Dwiczenie 11 Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia białka

Dwiczenie 11
Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia białka
Zasada
Białka oraz peptydy zawierające co najmniej 2 wiązania peptydowe tworzą z jonami miedzi
odczynnika biuretowego kompleksy o barwie fioletowej. Reakcja zachodzi w środowisku zasadowym.
Materiały i sprzęt
Probówki szklane, pipety szklane, spektrofotometr, papier milimetrowy, ołówek, linijka.
Odczynniki
a) Odczynnik biuretowy (roztwór CuSO 4, winian sodowo-potasowy, NaOH, KI)
b) 1% roztwór wzorca białka (albuminy)
c) 0,9% roztwór NaCl
d) Roztwór białka o nieznanym stężeniu.
Wykonanie
Do probówek oznaczonych 0-5 odmierzyd dokładnie odpowiednie objętości roztworów i
dalej postępowad zgodnie z opisem podanym w tabeli poniżej
Na papierze milimetrowym wykreślid krzywą kalibracyjną (wykres zależności absorbancji od
stężenia białka *mg/mL+ w probówkach wzorcowych)
Znając wartośd absorbancji i posługując się wykreśloną krzywą kalibracyjną, odczytad stężenia
białka *mg/mL+ w badanej próbce.
Odczynniki
Próba
zerowa 0
Próby wzorcowe o zawartości białka
[mg/ml]
2
4
6
8
10
Badana
próbka
Roztwór wzorca *mL+
-
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
-
Roztwór białka *mL+
-
-
-
-
-
-
1,0
0,9% NaCl [mL]
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
-
-
Biuret [mL]
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
Zawartośd probówek wymieszad i odstawid na ok 20 min.
Zmierzyd absorbancję próbek wzorcowych i badanej wobec próby zerowej (λ= 550 nm)
Wartośd absorbancji