doc„Wewnątrzcząsteczkowe determinanty aktywności rybozymów
download 
Reklamacja Transkrypt
„Wewnątrzcząsteczkowe determinanty aktywności rybozymów
„Wewnątrzcząsteczkowe determinanty aktywności rybozymów” Marta Gabryelska Stypendystka projektu pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki Rozpoznawanie sekwencji docelowej przez kwasy nukleinowe na zasadzie komplementarności sprawia, że stanowią one obecnie obiekt intensywnych badań jako potencjalne czynniki mogące znaleźć zastosowanie w terapii genowej nowotworów. Rybozym o strukturze głowy młotka (ang. hammerhead, HHRz) ze względu na niewielkie rozmiary i dużą aktywność od 25 lat stanowi dobry model do badań relacji struktury i funkcji RNA. Coraz więcej wiadomo na temat jego budowy, dynamiki konformacyjnej oraz wpływu trzeciorzędowych motywów stabilizujących. Mechanizm reakcji transestryfikacji uwarunkowany jest odpowiednią aranżacją atomów centrum katalitycznego. Projektowane są nowe pochodne rybozymów typu hammerhead o zwiększonej aktywności, które mogą zostać wykorzystane w badaniach podstawowych i medycynie molekularnej. Celem niniejszej pracy doktorskiej było wyselekcjonowanie nowego wydłużonego rybozymu typu hammerhead wysoce aktywnego w obniżaniu ekspresji docelowych genów w warunkach komórkowych oraz określenie wewnątrzcząsteczkowych determinantów warunkujących jego właściwości. W pracy podjęto próbę wyjaśnienia aspektów strukturalnofunkcjonalnych istotnych dla mechanizmu transestryfikacji RNA z udziałem rybozymu hammerhead jako modelu w oparciu o zaproponowaną hipotezę kompensacji parametrów rdzenia katalitycznego. Zaprojektowano rybozymy typu hammerhead przeprowadzające specyficzną transestryfikację mRNA genów GFP oraz DNMT1 oraz przeanalizowano ich aktywność in vitro oraz w liniach komórkowych. Wyselekcjonowany wariant uniwersalny rybozymu (HH5U) zastosowano do obniżania poziomu ekspresji dwóch genów docelowych GLI1 oraz CRYAB. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że ograniczenie dostępności miejsca docelowego w mRNA w komórce nie jest jedynym czynnikiem determinującym różnice w aktywności rybozymów. Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego Przeprowadzono weryfikację struktury drugorzędowej badanych cząsteczek. Projektowanie RNA w oparciu o dowolne łączenie bloków o danej strukturze zostało wsparte modelowaniem struktury drugorzędowej w oparciu o minimalizację energii swobodnej oraz weryfikację metodami chemicznymi i enzymatycznymi. Wykorzystując symulacje komputerowe oraz analizy obliczeniowe rybozymów w kompleksie z substratami stwierdzono, że nawet najmniejsze różnice w sekwencji rybozymów (już od 1 nukleotydu) oddalonej od centrum katalitycznego mogą silnie wpływać na jego własności. Ustalono wewnątrzcząsteczkowe determinanty aktywności katalitycznych RNA na przykładzie rybozymów typu hammerhead, stanowiące zdefiniowane odległości oraz kąty pomiędzy zdefiniowanymi atomami centrum katalitycznego. Na podstawie obliczeń parametrów centrum katalitycznego oszacowano unikalny profil („odcisk palca”) geometrycznymi rybozymu. Oszacowano parametrami cząsteczek prawie oraz ich całkowitą korelację właściwościami pomiędzy katalitycznymi. Stwierdzono, że oddalenie G12(N1) od C17(2’O) oraz przybliżenie G8(2’O) do C1.1(5’O) jest parametrem umożliwiającym przewidywanie wewnątrzkomórkowej aktywności rybozymów (Rys.1.). Rys.1. Wykorzystanie unikalnego „odcisku palca” rybozymu do przewidywania wewnątrzkomórkowej aktywności cząsteczki. Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego Istotnym osiągnięciem tej pracy jest zaproponowanie wysoce skutecznego w układzie zywym rybozymu hammerhead jako narzędzia terapii genowej. Opracowano metody projektowania rybozymów w oparciu o hipotezę kompensacji parametrów rdzenia katalitycznego. Szersze rozpatrywanie zagadnienia zależności struktury i funkcji oraz wzbogacenie jej o badanie wpływu elementu sekwencji i oparcie w metodach obliczeniowych umożliwia powrót do badań nad rybozymami w odświeżonym kontekście. Zaproponowana metoda obliczeniowa stanowi pierwsze podejście in silico do przewidywania wewnątrzkomórkowej aktywności RNA. Może ona znaleźć szerokie zastosowanie do projektowania innych RNA o sprecyzowanej funkcji. Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
