zaparciem wylotu pęcherza moczowego (Hieble and Caine, 1986). W Stanach Zjednoczonych łagodne i złośliwe choroby stercza są odpowiedzialne za więcej operacji chirurgicznych niż choroby innych organów u mężczyzn w wieku powyżej pięćdziesięciu lat. Istnieją dwa składniki BHP, statyczny i dynamiczny. Składnik statyczny jest związany z powiększeniem się gruczołu krokowego, które może spowodować zaciśnięcie, się cewki moczowej i zaczopowanie wypływu moczu z pęcherza moczowego. Składnik dynamiczny jest związany ze zwiększonym napięciem mięśnia gładkiego szyjki pęcherza moczowego i samego gruczołu krokowego, (co zakłóca opróżnianie pęcherza) i jest regulowany adrenergicznymi receptorami alfa 1 (α1-AR-sy). Leczenie medyczne dostępne dla PBH traktuje te składniki w różnym stopniu, a wybór leczenia zwiększa się. Opcje leczenia chirurgicznego są związane ze statycznym składnikiem BHP i obejmują poprzez cewkową resekcję gruczołu krokowego (TURP), poprzez cewkowe wycięcie gruczołu krokowego (TUIP), otwarte wycięcie sterczą, rozszerzanie balonowe, hipotermię, rurki umieszczane w przewodzie i usunięcie laserem. TURP jest zalecanym leczeniem pacjentów z PBH, przy czym w Stanach Zjednoczonych przeprowadzono w 1990 roku 320000 zabiegów TURP przy szacunkowym koszcie 2,2 miliarda dolarów (Weis et al.), chociaż skuteczne leczenie w przypadku większości mężczyzn z objawami PBH, w przybliżeniu 20-25% pacjentów, nie daje zadowalającego długoterminowego rokowania (Lepor i Rigaud, 1990). Komplikacje obejmują wsteczną ejakulację (70-75% pacjentów), impotencję (5-10%), pooperacyjną infekcje przewodu moczowego (5-10%) i pewien stopień nietrzymania moczu (2-4%) (Mebust et al., 1989). Ilość ponownych operacji wynosi w przybliżeniu 15-20% u mężczyzn z szcunkowym przeżyciem 10 albo więcej lat (Wennberg et, al., 1987). Niezależnie od podejścia chirurgicznego istnieje szereg sposobów leczenia farmakologicznego, które są ukierunkowane na składnik statyczny tego stanu chorobowego. Finasteride (Proscar®, Merck) jest jednym z takich środków terapeutycznych, który jest wskazany przy leczeniu symptomatycznego BPH. Ten lek jest konkurencyjnym inhibitorem dla enzymatycznej reduktazy 5a, która jest odpowiedzialna za przekształcenie testosteronu w dwuwodorotestosteron w gruczole krokowym (Gormley et al., 1992). Dwuwodorotestosteron wydaje się być głównym mitogenem wzrostu gruczołu krokowego, a środki hamujące reduktazę 5a zmniejszają wielkość gruczołu krokowego i polepszają wypływ moczu przez część sterczową cewki moczowej. Chociaż finasteride jest silnym inhibitorem reduktazy 5a i powoduje wyraźny spadek stężenia dwuwodorotestosteronu w surowicy krwi i tkankach, to jest tylko umiarkowanie skuteczny przy leczeniu objawowego BPH (Oesterling, 1995). Skutki finasteride wymagają 6-12 miesięcy czasu, aby stać się widoczne, i w przypadku wielu mężczyzn polepszenie kliniczne jest minimalne (Barry, 1997). Składnik dynamiczny BPH związano ze stosowaniem środków blokujących receptory adrenergiczne (blokery α1-AR-blokery), które działają drogą obniżania napięcia samych mięśni gładkich. Szereg blokerów α1-AR (terazosin, prazosin i doxazosin) badano pod kątem objawowego leczenia zaczopowania wylotu pęcherza moczowego na skutek BPH, przy czym terazosin (Hytrin¨, Abbott) badano najintensywniej. Chociaż blokery α1-AR są dobrze tolerowane, to w przybliżeniu u 10-15% pacjentów rozwija się klicznie niekorzystne zjawisko (Lepor, 1995). Niepożądane skutki u wszystkich członków tej klasy są podobne, przy czym podciśnienie ortostatyczne jest najczęściej doznawanym skutkiem ubocznym (Lepor et al., 1992). W porównaniu z inhibitorami reduktazy 5a środki blokujące α1-AR mają szybszy początek działania (Steers, 1995). Jednak ich skutki terapeutyczne, zmierzone drogą punktowania polepszenia objawów i maksymalnej prędkości wypływu moczu są umiarkowane (Oesterling, 1995). Zastosowanie antagonistów α1-AR przy leczeniu BPH jest związane z ich zdolnością do obniżania napięcia gładkiego mięśnia gruczołu krokowego, prowadzącego do złagodzenia objawów zaczopowania. Ustalono, że receptory adrenergiczne odgrywają w organizmie dominującą rolę przy PL 192 596 B1 3 regulowaniu ciśnienia krwi, przekrwieniu nosa, działaniu przy krańcowym wyczerpaniu i innych procesach (Harrison et al., 1991). Istnieje jednak szereg sklonowanych podtypów receptorów α1-AR: α-1a-AR, α-1b-AR i α-1d-AR (Bruno et al., 1991, Forray et al., 1994, Hirasawa et al., 1993, Ramarao et al., 1992, Schwinn et al., 1995, Weinberg et al., 1994). W szeregu laboratoriów scharakteryzowano α1-AR-sy w ludzkim gruczole krokowym drogą funkcyjnego wiązania radioligandów i techniką biologii molekularnej (Forray et al., 1994), Hatano et al., 1994, Marshall et al., 1995, Yamada et al., 1994). Te badania dostarczyły dowodu na poparcie koncepcji, że podtyp α-1a-AR stanowi większość α1-AR-sów w ludzkim mięśniu gładkim gruczołu krokowego i pośredniczy w skurczu tej tkanki. Te odkrycia sugerują, że opracowanie antagonisty α-1a-AR selektywnego pod względem podtypu może dać w wyniku skuteczny środek terapeutyczny o większej selektywności przy leczeniu BPH. Przedmiotem wynalazku jest pochodna piperazyny o wzorze I w którym: A oznacza (CH2)n, gdzie n oznacza 1 lub 2 R1 oznacza C1-4-alkil, R2 oznacza wodór, C1-4-alkil, -CH2C6H5, E oznacza albo gdzie: m oznacza 2-4, R3 oznacza tlen, R4, R5, R6 oznaczają wodór, oraz jego farmaceutycznie akceptowalne sole. Korzystnie w pochodnej przedstawionej powyżej E oznacza 4 PL 192 596 B1 m oznacza 2-4, R3 oznacza tlen, R4 oznacza wodór. Przedmiotem wynalazku jest także N-[etylo-2-(2-izopropyloksyfenylo)piperazynylo-4)]-N-metylo-[1'(2-oksypiperydynylo)]acetamid. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik albo rozcieńczalnik, charakteryzująca się tym, że jako substancję czynną zawiera pochodną określoną powyżej wzorem l. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik albo rozcieńczalnik, charakteryzująca się tym, że jako substancję czynną zawiera konkretną pochodną określoną powyżej nazwą chemiczną. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie określonej powyżej pochodnej piperazyny o wzorze I do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia łagodnego przerostu gruczołu krokowego. Korzystnie wytwarzany lek przeznaczony jest do podawania doustnego i zawiera on wyżej określoną pochodną w ilości od 0,01 do 100 mg/kg masy ciała dziennie. Korzystnie wytwarzany lek zawiera pochodną określoną powyżej w ilości od 0,05 do 1,0 mg/kg masy ciała dziennie. Przedmiotem wynalazku jest także pochodna piperazyny o wzorze II, w którym: A oznacza (CH2)n, gdzie n oznacza 1 lub 2, R1 oznacza C1-4-alkil, R7 oznacza wodór. Korzystnym jest gdy R1 oznacza rozgałęziony C2-4-alkil. Przedmiotem wynalazku jest także 1-(2-aminoetylo)-4-(2-izopropyloksyfenylo)piperazyna. Związki przedstawione wzorem II są związkami pośrednimi użytecznymi przy otrzymywaniu związków o wzorze I. Opisane związki o wzorze I są użyteczne jako środki modulujące receptory adrenergiczne. Związki według wynalazku wiążą się selektywnie z receptorem α-1a-AR, modulują aktywność wymienionego receptora i są bardziej selektywne względem tkanki gruczołu krokowego niż tkanki tętnicy. Jako takie stanowią one skuteczny środek leczniczy przy schorzeniach modulowanych receptorami α-1a-AR, do których należy, lecz nie tylko, BPH. PL 192 596 B1 5 Przy wytwarzaniu związków o wzorze I są też użyteczne związki pośrednie o wzorze III; w którym: m oznacza 1-5. Określenia stosowane przy opisie wynalazku są określeniami powszechnie stosowanymi i znanymi specjalistom w tej dziedzinie. „HBSS” oznacza zrównoważony roztwór soli Hanka. „LDA” oznacza dwujodopropyloamid litowy, natomiast „BOP” oznacza sześciofluorofosforan benzotriazolilo-2-oksy-tris(dwumetyloamino)fosfoniowy. „BOC” oznacza t-butoksykarbonyl, „PyBroP” oznacza sześciofluorofosforan bromo-tris-pirolidynofosfoniowy, „CBZ” oznacza benzyloksykarbonyl, a „Ts” oznacza toluenosulfonyl. „DCC” oznacza 1,3-dwucykloheksylokarbodwuimid, „DMAP” oznacza N,N-dwumetyloaminopirydynę, „EDCl” oznacza chlorowodorek 1-(3-dwumetyloaminopropylo)-3-etylokarbodwuimidu, a „HOBT” oznacza wodzian 1-hydroksybenzotriazolu. Symbol „Ph” oznacza fenyl, a „PHT" oznacza ftaloimid. Określenie „dawka skuteczna" oznacza ilość związku o wzorze L, która wiąże się z i ewentualnie antagonizuje aktywność adrenergicznego receptora α-1a. Określenie „dawka skuteczna” oznacza ponadto ilość związku o wzorze I, który zmniejsza objawy chorób związanych z adrenergicznym receptorem α-1a. Powyższe związki oraz pochodne piperazyny o podobnym szkielecie można otrzymać według następujących schematów. Związki o budowie podobnej do związków przedstawionych wzorem I, w którym zamiast podstawnika R1 występuje fenyl, R2 oznacza wodór, R3 oznacza tlen, A oznacza (CH2)3, a m jest równe 4, można otrzymać w sposób przedstawiony schematem 1. Na tym schemacie cząsteczki o wzorze l otrzymuje się w zbieżnej syntezie, w której dwie połówki cząsteczki zestawia się, a na koniec sprzęga ze sobą. Materiał wyjściowy dla jednej połówki jest jedno-N-podstawioną piperazyną typu 1a. Traktowanie związku 1a łagodną zasadą, taką jak K2CO3 i środkiem alkilującym, takim jak akrylonitryl, w rozpuszczalniku obojętnym, takim jak MeOH, w temperaturze pokojowej w ciągu 2-24 godzin daje nitryl 1b. Ten związek pośredni można uwodornić stosując nikiel Raneya, jako katalizator, otrzymując propyloaminowy produkt pośredni 1c. Drugą połowę cząsteczki buduje się stosując jako materiały wyjściowe związki typu 1c. ε-Kaprolaktam traktuje się silną zasadą, taką jak NaH, w rozpuszczalniku obojętnym w tempoeraturze 0°C w ciągu około 30 minut. Utworzony anion traktuje się środkiem alkilującym, takim jak bromooctan t-butylu, w rozpuszczalniku obojętnym, takim jak acetonitryl, w temperaturze pokojowej w ciągu dwóch godzin do 2 dni, otrzymując ester 1e. Hydroliza estru 1e za pomocą kwasu, takiego jak kwas trójfluorooctowy, w temperaturze pokojowej w ciągu 2-16 godzin daje kwas 1f. Traktowanie aminy 1c i kwasu 1f peptydowym środkiem sprzęgającym, taki jak BOP, i odpowiednią aminą, taką jak DMAP, w temperaturze pokojowej w ciągu 1-16 godzin daje związek o wzorze I, 1g, Zamiast BOP można stosować inne środki sprzęgające. Do takich środków należą, lecz nie tylko, PyBroP, EDC1, HOBt, itp. Do odpowiednich środków zastępujących DMAP należy, lecz nie tylko, N-metylomorfolina, imidazol, DABCO, itp. Schemat 1 można wykorzystać do otrzymywania związków obok związku 1g. Do otrzymywania związków, w których m oznacza 1-5, ε-kaprolaktam na schemacie 1 zastępują inne znane laktamy, o odpowiedniej wielkości pierścienia, takie jak 2-azacyklooktanon. 6 PL 192 596 B1 Do otrzymywania związków, w których R1 zastąpiono grupą inną niż grupa fenoksy, 1a zastępuje się znanymi pochodnymi fenylopiperazyny, takimi jak N-(2-t-butoksyfenylo)piperazyna. Do otrzymywania związków, w których A oznacza (CH2)n;- a n jest równe 1-6, akrylonitryl można zastąpić środkami alkilującymi, takimi jak 4-chlorobutyronitryl. Alternatywnie, produkt pośredni typu 1c można otrzymać inną drogą, jak przedstawiono na schemacie 2. Pochodną piperazynową 1a traktuje się łagodną zasadą i znaną pochodną ftaloimidową, taką jak N-(4-bromo-butylo)ftalimid, otrzymując produkt pośredni 2a. Traktowanie 2a hydrazyną, taką jak N-metylohydrazyna, w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak MeOH albo EtOH, pod chłodnicą zwrotną daje produkty pośrednie typu 1c. Alternatywnie piperazynę 1a traktuje się łagodną zasadą i aminą zabezpieczoną za pomocą N-BOC, taką jak N-tertbutoksy-karbonylo-4-bromobutyloamina, otrzymując odpowiednią aminę zabezpieczoną za pomocą BOC. Z tej aminy można usunąć zabezpieczenie przez potraktowanie kwasem, takim jak TFA, otrzymując produkty pośrednie typu 1c. PL 192 596 B1 7 Do otrzymywania związków, w których R2 jest inne niż wodór, wykorzystuje się schemat 3. Traktowanie związków typu 1g silną zasadą, taką jak NaH, a następnie środkiem alkilującym, takim jak bromek benzylu, w ciągu 1-5 godzin w temperaturach od 0 do 35°C daje związki typu 3a. Związki, w których R4 zastąpiono podstawnikami takimi jak tlen, C1-5-alkil, formyl, karboksyl, C1-5-alkilokarbonyl, C1-5-alkoksykarbonyl, fenylo-C1-5-alkoksyl, podstawiony fenylo-C1-5-alkoksyl, grupę amidową i podstawioną grupę amidową, można zsyntezować według schematu 4. Na przykład w celu otrzymania związków, w których R4 oznacza etoksykarbonyl, m oznacza 2, a R3 oznacza karbonyl, 2-pirolidono-5-karboksylan etylu traktuje się silną zasadą, taką jak NaH, w rozpuszczalniku obojętnym w temperaturze 0°C w ciągu około 30 minut. Utworzony anion traktuje się środkiem alkilującym, takim jak bromooctan t-butylu, w rozpuszczalniku obojętnym, takim jak acetonitryl, w temperaturze pokojowej w ciągu od dwóch godzin do 2 dni otrzymując ester 4a. Hydroliza kwasowa produktu 4a za pomocą kwasu trój fluorooctowego w temperaturze pokojowej w ciągu 2-16 godzin daje kwas 4b. Sprzęganie kwasu 4b i pośredniej aminy 1c z peptydowym środkiem sprzęgającym, takim jak PryBOP, daje związek o wzorze 4c. Ester etylowy związku 4c można traktować szeregiem środków otrzymując pochodne, takie jak amidy, kwasy karboksylowe, aldehydy, itp., gdzie odczynniki i warunki reakcji mieszczą się w umiejętnościach specjalistów w tej dziedzinie. 8 PL 192 596 B1 Związki o wzorze l można stosować w kompozycjach do leczenia pacjentów z zaburzeniami związanymi z modulowaniem aktywności adrenergicznego receptora α1. Korzystną drogą podawania jest podawanie doustne, jakkolwiek związki według wynalazku można podawać w inny sposób, włącznie, lecz nie tylko, z infuzją dożylną. Dawki przy podawaniu doustnym wynoszą od 0,01 do 100 mg/kg dziennie. Korzystna wielkość dawki doustnej wynosi od około 0,05 do 1,0 mg/kg dziennie. Dawki infuzyjne mogą wynosić od około 0,001 do 100 mg/kg inhibitora, z nośnikiem farmaceutycznym, w ciągu od około kilku minut do kilku dni. Kompozycje farmaceutyczne można otrzymywać stosując konwencjonalne farmaceutyczne rozczynniki i techniki mieszania składników. Postacie jednostkowe dawek mogą być eliksirami, syropami, kapsułkami, tabletkami, itp., w których stały nośnik jest substancją obojętną, taką jak laktoza, skrobia, glukoza, metyloceluloza, stearynian magnezowy, fosforan dwuwapniowy, mannit, itp., a do typowych ciekłych rozczynników doustnych należy etanol, gliceryna, woda, itp. Wszystkie rozczynniki można mieszać, w miarę potrzeby, ze środkami rozpulchniającymi, rozcieńczalnikami, środkami granulującymi, środkami poślizgowymi, spoiwami, itp., stosując konwencjonalne sposoby znane specjalistom w tej dziedzinie przy otrzymywaniu postaci dawek. Pozajelitowe postacie dawek można otrzymywać stosując farmaceutycznie akceptowalne nośniki albo rozcieńczalniki obejmujące, lecz nie tylko, wodę albo inny sterylny nośnik. Związki o wzorze I wydziela się typowo i stosuje w postaci wolnych zasad, chociaż związki można wydzielać i stosować w postaci swoich farmaceutycznie akceptowalnych soli. Do takich soli należą na przykład, lecz nie tylko, sole bromowodorowe, jodowodorowe, chlorowodorowe, nadchlorowe, siarczanowe, maleinowe, fumarowe, jabłkowe, winowe, cytrynowe, benzoesowe, migdałowe, metanosulfonowe, PL 192 596 B1 9 wodoroetanosulfonowe, benzenosulfonowe, szczawiowe, pamoinowe, 2-naftalenosulfonowe, p-toluenosulfonowe, cykloheksanosulfaminowe i sacharynowe. W celu zilustrowania wynalazku podano następujące przykłady, które nie ograniczają wynalazku. Przykład 1 1-(2-ftalimidoetylo)-4-(2-izopropyloksyfenylo)piperazyna (Związek 1) Do roztworu N-1-(2-izopropyloksyfenylo)piperazyny (6,6 g, 30 mmoli) w acetonitrylu (100 ml) dodano N-(2-bromoetylo)ftalimid (7,6 g, 30 mmoli) i K2CO3 (6,2 g, 45 mmoli) i otrzymany roztwór ogrzewano pod chłodnicą zwrotną w ciągu 2 dni. Następnie mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując jako eluent EtOAc/heksany (30:70) i otrzymując związek tytułowy w postaci substancji stałej: MS m/z 394 (MH+). Przykład 2 1-(2-aminoetylo)-4-(2-izopropyloksyfenylo)piperazyna (Związek 2) Roztwór związku 1 (7,5 g, 19 mmoli) w EtOH (70 ml) mieszano w ciągu 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodano do niego metylohydrazynę (20 ml) i ogrzewano całość pod chłodnicą zwrotną w ciągu 2,5 godziny. Następnie ochłodzono mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej, a otrzymany stały osad oddzielono przez filtrację. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując związek tytułowy w postaci substancji stałej, który wykorzystano bez dalszego oczyszczania: MS m/z 264 (MH+). 10 PL 192 596 B1 Przykład 3 1-t-butoksykarbonylometylo-2-piperydon (Związek 3) Do mieszanego roztworu 5-walerolaktamu (5,95 g, 60 mmoli) w toluenie (100 ml) dodano w temperaturze 0°C 95% wodorek sodowy i mieszano otrzymaną zawiesinę w ciągu 1 godziny. Następnie dodano po kropli bromooctan t-butylu (8,86 ml, 60 mmoli), ogrzano mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej i mieszano w ciągu 10 minut. Następnie dodano nasycony wodny roztwór NH4Cl, a otrzymaną warstwę organiczną przemyto kolejnymi porcjami solanki i H2O. Połączone warstwy organiczne wysuszono (Na2SO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując związek 3 w postaci oleju. Przykład 4 1-karboksylometylo-2-piperydon (Związek 4) Do mieszanego roztworu związku 2 (12,93 g, 61 mmol) w chlorku metylenu (30 ml) dodano w atmosferze Na kwas trójfluorooctowy (15 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 4 godzin, a następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując związek tytułowy w postaci substancji stałej: MS m/z (MH+). Przykład 5 N-[etylo-2-izopropyloksyfenylo)piperazynylo-4)]-[1'-(2-oksy-piperydynylo)]acetamid (Związek 5) PL 192 596 B1 11 Do roztworu związku 4 (5,0 g, 19 mmoli) w chlorku metylenu (10 ml) dodano roztwór związku 2 (3,61 g, 23 mmole). Następnie dodano PyBroP (10,72 g, 2.3 mmole), DMAP (3,85 g, 31 mmoli) i N-metylomorfolinę (2,53 ml, 23 mmole) i mieszano całość w temperaturze pokojowej w atmosferze azotu w ciągu 10 godzin. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną przemyto jedną porcją wodnego roztworu wodorowęglanu sodowego, solanką i wodą. Połączone warstwy organiczne wysuszono (Na2SO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii MPLC na żelu krzemionkowym stosując jako eluent EtOAc/MeOH/trójetyloaminę (90:5:5) i otrzymując związek tytułowy w postaci oleju: MS m/z 403 (MH+). Potraktowanie wydzielonego związku równomolową ilością kwasu cytrynowego w octanie etylu dało sól cytrynową związku tytułowego w postaci substancji stałej. Przykład 6 N-[etylo-2-(2-izopropyloksyfenylo)piperazynylo-4)]-N-metylo-[1'-(2-oksypiperydynylo)]acetamid (Związek 6) Do mieszanego roztworu związku 5 (140,5 mg, 0,35 mmola) w THF (5 ml) dodano w temperaturze 0°C wodorek sodowy (techniczny, 95%, 10,6 mg, 0,44 mmola) i otrzymaną zawiesinę mieszano w ciągu 30 minut. Następnie dodano po kropli jodek metylu (0,37 mmola) i mieszano całość w ciągu nocy w temperaturze pokojowej. Z kolei zatężono pozostałość pod zmniejszonym ciśnieniem, rozpuszczono w octanie etylu i przemyto kolejnymi porcjami wodnego nasyconego roztworu chlorku amonowego, solanki i wody. Połączone warstwy organiczne wysuszono (Na2SO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując związek tytułowy w postaci substancji stałej: MS m/z 417 (MH+). Aktywność biologiczną i selektywność związków według wynalazku wykazano za pomocą następujących prób in vitro. Pierwsza próba wykazała zdolność związków o wzorze I do wiązania się ze związanymi z błonami receptorami α-1a-AR, α-1b-AR i α-1d-AR. Opublikowano sekwencje DNA trzech sklonowanych ludzkich podtypów α1-AR. Co więcej, sklonowane cDNA dawały ekspresję zarówno przejściowo w komórkach COS, jak i w sposób trwały w szeregu linii komórkowych ssaków (HeLa, LM(tk-), CHO, 1-fibroblast szczura) i wykazano, że zachowują aktywność wiązania ligandu oraz zdolność sprzęgania się z hydrolizą fosfoinozytydu. Opublikowaną informację o sekwencji DNA wykorzystano do zaprojektowania primerów do stosowania przy amplifikacji RT techniką PCR każdego podtypu w celu uzyskania sklonowanych cDNA. Ludzki poliA+RNA otrzymano z dostępnych w handlu źródeł, cytowanych w literaturze, i obejmował próbki hipokampa i gruczołu krokowego. Do pierwszej selekcji wykorzystano próbę wiązania radioligandu, w której stosowano preparaty błon z komórek dających ekspresję indywidualnych sklonowanych cDNA receptorów. Znaczone promieniotwórcze ligandy z aktywnością wiązania się na wszystkich trzech podtypach (nieselektywnych) są dostępne w handlu ([125J]-HEAT, [3H]-prazosin). Każdy podtyp receptora α1 klonowano z A+RNA standardowym sposobem łańcuchowej reakcji polimerazy z odwróconą transkrypcją (RT-PCR). Do klonowania podtypów α-1a-AR, ludzki hipokamp i gruczoł krokowy, α-1b-AR, hipokamp ludzki, α1d-AR, hipokamp ludzki. Otrzymane cDNA klonowano do wektora ekspresji ssaka pcDNA3 (Lnvitrogen Corp., San Diego CA). Dla każdego DNA oznaczano sekwencję w celu weryfikacji i wykrycia wszelkich możliwych mutacji wprowadzonych w procesie amplifikacji. Każde odchylenie sekwencji od opublikowanych danych dla każdego podtypu receptora korygowano drogą mutagenezy skierowanej do danego centrum. Trzy podtypy α1-AR (a, b, d) poddawano transfekcji w komórkach COS stosując standardową procedurę dekstranową DEAE ze wstrząsem chlorochinowym. W tym postępowaniu każdą szalkę 12 PL 192 596 B1 (100 mm) z kulturą tkanki zaszczepiano komórkami w ilości 3,5 x 106 i poddawano transfekcji za pomocą 10 µg DNA. W przybliżeniu 72 godziny po transfekcji komórki zbierano i preparowano z nich błony COS. Poddane transfekcji komórki COS z 25 płytek (100 mm), zdrapywano i zawieszano w 15 ml buforu TE (50 mM Tris.HCl, 5 mM EDTA, pH 7,4) . Zawiesinę rozrywano za pomocą homogenizatora, a następnie wirowano z prędkością 1000 x g w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C. Klarowną ciecz wirowano z prędkością 34500 x g w ciągu 20 minut w temperaturze 4°C. Następnie pastylkę zawieszano ponownie w 5 ml buforu TNE (50 mM Tris.HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 7,4). Otrzymany preparat błon podzielono na części podwielokrotne i przechowywano w temperaturze -70°C. Stężenie protein oznaczano drogą solublilizacji membran za pomocą TritonX-100. Zdolność każdego związku do wiązania się z każdym z podtypów α1-AR ustalano drogą próby wiązania receptora. Jako ligand znaczony promieniotwórcze stosowano [125J]-HEAT, nieselektywny ligand al-AR. W każdym wgłębieniu płytki z 96 wgłębieniami umieszczano: 140 µl TNE, 25 µl [125J]-HEAT rozcieńczony w TNE (50000 cpm, stężenie końcowe 50 mM), 10 µl badanego związku rozcieńczonego w DMSO (stężenie końcowe 1 pM-10 µM), 25 ml preparatu błon komórkowych COS, dającego ekspresję trzech podtypów α1-AR (0,05-0,2 mg protein błon komórkowych). Płytkę poddawano inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie mieszaniny reakcyjne filtrowano przez płytkę filtracyjną Packard GF/C Unifilter. Płytkę filtracyjną suszono w ciągu 1 godziny w piecu próżniowym. Z kolei do każdej płytki dodano ciecz scyntylacyjną (25 ml) i płytkę filtracyjną poddawano liczeniu za pomocą licznika scyntylacyjnego Packard Topcount. Dane analizowano korzystając z oprogramowania GraphPad Prism. W Tabelach A & B zestawiono listę wartości IC50 wyrażonych w stężeniu nonamolowym w celu wybrania związków według wynalazku we wszystkich podtypach receptorów. Tabela A Związek 5* 6 7 8 9 10 11 12 R1 i-prop . i-prop . i-prop . i-prop . i-prop . i-prop . i-prop . CH3 A CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 (CH2)2 „*” oznacza sól cytrynianową R2 H CH3 CH2CHCH2 CH2(C)CH3 CH2Ph H H H R4 H H H H H CO2C2H5 H H m α-1a-AR 3 3 3 3 3 2 4 3 8,7 53 103 237 88 20 18 98 α-1b-AR 46120 763900 172500 17020° 4226 26310 3536 109000 α-1d-AR 372 650 372 358 348 260 505 30530 13 PL 192 596 B1 Tabela B Cpd. Ri A R2 13 i-prop. CH2 H α-1a-AR α-1a-AR 104 1616 α-1a-AR 11 Aktywność antagonistyczną wybranych związków o wzorze I wykazano za pomocą następującej selekcji. Wiązanie się antagonisty z receptorami α1-AR powoduje aktywację PLC drogą mechanizmów sprzęgania protein G (Minneman i Esbenshade, 1994). PLC katalizuje hydrolizę 4,5-dwufosforanu fosfatydylo-inozytu (PIP2) wytwarzającego dwie drugie cząsteczki informacyjne, 1,4,5-trójfosforan inozytu (LP3) i dwuacyloglicerynę (DAG), dając ostatecznie w wyniku uruchomienie wewnątrzkomórkowych zapasów wapnia. Dane z pierwszej próby selekcji, które wykazywały selektywność inhibicji radioligandu wiążącego się z α1a-AR oceniano pod kątem zdolności do antagonizowania uruchomienia wapnia cytosolowego w liniach komórkowych dających trwałe ekspresje poszczególnych podtypów receptorów. Otrzymywanie trwałych linii komórkowych, dających ekspresję każdego podtypu receptora: podtypy adrenergicznych receptorów alfa 1 (a, b, d) w wektorze pcDNA3 poddawano transfekcji do komórek HEK 293 (nerki ludzkich embrionów) tworząc trwałe linie komórkowe dające ekspresję receptorów. Transfekcję prowadzono stosując kationowy odczynnik lipidowy DMRIE-C (GibcoBRL) zmieszany z 2-3 µg DNA i zredukowanym medium surowicy OPTL-MEM l (GibcoBRL). Na komórki na 100 mm płytkach z hodowlą tkanek nakładano kompleks lipid-DNA i poddawano inkubacji, w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2 w ciągu 5-6 godzin. Następnie dodano medium hodowlane zawierające surowicę i komórki poddawano inkubacji w ciągu dalszych 48 godzin. Po inkubacji każdą płytkę rozdzielano do medium selekcyjnego zawierającego 250, 300 albo 350 µg/ml antybiotyku G418 (geneticin). Płytki zasilano co 4 dni za pomocą odpowiedniego medium selekcyjnego. W przybliżeniu po 3 tygodniach z 300 µg/ml płytek selekcyjnych G314 pobierano kolonie każdego podtypu. Następnie kolonie poddawano ekspansji i zamrażano. Do wiązania adrenergicznego receptora alfa 1 oddzielono dwanaście linii komórkowych każdego podtypu, stosując pełną próbę wiązania się receptorów komórkowych. Hodowle pozytywne analizowano następnie drogą mobilizacji wapnia. Komórki HEK 293s, dające ekspresję ludzkiego α-1a-Ar pobrano za pomocą trypsyny i przemyto jeden raz za pomocą HBSS. Pastylkę komórek zawieszono ponownie w HBSS z 0,05% BSA do stężenia 1-5 x 106 komórek/ml. Następnie do zawiesiny komórek dodano 5 mM roztwór Fluo-3 (w 2/3 objętości DMSO i 1/3 objętości kwasu pluronowego) otrzymując końcowe stężenie Fluo-3 5 µM. Następnie komórki poddawano inkubacji lekko wstrząsając w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny w ciemności. Po inkubacji komórki przemywano 3 razy za pomocą HBSS i zawieszano ponownie w HBSS z 1,25 mM CaCl2 do stężenia 0,7 x 106 komórek/ml. Następnie do każdego wgłębienia mikropłytek z 96 wgłębieniami odpipetowano podwielokrotności komórek (100 µl). Mobilizację wapnia indukowano za pomocą norepinefryny (10 µM) w temperaturze pokojowej. Dwie minuty przed próbą do komórek dodano antagonistów korzystając z pipetora z 96 wgłębieniami. Następnie dodano agonistę i monitorowano w ciągu 2-3 minut sygnał fluorescencyjny korzystając z aparatury FLIPR (Molecular Devices, USA). Związek 5 dawał inhibicję mobilizacji wapnia cytosolowego przy stężeniu LC50 99 µM. Aktywność antagonistyczną i selektywność związków według wynalazku względem tkanek gruczołu krokowego w porównaniu z tkankami tętnicy oraz ich antagonistami wykazano w sposób następujący: reakcje kurczliwe tkanki gruczołu krokowego szczura i tkanek tętnicy szczura badano w obecności i przy braku związków antagonistycznych. Jako wskazanie dla selektywności antagonizmu wpływ badanych związków na kurczliwość mięśni gładkich naczyń (α1b-AR i porównywano z wpływem na mięsień gładki gruczołu krokowego (α1a-AR). Prążki tkanki gruczołu krokowego i pierścienie tętnic otrzymano ze szczurów płci męskiej, pochodzących z Long Evans, o ciężarze 275 gramów i uśmierconych przez zwichnięcie kręgów szyjnych. Tkankę gruczołu krokowego umieszczano pod naprężeniem 1 g w 10 ml kąpieli zawierającej roztwór soli buforowany fosforanem, pH 7,4, w temperaturze 32°C, a naprężenie izometryczne mierzono za pomocą przetworników siły. Tkankę z tętnicy umieszczano przy naprężeniu 2 gramy w 10 ml kąpieli zawierającej roztwór soli buforowany fosforanem, pH 7,4, w temperaturze 37°C. Oznaczano zdolność badanego związku do zmniejszania reakcji kurczliwej indukowanej norepinefryną o 50% (IC50). Związek 5 dawał inhibicję reakcji kurczliwej w tkance tętnicy przy stężeniu ICso 31,9 nM, a w przypadku tkanki gruczołu krokowego przy stężeniu IC50 1/3 µM. 14 PL 192 596 B1 Wybrane związki według wynalazku badano pod względem ich zdolności antagonizowania indukowanego przez fenyloefrynę (PE) wzrostu ciśnienia wewnątrzcewkowego u psów. Selektywność tych związków wykazano porównując ich wpływ na indukowany przez PE wzrost średniego ciśnienia tętniczego (MAP) u psa. Psy gończe płci męskiej usypiano i poddawano cewnikowaniu w celu zmierzenia ciśnienia wenątrzcewnikowego w części sterczowej cewki moczowej. Średnie ciśnienie tętnicze (MAP) mierzono stosując cewnik umieszczony w tętnicy udowej. Początkowo podawano psom dożylnie sześć bolusowych dawek (1 do ≤ 32 mg/kg) fenyloefryny (PE) w celu ustalenia się krzywej kontrolna dawka agonisty/reakcja. IUP i MAP rejestrowano po każdym powrocie IUP do linii podstawowej. Następnie podano psom dożylnie bolusową dawkę związku antagonistycznego, po której następowały dożylne wzbudzenia PE rosnących dawek, jak w krzywej kontrolna dawka agonisty/reakcja, przy czym rejestrowano pomiary IUP i MAP po każdym wzbudzeniu PE. Związek antagonistyczny badano w przedziale dawek od 3 do 300 µg/kg z przyrostami w skali półlogarytmicznej. Przedział czasowy pomiędzy dawkami antagonisty wynosił conajmniej 45 minut i dla każdego badanego związku prowadzono trzy doświadczenia na jeden poziom dawki. Przedstawione niżej wykresy ilustrują średnie procentowe zmniejszenie IUP i MAP odpowiednio dla związku 5 i 12. PL 192 596 B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Pochodna piperazyny o wzorze I w którym: A oznacza (CH2)n, gdzie n oznacza 1 lub 2 R1 oznacza C1-4-alkil, R2 oznacza wodór, d1-4-alkil, -CH2C6H5, E oznacza albo gdzie : m oznacza 2-4, R3 oznacza tlen, R4, R5, R6 oznaczają wodór, oraz jego farmaceutycznie akceptowalne sole. 2. Pochodna według zastrz. 1, w której E oznacza 15 16 PL 192 596 B1 m oznacza 2-4, R3 oznacza tlen, R4 oznacza wodór. 3. N-[etylo-2-(2-izopropyloksyfenylo)piperazynylo-4)]-N-metylo-[1'(2-oksypiperydynylo)]acetamid. 4. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik albo rozcieńczalnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera pochodną określoną w zastrz. 1. 5. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik albo rozcieńczalnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera pochodną określoną w zastrz. 3. 6. Zastosowanie pochodnej określonej w zastrz. 1 do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia łagodnego przerostu gruczołu krokowego. 7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że wytwarzany lek przeznaczony jest do podawania doustnego i zawiera on pochodną określoną w zastrz. 1 w ilości od 0,01 do 100 mg/kg masy ciała dziennie. 8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że wytwarzany lek zawiera pochodną określoną w zastrz. 1 w ilości od 0,05 do 1,0 mg/kg masy ciała dziennie. 9. Pochodna piperazyny o wzorze II w którym: A oznacza (CH2)n, gdzie n oznacza 1 lub 2, R1 oznacza C2-4-alkil, R7 oznacza wodór. 10. Pochodna według zastrz. 11, w której R1 oznacza rozgałęziony C2-4-alkil. 11. 1-(2-aminoetylo)-4-(2-izopropyloksyfenylo)piperazyna. Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.