Kolorymetryczne oznaczanie stężenia białek Metody

Kolorymetryczne oznaczanie stężenia białek
Metody kolorymetryczne oznaczania stężenia białek w roztworach polegają na pomiarze
absorpcji światła widzialnego przez barwne kompleksy, utworzone przez białka z
odpowiednimi odczynnikami.
Stężenie białka wyznacza się na podstawie krzywej wzorcowej, wyznaczonej z pomiarów
absorpcji szeregu roztworów o znanym stężeniu białka.
Oznaczenie stężenia białka polega na:
- utworzeniu barwnych kompleksów białka
- pomiarze absorpcji światła przy zadanej długości fali
- zlokalizowaniu zbadanej absorpcji na krzywej wzorcowej i odczycie odpowiadającego jej
stężenia białka.
Metody kolorymetryczne dają nieliniową zależność absorpcji od stężenia, ich zakres
stosowania jest ograniczony. Często konieczne jest rozcieńczanie próbek, lub stosowanie
zależności logarytmów stężeń do logarytmów absorbancji. Kolejną wadą pomiarów
kolorymetrycznych, jest ich wybiórczość w stosunku do różnych białek.
Wzorcowe roztwory białek muszą być analizowane jednocześnie i przygotowane w tym
samym buforze, w którym znajduje się badana próba, aby uniknąć zmian w absorbancji
wynikających z rozkładu odczynników, czy różnic dotyczących czasu inkubacji prób lub
temperatury otoczenia.
Metoda Bradforda
Zakres stężeń białka: 0,2 – 20 μg/ml
Długość fali światła: 595 nm
W środowisku kwaśnym chromofor (jaskrawy błękit G-250) zmienia kolor (czyli długość fali
absorbowanego światła) z 465 na 595 nm z powodu stabilizacji jego anionowej formy w
kompleksach z białkami, poprzez oddziaływania hydrofobowe i jonowe z resztami argininy i
w mniejszym stopniu histydyny, lizyny, tyrozyny, tryptofanu i fenyloalaniny.
Wykonanie ćwiczenia
Wykreślenie krzywych wzorcowych do pomiaru stężenia białka metodą Bradforda na
podstawie absorbancji wzorcowych roztworów albuminy z krwi bydlęcej i żelatyny.
Sprzęt:
- spektrofotometr
- kuwety polistyrenowe
- tryskawka
- pipeta nastawna 200 – 1000 μl
- pipeta nastawna 1 - μl
- statyw i probówki Eppendorfa
- bibuła
Odczynniki:
- stężony roztwór barwnika Jaskrawy Błękit G-250
- roztwór żelatyny o stężeniu 10 mg/ml
- roztwór albuminy z krwi bydlęcej o stężeniu 10 mg/ml
- 1M roztwór NaOH
- woda destylowana
Wykonanie:
1. Rozcieńczyć roztwór barwnika w proporcji 15 ml stężonego odczynnika i 85 ml wody
2. Przygotować roztwory białek o stężeniach: 0,01; 0,025; 0,05; 0,075; 0,1; 0,25; 0,5;
0,75; 1,0 mg/ml
3. W opisanych probówkach Eppendorfa umieścić po 1 cm3 barwnika i 20 μl
przygotowanych roztworów białek.
4. Wymieszać i pozostawić na 10 minut.
5. Przygotować próbę kontrolną (20 μl 1M roztworu NaOH i 1 cm3 barwnika).
6. Zmierzyć absorbancję prób przy długości fali 595.
7. Wyznaczyć krzywe wzorcowe.