MIKROSKOPIA FLUORESCENCYJNA Kawaska

WARSZTATY MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ
Mechanizm fluorescencji
W
wyniku
absorpcji
światła,
cząsteczka
barwnika
fluorescencyjnego przechodzi do wzbudzonego stanu
elektronowego. Wzbudzona cząsteczka na skutek oddziaływania
z otaczającymi ją cząsteczkami oddaje energię do otoczenia
w sposób bezpromienisty (bez emisji fotonu), przechodząc do
niższych poziomów oscylacyjnych, aż do najniższego poziomu
oscylacyjnego wzbudzonego stanu elektronowego. Jeśli jednak
otoczenie jest niezdolne do przyjęcia oddawanej energii,
wzbudzona cząsteczka nie może powrócić do stanu
podstawowego. Dlatego też cząsteczka taka może przetrwać w
stanie wzbudzonym wystarczająco długo, aby zaszedł proces
emisji spontanicznej, w wyniku której, w sposób promienisty
wyemitowany zostanie pozostały nadmiar energii. Pozbywanie
się nadmiaru energii odbywa się w wyniku emisji światła zwanej
fluorescencją (Ryc.2).
Ryc.2. Diagram Jabłońskiego
Ryc.1. Spektrum elektromagnetyczne wraz
z zakresem promieniowania widzialnego.
Ryc.3. Spektrum absorpcji i emisji dla barwnika FITC
Działanie mikroskopu fluorescencyjnego (Ryc.4)
Źródłem światła w mikroskopie fluorescencyjnym jest
lampa fluorescencyjna. Filtr wzbudzenia (1) przepuszcza
tylko światło o długości fali potrzebnej do wzbudzenia
fluorochromu w preparacie. Zwierciadło dichroiczne (2)
odbija światło o krótszej fali (wzbudzające), a przepuszcza
światło o dłuższej fali (emitowane przez preparat) –
rozdziela tym samym te dwie wiązki światła. Przez
obiektyw przechodzi zarówno światło wzbudzające jak i
wyemitowana fluorescencja. Drugi filtr barierowy –
emisyjny (3) przepuszcza do okularu/kamery tylko światło
wyemitowane przez specyficzny fluorochrom.
Ryc.4. Schemat budowy mikroskopu fluorescencyjnego
www.kawaska.pl
e-mail: [email protected]
Działanie mikroskopu konfokalnego (Ryc.5)
W mikroskopie konfokalnym źródłem światła są lasery. Kryształ
AOTF, pełniący funkcję pierwszego filtra barierowego, steruje
zarówno intensywnością światła lasera jak i wybiera
odpowiednią linię światła. Kryształ AOBS® spełnia rolę
zwierciadła dichroicznego rozdzielając wiązkę światła
wzbudzającego od emitowanego. W odróżnieniu od
zwierciadeł dichroicznych może obsługiwać jednocześnie wiele
linii wzbudzeń i emisji, jest programowalny elektronicznie oraz
nie zmniejsza intensywności światła przechodzącego przez
niego. Przysłony lustrzane umieszczone przed detektorami
spektralnymi® umożliwiają wybór zakresu długości światła
które ma być rejestrowane przez detektor. Działają bez użycia
filtrów (nie zmniejszają intensywności światła) z dokładnością
do 1nm.
Ryc.5. Schemat budowy mikroskopu konfokalnego Leica
(wzór 1)
d (xy) 

2n  sin 
Zasada działania systemu STED – Stimulated emission depletion (Ryc.6)
W XIX wieku Ernst Abbe opracowując teoretyczne podstawy mikroskopii świetlnej określił limit rozdzielczości jaki jest
możliwy do uzyskania w mikroskopie świetlnym. Wyraża się on powyższym wzorem (1) i w praktyce ogranicza
rozdzielczość lateralną (xy) mikroskopów do >200 nm. Innowacyjna technika STED jest pierwszą która przełamała ten
limit umożliwiając obrazowanie preparatów
z rozdzielczością 30 nm w osi XY i 120 nm
w osi Z już w komercyjnie dostępnych
systemach (Leica SP8 STED 3X).
Jest to możliwe dzięki zastosowaniu
dodatkowej wiązki światła wygaszającego
(STED beam), która podążając za wiązką
wzbudzającą
(EXC
beam),
wygasza
fluorescencję na brzegach wzbudzonego
obszaru. Wygaszenie fluorescencji zachodzi
na zasadzie emisji wymuszonej, co sprawia
że jedynie światło pochodzące z centrum
obrazowanego punktu jest analizowane
przez detektor.
Ryc.6. Schemat działania systemu STED.
Włókna aktynowe obserwowane w mikroskopie konfokalnym bez i z użyciem techniki
STED. Skala 1μm.
www.kawaska.pl
e-mail: [email protected]