LAB 6
Transkrypt
LAB 6
POZYSKIWANIE PRODUKTÓW W BIORAFINERIACH LABORATORIUM 6 WPŁYW STĘŻENIA KWASU W METODZIE OBRÓBKI WSTĘPNEJ BIOMASY LIGNOCELULOZOWEJ NA EFEKTYWNOŚĆ HYDROLIZY CELULOZY I HEMICELULOZY. CEL ĆWICZENIA: celem ćwiczenia jest zbadanie wpływu stężenia katalizatora kwasowego na wydajność hydrolizy surowca lignocelulozowego – rozkład celulozy oraz hemicelulozy. SUROWIEC i ODCZYNNIKI MATERIAŁY i APARATURA Otręby pszenne Kolby stożkowe 250 mL; Kwas siarkowy(VI)/ kwas solny (0,1–1,0 M) Wytrząsarka termostatowana z regulacją temperatury i intensywnością mieszania; Zasada sodowa (0,1–1,0 M) Zestaw probówek plastikowych do pobierania próbek i testu z odczynnikiem różowym (poj. 10 mL); Odczynnik DNS Odczynnik różowy WYMAGANE ŚRODKI BEZPIECZEŃSTWA Zestaw probówek szklanych do testu DNS (poj. 20 mL); Fartuch Okulary ochronne Zlewki; Rękawiczki lateksowe Cylinder miarowy 100 mL; Waga analityczna; 1. PRZYGOTOWANIE DO DOŚWIADCZENIA - statyw z plastikowymi probówkami dla badania postępu reakcji ponumerowanymi od 0 do 9 oraz dla próby kontrolnej od 0’ do 9’. - do próbówek 0-9 należy dodać roztwór zasady w takim stężeniu (objętości) aby zneutralizować kwas wykorzystany w reakcji. - statyw z ponumerowanymi probówkami do testu z odczynnikiem różowym i DNS w ilości takiej aby z każdej pobranej próbki możliwe było wykonanie dwóch powtórzeń. Procedura na oznaczanie cukrów redukujących i glukozy podane są poniżej. 1 TEST DNS (analiza na obecność glukozy i innych cukrów redukujących) Do 0,5 mL roztworu zawierającego glukozę o stężeniu 0,1 – 2,0 g/L dodać 1,5 mL odczynnika DNS i próby wstawić na 5 min do 100 °C. Następnie próby ochłodzić, dodać 8 mL wody destylowanej i po 25 min od wyciągnięcia z łaźni zmierzyć absorbancję przy 550 nm względem próby kontrolnej. Do kontroli zamiast roztworu cukru dodaje się 0,5 mL wody, a następnie próbkę tą traktuje się jak wszystkie pozostałe. Równanie krzywej: Abs=0,634∙Cred[g/L] – 0,01 Oznaczanie stężenia glukozy testem enzymatycznym. Zasada metody. Glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej utlenia się do kwasu glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Ten ostatni reaguje w obecności peroksydazy z kwasem hydrobenzoesowym (HBA) i 4-aminoantypiryną (AAP) tworząc czerwony barwnik chinonoiminę, którego intensywność zabarwienia mierzona przy długości fali 500 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce. Glukoza + O2 + H2O Oksydaza glukozowa H2O2 + HBA + AAP Peroksydaza kwas glukonowy +H2O2 chinonoimina + 4 H2O Odczynniki: Odczynnik I (składniki aktywne: oksydaza glukozowa, peroksydaza, AAP, HBA, bufor fosforanowy), stabilizowany standard glukozy. Z odpowiednio rozcieńczonej próbki pobrać 10 μl do 1 ml odczynnika zawierającego oksydazę glukozową (Glukoza OXY DST, Alpha Diagnostics), inkubować przez 5 min w 37oC, a następnie mierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm. Równanie krzywej: Abs=0,371∙Cgluk [g/L] – 0,109 2. WYKONANIE DOŚWIADCZENIA 1. Kolba do reakcji – surowiec + r-ór kwasu 2. Kolba kontrolna – surowiec + woda Kwaśna hydroliza surowca lignocelulozowego: Do kolb 250 mL zawierającej 5 g otrębów pszennych zwilżonych 20 mL wody należy dodać 100 mL kwasu siarkowego(VI) o stężeniu podanym przed prowadzącego w zakresie 0,1-1,0 M. 2 Start procesu rozpoczyna się w momencie dodania kwasu (należy włączyć stoper). Natychmiast po wlaniu kwasu pobrać próbkę 1,0 mL (próbka w czasie t=0 min) i zneutralizować ją roztworem zasady. Włączyć wytrząsanie. Hydrolizę należy prowadzić w temperaturze 60 °C przez 60-120 minut z intensywnością mieszania 100-200 obr/min. Próbki należy pobierać w 0, 4, 8, 12, 16, 20, 40, 60, 90 (120) min i neutralizować zasadą, za każdym razem wyłączając wytrząsanie na czas pobierania. Analogicznie należy postępować z kolbą kontrolną z tym, że pobrane próbki nie należy neutralizować zasadą, czyli w momencie dodania wody, należy pobrać próbkę zerową (~1,5 mL), następnie próbki pobierać w 0, 4, 8, 12, 16, 20, 40, 60, 90 (120) min. Wszystkie próbki należy odwirować 6000 rpm przez 10 min i supernatant wykorzystać do oznaczeń – DNS i odczynnik różowy. Po zakończeniu reakcji otręby oddzielić od fazy ciekłej na sitku i przemywać wodą destylowaną porcjami 3 x 100 mL. Przemyte otręby przenieść na zważoną szalkę Petriego i wysuszyć do stałej masy w temp. 70 °C przez około dobę i zważyć. 3. OPRACOWANIE WYNIKÓW: KOLBA Z REAKCJĄ t [min] V próbki [mL] V NaOH [mL] R Test DNS Abs1 Test DNS Abs2 R Stężenie cukrów redukujących, Cred [g/L] 3 Test odczynnik różowy Abs1 Test odczynnik różowy Abs2 R Stężenie glukozy, Cgluk [g/L] R- rozcieńczenie; KOLBA KONTROLNA t [min] V próbki [mL] V NaOH [mL] R Test DNS Abs1 Test DNS Abs2 R Stężenie cukrów redukujących, CredK [g/L] Test odczynnik różowy Abs1 Test odczynnik różowy Abs2 R Stężenie glukozy, CglukK [g/L] R- rozcieńczenie; CredK, CglukK [g/L] należy policzyć z krzywych wzorcowych wykonanych na pierwszych zajęciach uwzględniając rozcieńczenie próbki. 1. Uwzględnić ilość cukrów pochodzących z kolby kontrolnej CredK i CglukK. Stężenie cukrów pochodzące z reakcji hydrolizy: Stężenie rzeczywiste wszystkich cukrów redukujących: Crz,red = Cred - CredK [g/L] Stężenie rzeczywiste glukozy: Crz,gluk = Cgluk – CglukK [g/L] 2. Przedstawić przebieg reakcji hydrolizy na wykresie Crz,red = f(t) i Crz,gluk = f(t) i wyznaczyć maksymalną szybkość reakcji uwalniania cukrów redukujących i glukozy; 3. Dla użytych stężeń kwasu siarkowego(VI) porównać szybkość reakcji hydrolizy składników zawartych w surowcu. Należy przyjąć, że celuloza jest jedynym składnikiem dającym cząsteczki glukozy, natomiast hydroliza hemicelulozy uwalnia wszystkie pozostałe cukry redukujące. Stąd, stężenie oznaczone za pomocą odczynnika różowego będzie odpowiadało hydrolizie wyłącznie celulozy, a różnica Crz,red - Crz,gluk będzie odpowiadała stężeniu cukrów budujących hemicelulozę. 4. Na podstawie masy [g] (wysuszonej i zważonej) próbki po hydrolizie należy obliczyć i określić efektywność hydrolizy kwasowej: (mpoczątkowa – mkońcowa)/ mpoczątkowa *100% 4