Instrukcja do ćwiczeń - Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii

Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii
Wydział Farmaceutyczny z
Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Mikrobiologia ogólna
o
Biotechnologia medyczna II rok / I
Instrukcja do ćwiczeń
Temat: Metabolizm drobnoustrojów. Badanie właściwości glikolitycznych bakterii – cz. 1/cz.2
CZEŚĆ TEORETYCZNA
1. Szlaki metaboliczne rozkładu węglowodanów.
2. Oddychanie tlenowe.
3. Procesy fermentacyjne.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Do wykonania części praktycznej należy posłużyć się hodowlami następujących szczepów bakterii na
agarze krwawym:
E. coli, Ps. aeruginosa, S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, P. vulgaris
1. Mały szereg cukrowy:
Posiać szczepy E. coli, Ps. aeruginosa i S. aureus na tzw. mały szereg cukrowy (woda peptonowa
zawierająca glukozę - Glc, maltozę - Mal, laktozę - Lac, sacharozę - Sac oraz mannitol - Man w stężeniu
1% oraz wskaźnik Andrade – fuksyna kwaśna lub błękit bromotymolowy).
W tym celu pobrać ezą niewielką ilość hodowli poszczególnych szczepów bakterii i posiać do probówek
z wodą peptonową. Probówki inkubować 48 h w temperaturze 37oC. Po inkubacji ocenić wzrost
hodowli poszczególnych szczepów bakterii w probówkach i dokonać oceny zmiany barwy indykatora
(wskaźnik Andrade – zmiana barwy ze słomkowej na różową, a przypadku błękitu bromotymolowego z
niebieskiej na żółtą). Wyniki zanotować w tabeli 1.
2. Wzrost na podłożu Endo:
Wykonać posiew redukcyjny E. coli, Ps. aeruginosa i S. aureus na podłożu Endo. Płytki inkubować 48 h
w temperaturze 37oC. Po inkubacji ocenić wzrost hodowli poszczególnych szczepów bakterii. Wyniki
zanotować w tabeli 1.
Podłoże Endo jest podłożem różnicującym, zawierającym laktozę jako źródło węgla, fuksynę zasadową i
siarczyn sodowy redukujący fuksynę do bezbarwnej leukozasady. Po okresie inkubacji niektóre
drobnoustroje fermentują laktozę z wytworzeniem aldehydu octowego, który z obecną leukozasadą
tworzy barwny kompleks. Kolonie E. coli przybierają ciemno-czerwone zabarwienie z metalicznym
połyskiem, co jest "wynikiem rozkładu laktozy przez te pałeczki.
3. Odczyn VP (Voges-Proskauera) i MR (Methyl-Red):
Posiać szczepy E. coli, Ps. aeruginosa i S. aureus na podłoże Clarka. W tym celu pobrać ezą niewielką
ilość hodowli poszczególnych szczepów bakterii i posiać do probówek z podłożem Clarka
zawierającym glukozę i pepton.
Probówki na próbę VP inkubować 48 h, a probówki na próbę MR 72 h w temperaturze 37oC. Po
inkubacji ocenić wzrost hodowli poszczególnych szczepów bakterii w probówkach i wykonać
następujące oznaczenia, a wyniki zanotować w tabeli 1.
1
próba MR - sprawdzenie stopnia zakwaszenia podłoża (określenie typu fermentacji). Do
hodowli dodać kilka kropli roztworu czerwieni metylowej. Jeśli pH jest niższe niż 4,5 pożywka
zabarwia się na czerwono (odczyn MR dodatni), jeżeli pH jest wyższe niż 4,5 barwa podłoża
pozostanie żółta (odczyn MR ujemny).
próba VP - sprawdzenie wytwarzania acetoiny. Do hodowli dodać 0,6 ml 6% roztworu α-naftolu,
0,4 ml 40% roztworu KOH. Probówkę parokrotnie wstrząsnąć i umieścić na 30 minut w łaźni wodnej
w temp. 37°C. Czerwone lub wyraźnie różowe zabarwienie w górnej części podłoża świadczy o
wytwarzaniu acetoiny (odczyn dodatni).
·
·
4. Wzrost na podłożu Kliglera:
Posiać szczepy E. coli, Ps. aeruginosa i S. aureus na podłoże Kliglera, pozwalające na stwierdzenie
zdolności fermentowania laktozy i glukozy z wytworzeniem gazu lub bez, a także wytwarzania
siarkowodoru.
W tym celu pobrać igłą inokulacyjną niewielką ilość hodowli poszczególnych szczepów bakterii i
wykonać posiew kłuty i powierzchniowy podłoża Kliglera. Probówki inkubować 24 h w temperaturze
37oC. Po inkubacji ocenić wzrost hodowli poszczególnych szczepów bakterii w probówkach i
odnotować następujące zmiany, a wyniki zanotować w tabeli 1.
·
·
·
·
·
żółty skos i żółty słupek oznacza fermentację laktozy i glukozy,
niezmieniona barwa podłoża oznacza brak fermentacji obu cukrów,
czerwony skos i żółty słupek oznacza fermentację glukozy i brak fermentacji laktozy,
zaczernienie podłoża oznacza wytwarzanie siarkowodoru,
powstawanie gazu wewnątrz podłoża (niekiedy jego rozerwanie) wskazuje na wytwarzanie gazu.
5. Wzrost na podłożu Chapmana:
Wykonać posiew redukcyjny S. epidermidis i S. aureus na podłożu Chapmana. Płytki inkubować 48 h w
temperaturze 37oC. Po inkubacji ocenić wzrost hodowli poszczególnych szczepów bakterii.
Na podłożu Chapmana rosną drobnoustroje tolerujące 8% stężenie NaCl i wykorzystujące mannitol
jako źródło węgla. S.aureus w warunkach tlenowych i względnie beztlenowych wyrasta w postaci
kolonii otoczonych żółtą strefą powstałą w wyniku rozkładu mannitolu i zakwaszenia środowiska.
S.epidermidis nie rozkłada mannitolu i rośnie w postaci białych kolonii nie powodując zmiany barwy
podłoża.
Wyniki:
Tabela 1. Właściwości glikolityczne bakterii:
Szczep bakterii
Glc
Szereg cukrowy
Mal
Lac
Sac
Man
Endo
Podłoża identyfikacyjne
Clark
Kligler
VP
MR
Glc
Lac
H2S
gaz
E. coli
Ps. aeruginosa
S. aureus
2