PRÓBA OCENY BIOMASY MIKROORGANIZMÓW W GLEBIE

PRÓBA OCENY BIOMASY MIKROORGANIZMÓW W GLEBIE

R O C Z N IK I G L E B O Z N A W C Z E T. X X X V I, N R 3, S. 67—74, W A R S Z A W A 1985
B A R B A R A KOSINKIEW ICZ
PRÓBA OCENY BIOMASY M IKROORGANIZM ÓW W GLEBIE
K atedra M ikrob iologii R olniczej A k ad em ii R olniczej w e W rocław iu
Znajomość rozm iarów m aterii organicznej zaw artej w ciałach m ikroorganizm ów i dynam iki jej przem ian jest niezm iernie ważna. Św iadczy
ona o nasileniu biologicznej sorpcji w glebie* i może być w skaźnikiem
szybkości pow staw ania próchnicy.
Biomasę m ikroorganizm ów w glebie m ożna określić znając liczebność
m ikroorganizm ów , ciężar w łaściw y kom órki i jej objętość. W yznaczenie
tych wielkości jest obciążone dużym i nieścisłościam i. Zarów no m etoda
płytkow a, jak m etoda bezpośredniego oznaczania ilości m ikroorganizm ów
w glebie odbiega od rzeczywistości ze w zględu na trudności z oddziele­
niem kom órek od koloidów glebow ych oraz zróżnicow anie w ym agań po­
karm ow ych m ikroorganizm ów [1]. Oznaczając liczebność m ikroorganiz­
m ów pod m ikroskopem otrzym uje się w ielokrotnie wyższe w yniki niż
m etodą płytkow ą [8 ]. Średnią objętość kom órek określa się od 0,4 ixm
do 0,8 м т , natom iast ciężar w łaściw y od 1,05 do 1,2 [3, 9]. Różne w iel­
kości przyjm ow anych w doświadczeniach p aram etrów o raz ogrom na
zmienność środow iska glebowego są powodem dużych różnic w w artoś­
ciach biom asy oznaczanych przez tych autorów . W ynoszą one od k ilk u
do ponad tysiąca g/m 2 [4, 5, 9]. W skaźnikam i biom asy drobnoustrojów
w glebie mogą być także niektóre związki chemiczne ch arakterystyczne
dla żyw ych kom órek, jak ATP, kwas dw uam ino-pim elinow y lub m uram inow y [10]. Oznaczenia chem iczne składników kom órek m ikroorganizm ów
są przydatne w badaniach porów naw czych ze w zględu na duże zróżni­
cowanie zaw artości tych zw iązków w kom órkach. O wielkości biom asy
można także wnioskować stosując m etody fizjologiczne [13]. W artości
biom asy uzyskane z oznaczeń liczebności m ikroorganizm ów m etodam i
fizjologicznym i i enzym atycznym i są na ogół większe niż w yniki oznaczeń
bezpośrednich [5].
Ze względu na duże znaczenie znajom ości biom asy m ikroorganizm ów
w glebie każda nowo proponow ana m etoda jej oceny jest w a rta rozw a­
żenia. Celem niniejszej pracy jest opracow anie nowego sposobu oceny
68
В. Kosinkiewicz
biom asy m ikroorganizm ów w glebie w oparciu o ekstrakcję gleby roz­
tw orem chlorku sodowego i następnie rozdział zaw artych w ekstrakcie
związków za pomocą sączenia przez żel Sephadex SE-C-25.
M ETODY B A D A Ń
Do badań użyto następujących gleb: m urszow ej, piasku gliniastego,
piasku i ogrodow ej, w ytw orzonej z piasku gliniastego na glinie średniej.
W n iektórych dośw iadczeniach glebę wzbogacano hydrolizatem kazeiny
lub gnojowicą. Dla celów porów naw czych analizow ano także glebę sk a ­
żoną pyłam i pohutniczym i wi stopmiu znacznie ograniczającym w zrost
m ikroorganizm ów , zwłaszcza bakterii. W ykonano także analizę gleby ogro­
dowej i piaszczystej po ich uprzedniej sterylizacji w autoklaw ie.
W dośw iadczeniu m odelow ym ekstrahow ano w ysuszoną do stałej w a­
gi m ieszaninę m ikroorganizm ów : Rhodotorula glutinia, E. coli9 Sarcina
lutea, A rthrobacter sp. i Bacillus sp.
E kstrakcję gleb lub kom órek m ikroorganizm ów przeprow adzono sto­
sując 0,5-procentow y roztw ór chlorku sodowego w ilości 150 cm 3 na
100 g gleby. Użycie do ek strak cji chlorku sodowego było podyktow ane
jego zdolnością do rozpuszczania kw asów nukleinow ych d białek, przy
rów noczesnym b rak u w ym yw ania kw asów hum inow ych z gleby. Po 0,5-godzinnym w ytrząsaniu i zagotow aniu glebę oddzielano na gorąco przez
bibułę filtracy jn ą, w razie potrzeby odw irow yw ano, a klarow ny przesącz
odparow yw ano do objętości około 10 cm 3. K larow ny e k stra k t w ilości
2 cm 3 wnoszono na kolum nę (30 cm/2 cm) w ypełnioną żelem Sephadex
SE-C25. W ym yw ano ją buforem fosforanow ym o pH 6 , zbierając frak cje
objętości 3 cm 3 co 3 m inuty. W yznaczano absorpcję św iatła każdej fra k c ji
przy długości fali 254 nm. Zastosow anie silnie kw aśnego kationiitu, jakim
jest Sephadex SE-C-25, było uzasadnione brakiem absorpcji kom órek
drożdży i b ak terii na tym żelu, co stw ierdzono już poprzednio [12]. L i­
czebność m ikroorganizm ów w badanych glebach oznaczono m etodą p ły t­
kow ą na pożywce z w yciągu glebowego. Biomasę m ikroorganizm ów w
badanych glebach obliczono w edług wzoru: biom asa = liczebność X śred­
nia objętość kom órki X średni ciężar właściwy, p rzy jm u jąc objętość ko­
m órki 0,35 м-m3, a ciężar w łaściw y 1,2. A nalizę chem iczną składu e k stra k ­
tów z gleb w ykonano stosując następujące oznaczenia: białko — m etodą
Low ry, cukry — m etodą antronow ą, kw asy nukleinow e — kolorym etrycz­
nie dwufenyloamiiną [ 11].
W Y N IK I B A D A Ń I W N IO SK I
Związki zaw arte w ekstrakcie z gleby rozdzielały się na żelu na dwie
frakcje: o dużej m asie cząsteczkowej (frakcie od 1 do 15) i o m n ie j­
szej m asie (frakcje od 15 do 30). Ilość związków wysokocząsiteczkow ych reprezentow ana przez pow ierzchnie pierw szego piku (rye. 1) była
Ocena biomasy mikroorganizmów gleby
69
R ye. 1. R ozdział ek stra k tó w ch lork iem sodu z g leb y
1 — mursz, 2 — humus 2 piasku, 3 — piasek gliniasty, 4 — piasek
S ep aration of so il ex tra cts w ith sodium ch lorid e fro m
J — mursh, 2 — humus horizont from sand, 3 — loamy sand, 4 — sand
większa dla gleb bogatszych w m ikroorganizm y. Stw ierdzono, że po-:
w ierzchnie pierw szych pików pozostają w dodatniej korelacji z liczeb­
nością m ikroorganizm ów oraz z ich biom asą (tab. 1 i 2). Podobne zależ­
ności stw ierdzono analizując w te n sam sposób gleby różnie użytkow ane,
w jesieni i na wiosnę (ryc. 2). W p rzypadku gleb trak to w an y ch gnojoT a b e l a
Z a l e i n o d ć m i ę d z y l i c z e b n o ś c i ą b a k t e r ii w g le b ie p i a ^ o z y e t e j , ich b i o m a s ą
i p o w i e r z c h n i a m i wyznaczonymi p r z s s n& ^vi'jzbze p i k i
R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e num be r o f b a c t e r i a i n pandy e r i l , t h e i r b i o n a s e
a n d t h e a r e a s d e t e r m i n e d by t h 9 h i g h s c c р е а ^ з
O biekt
-
T reatm ent
Liczebność
n>I n / g
Ku nbe r
m i l l ./g
Biomasa
Li ;r:nsa
f-E /s
Pow ierzchnia
piku
Pefci: a r e a
cm2
C,C CO
13,0
1 , ;20
0,470
17,5
2 ,0 0 0
0 ,8 4 0
19,5
1,820
0,76 0
1,680
1,640
o /n o
14,5
1 2 ,0
0,690
11,6
Gleba p i a s z c z y c t a p obrana wiosną
San d y s o i l t a k e n i n s p r i n g
G leba p i a s z c z y s t a pobrana j e 6 i e n i ą
S on dy s o i l t a k e n i n a u t u n n
- po i n k u b a c j i - 1 d z i e ń
a f t e r i n c u b a t i o n - 1 d ay
7 d n i - 7 d ay a
0,143
14 d r. i - 14 da y o
21 d n i - 21 d a y s
- w zb o g ao o n a h y d r o l i z a t e m k a z e i n y 1 JLnkubowana:
e n r i c h o d w i t h ca ca i. n h y d r o l y s e ï e and i n c u b a t e d :
1 dzień 1 d ay
7 dni
7 days
14 d n i
- 14 d a y a
21 d n i
- 21 d a y a
1,540
0,650
1,370
3,250
4,4 9 0
5,120
Vsp<3łobjnnlk k o r e la c ji a ię d z y biomasą i powierzchniam i piJc<5w => 0 ,9 8
Сo r r e a c t i o n c o e f f i c i e n t b e t w e e n t h e b i o n a e s an d t h e p e a k a r e s o « 0 , 9 3
1,o90
2,150
)
15,7'
10,1
14,6
19,8
1
В. Kosinkiewicz
70
T a b e l a
Z a l e ż n o ś ć m i ę d z y l i c z e b n o ś c i ą b a k t e r i i w g l e b i e o g r o d o w e j , i c h b io m as ą
i p o w i e r z c h n i a m i w yzn acz on ym i p r z e z n a j w y ż s z e p i k i
R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e number o f b a c t e r i a i n g a r d e n s o i l , t h e i r b io m aae
and п г е а з d e t e r m i n e d by .the h i g h e s t p e a k s
O biekt
-
Treatm ent
G le b a og ro do w a p o b r a n a w i o s n ą
G ar de n s o i l ta k e n i n s p r i n g
G le b a og ro d ow a p o b r a n a j e 3 i e n i ą
Ga rd en s o i l t a k e n i n aut umn
- po i n k u b a c j i
1 dzień
a f t e r inc u b atio n 1 day
7 d n i - 7 days
14 d n i - 14 d a y s
21 d n i - 21 d a y e
- w z b o ga co na h y d r o l i z a t e m k a z e i n y i i n k u b o w a n a :
e n r i c h e d w i t h c a s e i n h y d r o l y s a t e an d i n c u b a t e d :
1 dzień 1 d ay
7 dni
14 d n i
21 d n i
- 7 days
- 14 d a y s
- 21 d a y s
Liczebność
m ln/g
Nuabe r
m i l l . /g
Biomasa
Biom ass
Ji g / g
Powie r z c h n i a
piku
Peak a r e a
c«2
0,170
0,071
14,0
5, 560
2,340
31,5
9,880
4,150
32,4
4,120
13,800
3,080
1,730
1,590
21,2
1,290
1 3 ,5
12,7
1 0 ,6 4 0
12,670
18,660
4,4 7 0
5,320
7,840
8,970
62 ,4
85,6
96,0
21,350
48,3
W s p ó ł c z y n n i k k o r e l a c j i m i ęd zy bi o m a s ą i p o w i e r z c h n i a m i pików ■ 0 , 9 9
C o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t b e t w e e n t h e b i o m a s s and t h e p e a k areaa * 0 . 9 9
Numer kolejny frakcji-Subsequent A'o. of the fraction
R yc. 2. R ozdział ek stra k tó w ch lork iem sodu z gleb p obranych w io sn ą
1 — ogrodowa, 1 — piasek, oraz w jesieni: 3 — ogrodowa, 4 — piasek
S ep aration of ex tr a c ts w ith sod iu m ch lorid e from soils ta k en in spring
1 — garden soil, 2 — sand, and taken in autumn: 3 — garden soil, 4 — sand
2
Ocena biomasy mikroorganizmów gleby
71
wicą otrzym ano podobne zależności, przy czym w prow adzenie ta k boga­
tego energetycznie m ate ria łu spowodow ało wzm ożenie dynam iki rozw oju
m ikroorganizm ów oraz w zrost w artości absorbancji frak cji uw alnianych
w żelu, a zatem i stężenia związków wysoko cząsteczkow ych w ek strak ­
cie glebow ym (ryc. 3). A naliza gleb zanieczyszczonych pyłam i p o h u tn iczymi w ykazała obecność dużej ilości grzybów p rzy rów noczesnym b ra k u
bakteria. O trzym ane wysokie w artości ekstynkcji poszczególnych frak cji
Numer kolejny frakcji— Subsequent No. of the fraction
R yc. 3. R ozdział ek stra k tó w ch lork iem sodu z g leb y trak tow an ej gn o jo w icą
1 — gleba ciężka bez gnojowicy, kontrolna, 2 — z gnojowicą w ilości 40 mtyha, 3 — gleba
kontrolna lekka bez gnojowicy, 4 — z gnojowicą w ilości 40 m*/ha
S ep aration of ex tra cts w ith sod iu m ch lorid e iron so ils trea ted w ith liq u id m an u re
I — heavy soil without liquid manure, control, 2 — with liquid manure, 40 m*/ha, 3 — light
soil without liquid manure, control, 4 — with liquid manure, 40 m’/ha
(ryc. 4) dowodzą, że zw iązki zaw arte w ekstrakcie z ty ch gleb pochodzą
praw dopodobnie praw ie w yłącznie z kom órek grzybów lub też z m a r­
tw ych kom órek bakterii, nie ujaw nionych przez w ysiew na płytki. J a k
w ykazała analiza chem iczna ek strak tó w glebow ych, we frak cjach wysoko
cząsteczkowych znajdow ały się kw asy nukleinow e, p roteiny i cukry.
W yniki badań m a te ria łu kom órkow ego drożdży glebow ych i kilku
szczepów bak terii w ykazały podobne zależności jak w przypadku e k stra k ­
tów z gleb (ryc. 5), co m ogłoby sugerow ać, że w yekstrahow ane z gleb}
związki pochodzą z kom órek m ikroorganizm ów , ty m bardziej że badane
e k stra k ty nie zaw ierały żadnych związków próchnicznych, poniew aż po­
zostaw ały klarow ne po zakw aszeniu kw asem solnym do pH 2 .
A naliza gleb sterylizow anych w autoklaw ie przez 0,5 godziny przy
120 °C w ykazała, że w tych w arunkach, kiedy została zniszczona s tru k tu ra
72
B. Kasmkiewicz
Numer kdejny frakcji- Subséquent No. of the fraction
R ye. 4. R ozdział ek stra k tó w ch lork iem sodu z g leb y skażonej p y ła m i p oh u tn iczym i
1 — odległość od huty 600 m, 2 — odległość od huty 200 m
Separation s of extracts w ith sodium ch lorid e from so il p o llu ted w ith in d u strial
dusts
1 — distance from the metalurgie works 600 m, 2 — distance from the metalurgie works 200 m
R ye. 5. R ozdział ek strak tów ch lork iem
sodu z suchej m iesza n in y kom órek
bak terii i drożdży g leb ow ych (426 mg)
1 — ekstrakt z komórek z dodatkiem hy­
drolizatu kazeiny, 2 — ekstrakt z komórek
S ep aration of ex tra cts w ith sod iu m
ch lorid e from dry m atter of bacteria
c e lls and so il y ea sts (426 m g)
1 — extract from bacteria cells with added
10
20
30
Numer kolejny f r a k c ji- Subsequent Ho. o f the fraction casein hydrolysate, 2 — extract from
bacteria cells
n a tu ra ln a gleby, do e k stra k tu przechodziło znacznie więcej związków
wysoko cząsteczkowych, będących m iarą biom asy kom órek m ikroorga­
nizmów, co jest zrozum iałe ze w zględu na zm niejszenie się w ty ch w a­
ru nkach sorpcji cząsteczek koloidu glebowego.
Jakkolw iek należy zdawać sobie spraw ę z błędów w ynikających z róż­
nej efektyw ności ek strak cji gleb za pomocą chlorku sodu, w ydaje sdę,
że proponow ana m etoda może znaleźć zastosow anie w badaniach porów ­
naw czych. O pisaną m etodę stosow ano z pow odzeniem w naszym labo­
rato riu m w w ielu doświadczeniach na różnym m ateriale badaw czym ,
jak np. na glebach trak to w an y ch w ysokim i daw kam i pestycydów . W tym
przypadku stw ierdzano znaczne zaham ow anie w zrostu m ikroorganizm ów
i zm niejszenie się biomasy, przy czym na w ykresach zależności m iędzy
w artościam i ekstynkcji i num erem kolejnym frakcji uw idoczniała się
równocześnie zaw artość herbicydu w glebie [2]. Bliskie jedności w spół­
Ocena biomasy mikroorganizmów gleby
73
czynniki korelacji m iędzy liczebnością m ikroorganizm ów a pow ierzchnia­
m i pierw szych pików, odpow iadającym i w artościom biomasy, pozw alają
sugerow ać, że przedstaw iona m etoda m oże być stosow ana do porów naw ­
czych szacunkow ych oznaczeń biom asy m ikroorganizm ów w glebie.
L IT ER A TU R A
[1] B a b i u k L. A., P a u l E. A.: T he u se of flu o rescein e iso -th io cy a n a te in th e
determ ination of the b acterial biom ass of grassland soil. Can. J. of. Microbiol..
16, 1970, 57.
[2] B a l i c k a N.: The part of m icroorgan ism s in the com p lex action of p esticid es
in sugar b e e t culture. S p raw ozd an ie z prac bad aw czych w ram ach U m ow y
P ro ject No. P.L.A.R.S.-5 G rant F.G.Po.335, 1974— 1075.
[3] C h u d i a k o w J. P.: W oprosy czislen n o sti b iom asy i p rod u k tiw n osti p o czw ien n ych m ikroorganizm ow . Izdat. N auka 20, 1972, 21.
[4] C l a r k F., P a u l K.: The m icroflors of grassland soil. A d van ces A gric. 22,
1970, 30.
[5] C l a r k h o l m
M., R o s s w a l l
T.: B iom ass and tu rn over o f b acteria in
a fo rest soil and apeat. S o il Biol. B iochem . 12, 1980, 1, 49—57.
[6] D o m s с h K. H., B e c k T. H., A n d e r s o n J. P., S о d e r s t г о m В., P a r k i n s o n D., T r o l l d e n i e r G. A.: A com parison of m ethods for soil m i­
crobial p op ulation and biom ass stu d ies. Z. P flan zen ern. Bodenkd. 142, 1979,
3, 520—528.
[7] K a c z m a r e k W.: B iom asa i p rod u k tyw n ość drobnoustrojów w g leb ie. Rocz.
AR Pozn., pr. habilit. 1978.
[8] K a c z m a r e k W. , K a s z u b i a k H., G u z e k K.: The com parison of ch an ges
in the num ber of m icroorgan ism s in the soil by p late and m icroscop ic m ethods.
J. J. of S oil Sei. 6, 1973, 2, 133, 135.
[9] K a c z m a r e k W., K a s z u b i a k H'., P ę d z i w i ł к Z.: B adania nad za w a r­
tością A TP w gleb ie. S em in ariu m m ik rob iologiczn e pt.: „P rocesy m ik rob iolo­
giczn e w g leb ie”, U stroń—P oznań 1975, 26.
[10] K a s z u b i a k H., K a c z m a r e k W. , D u r s k a G.: B adania n ad rozkładem
i syntezą kom órek drobnoustrojów g leb ow ych . S em in ariu m m ik rob iologiczn e
pt. „P rocesy m ikrob iologiczn e w g le b ie”, U stroń —P oznań 1975, 83.
[11] K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i c z A.: Ć w iczenia z biochem ii. 1980.
[12] K o s i n k i e w i c z B., V a r a n k a W.: B eh aviou r of m icrob ial cells on collum n
of som e typ e of S ep h a d ex gels. J. Chrom. 114, 1975, 463— 464.
[13] L y n c h J. M., P a i n t i n g L.: C u ltivation and soil biom as. S oil Biol. Biochem .
1, 1980, 29.
Б. КОСИНКЕВИЧ
П О П Ы ТК А О Ц ЕН К И БИ О М А С СЫ М И КРО О РГА Н И ЗМ О В В П ОЧВЕ
Кафедра сельскохозяйственной микробиологии,
Сельскохозяйственной академии во Вроцлаве
Р езю м е
В статье рассматривается новый метод определения биомассы микроорганизмов в почве
путем фракционированных экстрактов 0,5% хлоридом натрия на геле Сефадекс SE-C25.
Исследования охватывали следующие виды почвы: мурш, сугилинок, гумусный слой песка,
В. Kosinkiewicz
74
песок и оглородную почву. В некоторых опытах использовали почву обогащенную гидро­
лизатом казеина или жидким навозом. С целью сравнения анализировали также почву за­
грязненную промышленными пылями.
Установлено, что соединения содержащиеся в соляном экстракте почвы, разделяются
на две главные фракции. Содержание фракций высокомолекулярных соединений коррели­
ровало с количеством микроорганизмов определяемых стандартным пластиночным методом.
Химический анализ высокомолекулярных фракций показал наличие нуклеиновых кислотбелка и сахаров. Результаты фракционирования соляного экстракта сухой массы клеток
микроорганизмов были очень сходными с результатами полученными в анализе почвы.
В связи с этим можно предполагать, что соединения содержащиеся в высокомолеку­
лярной фракции происходят из клеток микроорганизмов.
Указанный метод пригоден для оценки биомассы микроорганизмов в почве, особенно
в сравнительных исследованиях.
в.
K O S IN K IE W IC Z
A N A TTEM PT OF ESTIM ATIO N OF THE SOIL M ICRO BIAL BIO M A SS
D epartm ent of A gricu ltu ral M icrobiology, A g ricu ltu ral U n iv ersity of W rocław
Summary
A n ew m eth od of estim ation o f th e soil m icrob ial biom ass using 0.5°/o N aC l
soil extra ct on the S ep h a d ex SE-C-25 g e l is p resen ted in th e paper. M ursh soil,
clay-san d , hum us horizon of sand, san d and garden soil w ere used. In som e e x ­
perim ents soil enriched w ith casein or liq u id m anure w a s applied. To com pare
th e results, the soil p ollu ted w ith in d u strial dusts w a s tested as w ell.
It has been found that the com pounds con tain ed in th e sa lin e soil ex tra ct are
separated into tw o fraction s. The h ig h -m o lecu la r fraction co n ten t correlated w ith
the num ber of m icroorganism s determ ined b y th e standard p late m ethod.
T he chem ical a n a ly sis of h ig h -m o lecu la r fraction sh ow ed the p resen ce of
nucleic acids, protein and sugars. The resu lt of fra ctio n a tio n of th e sa lin e ex tra ct
of dry m icrob ial cells w a s v ery sim ilar to that of soil.
It can be concluded th at th e com pounds con tain ed in th e h ig h -m o lecu la r fr a c ­
tion originated from m icrobial cells.
The m ethod presen ted can be used for estim a tio n of th e m icrob ial b iom ass
in soil, p articu larly in com p arative tests.
D o c . d r h a b . B a r b a r a K o s in k ie w ic z
K a te d r a M ik r o b io lo g ii R o ln ic z e j A R
W r o c la w , u l. G r u n w a ld z k a S3
W p ły n ę ł o d o r e d a k c ji w p a ź d z ie r n ik u 1984