Ćwiczenie nr 11 - Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii

Ćwiczenie nr 11 - Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii

Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii
Mikrobiologia ogólna
Biotechnologia medyczna rok II / Io
Wydział Farmaceutyczny
z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Instrukcja do ćwiczeń
Temat: Wzajemne oddziaływania między drobnoustrojami – Cz.1/Cz.2
I. Część teoretyczna
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Oddziaływanie bezpośrednie.
Oddziaływanie pośrednie: symbioza, synergizm, metabioza, antagonizm – antybioza.
Bakteriocyny, charakterystyka i mechanizm działania.
Antybiotyki i sulfonamidy.
Główne klasy antybiotyków oraz mechanizmy ich działania.
Metody badania lekooporności mikroorganizmów.
Oporność na leki przeciwbakteryjne.
Bakterie a rośliny wyższe: oddziaływanie pośrednie, oddziaływanie bezpośrednie – oddziaływanie
mutualistyczne (ryzosfera, symbioza), oddziaływanie antagonistyczne (oporność u roślin).
9. Bakterie a zwierzęta (oddziaływanie pośrednie, bezpośrednie, antagonistyczne, mutualistyczne).
II. Część praktyczna
E. coli
E. faecalis
B. subtilis


Lactococcus lactis
1. Antagonistyczne działanie bakterii mlekowych na bakterie proteolityczne
 Przygotować płytkę Petriego z agarem odżywczym.
 W środkowej części podłoża wyciąć jałowo skalpelem pasek podłoża o szerokości ok. 1 cm i usunąć
go.
 Do rozpuszczonego i ochłodzonego do 45oC agaru odżywczego z 1% laktozy (w probówkach) wysiać
0,5 ml płynnej hodowli Lactococcus lactis (48-h hodowla w wodzie peptonowej z dodatkiem
odtłuszczonego mleka lub 1% laktozy)
 Po wymieszaniu, wypełnić podłożem rowek na płytce i pozostawić do zestalenia.
 Posiać na płytce szczepy bakterii proteolitycznych E. coli, E. faecalis i B. subtilis wg poniższego
schematu:
Posiane płytki inkubować przez 48 h w temperaturze 30oC.
Po inkubacji dokonać obserwacji stopnia zahamowania wzrostu bakterii proteolitycznych na skutek
obniżenia stężenia jonów wodorowych w podłożu. Zakwaszenie środowiska powodowane przez L.
lactis, wywołane jest fermentacją laktozy z wytworzeniem kwasu mlekowego.
1
2. Antybiotyczne oddziaływanie bakterii
 Przygotować płytkę Petriego z agarem odżywczym, zawierającą 24-h hodowlą Pseudomonas
aeruginosa (posianą liniowo).
 Posiać na płytce szczepy bakterii E. coli, S. aureus i B. subtilis prostopadle do linii wzrostu P.
aeruginosa wg poniższego schematu:
P. aeruginosa
E. coli
S. aureus
B. subtilis


Posiane płytki inkubować przez 48 h w temperaturze 37oC.
Po inkubacji dokonać obserwacji stopnia zahamowania wzrostu bakterii na skutek antybiotycznego
działania piocyjaniny wytwarzanej przez szczep P. aeruginosa.
3. Symbiotyczne współżycie bakterii
 Przygotować trzy probówki z płynna pożywką zawierającą kazeinian sodu, jako jedyne źródło węgla
i azotu.
 Następnie wysiać do pierwszej probówki Bacillus subtilis, do drugiej Pseudomonas fluorescens, a
trzecią zaszczepić dwoma szczepami.
 Probówki inkubować przez 48-72 h w temperaturze 37oC.
 Po inkubacji zaobserwować różnice we wzroście bakterii (zmętnienie podłoża). Wykonać preparaty
barwione metodą Grama, a uzyskane wyniki zestawić w tabeli.
Probówka
Szczep bakterii
Wzrost
Preparat barwiony metodą Grama
(rysunek)
1
B. subtilis
2
P. fluorescens
3
B. subtilis + P. fluorescens
(+++) wzrost obfity, (++) wzrost umiarkowany, (+) wzrost słaby, (-) brak wzrostu.
4. Współdziałanie synergistyczne bakterii
 Przygotować probówki z wodą peptonową zawierającą laktozę – Lac (3 probówki), sacharozę – Sac
(3 probówki) oraz mannitol – Man (3 probówki).
 Do dwóch probówek z każdym cukrem posiać osobno szczepy bakterii S. aureus i S. enteritidis,
natomiast trzecią zaszczepić dwoma szczepami.
 Probówki inkubować przez 24 h w temperaturze 37oC.
 Po inkubacji zaobserwować różnice we wzroście bakterii i fermentacji cukrów, a uzyskane wyniki
zestawić w tabeli.
Cukier
S. aureus
S. enteritidis
Lac
Sac
Man
2
S. aureus + S. enteritidis
5. Badanie wrażliwości bakterii na antybiotyki metodą krążkową
 Pobrać za pomocą ezy materiał z 24-godz. hodowli E. coli, S. aureus i E. faecalis na płytkach z
agarem odżywczym i przenieść do probówek z solą fizjologiczną (0,85%) i przygotować zawiesiny,
których gęstość optyczna, zmierzona przy użyciu densytometru, wynosić będzie 0,125 (standard 0,5
według skali McFarlanda), co odpowiada stężeniu komórek bakterii na poziomie 1,5 × 108 /ml.
Gęstość optyczna (OD) zawiesin bakteryjnych
Standard
(wg skali
McFarlanda)
0,5
1
2
3
4
5
6
7
Stężenie komórek bakterii
x 108 / ml
OD (550 nm)
1,5
3
6
9
12
15
18
21
0,125
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
 Dla każdego szczepu przygotować płytkę z agarem odżywczym.
 Z zawiesiny wyjściowej danego szczepu przenieść na każdą płytkę po 0,1 ml i rozprowadzić
równomiernie po całej powierzchni sterylną głaszczką. Odczekać ok. 5 minut do momentu
wchłonięcia się inoculum.
 Przy użyciu jałowej pęsety rozłożyć cztery krążki z wybranymi antybiotykami na powierzchnię
pożywki i odczekać ok. 10 minut.
 Posiane płytki z krążkami poddać 24-godzinnej inkubacji.
 Odczyt: porównać wrażliwość badanych szczepów na poszczególne antybiotyki. Zmierzyć strefy
zahamowania wzrostu bakterii, wyniki zestawić w tabeli. Wyciągnąć wnioski.
Szczep
Antybiotyk / strefa zahamowania wzrostu [mm]
E. coli
S. aureus
E. faecalis
3