streszczenie (PL) - Instytut Chemii Bioorganicznej

streszczenie (PL) - Instytut Chemii Bioorganicznej

Instytut Chemii Bioorganicznej
Polskiej Akademii Nauk
w Poznaniu
mgr inż. Małgorzata Marcinkowska-Swojak
„Opracowanie i zastosowanie nowej metody
do genotypowania powszechnego polimorfizmu liczby kopii
w genomie człowieka”
Praca doktorska
wykonana pod kierunkiem
dr hab. Piotra Kozłowskiego, prof. IChB PAN
w Instytucie Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu
Niniejsza praca doktorska była w całości finansowana z grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa
Wyższego Nr N N302-278937.
W trakcie realizacji pracy doktorskiej, autorka dwukrotnie była stypendystką w ramach projektu pt.
„Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia
rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki finansowanego ze
środków Europejskiego Funduszu Społecznego.
STRESZCZENIE
Zmienność liczby kopii w genomie człowieka jest w ostatnich latach intensywnie
badanym zjawiskiem. Warianty liczby kopii (CNV) definiowane są jako segmenty DNA
(około 1kpz-1Mpz długości), które wykazują zmienną liczbę kopii w porównywanych
genomach. CNV przyjmują formę delecji, duplikacji, wielokrotnych duplikacji lub bardziej
złożonych rearanżacji. Powszechne CNV obejmują około 10% ludzkiego genomu, zawierając
setki genów, sekwencji regulatorowych i innych funkcjonalnych elementów genomu. Chociaż
większość CNV ma prawdopodobnie neutralny charakter, odkrywanych jest coraz więcej
CNV wpływających na ludzki fenotyp, w tym zdrowie człowieka. Dotychczas opracowano
wiele metod służących do identyfikacji i analizy CNV zarówno w skali całego genomu, jak
i pojedynczych CNV, jednakże wciąż istnieje potrzeba opracowania precyzyjnej i niedrogiej
metody, pozwalającej na jednoznaczne genotypowanie wybranych CNV w dużej liczbie
próbek.
Z tego względu opracowaliśmy nową metodę genotypowania CNV, która
wykorzystuje podstawowe założenia metody zależnej od ligacji multipleksowej amplifikacji
sond (MLPA). Jednak, w porównaniu z oryginalną wersją metody MLPA, w której
wykorzystuje się długie sondy generowane w specjalnie przygotowanych wektorach, nasza
strategia wykorzystuje krótkie oligonukleotydowe sondy, które można otrzymać na drodze
chemicznej syntezy. Pozwala to zaprojektować sondy i przygotować testy MLPA dla
praktycznie dowolnie wybranego miejsca w genomie.
Modelem badawczym dla opracowanej metody były regiony CNV, obejmujące geny
ludzkich mikroRNA (CNV-miRNA), które zidentyfikowaliśmy i scharakteryzowaliśmy
z wykorzystaniem narzędzi bioinformatycznych. Dla wybranych CNV-miRNA
zaprojektowaliśmy testy MLPA. Opracowane testy pozwoliły eksperymentalnie
zidentyfikować oraz scharakteryzować wybrane CNV-miRNA pod kątem zmienności liczby
kopii w trzech populacjach ludzkich. Przeprowadzona analiza jakości wykazała dużą
powtarzalność i rzetelność genotypów przypisanych z wykorzystaniem opracowanej metody.
Proponowaną metodę wykorzystaliśmy również do analiz wielo-allelicznych CNV
związanych z powszechnymi chorobami człowieka, a także do połączonej analizy zmienności
liczby kopii i małych mutacji w genie EGFR.
Zaproponowana przez nas metoda genotypowania CNV obejmuje projektowanie
i generowanie sond oraz testów MLPA, optymalizację i wykonanie reakcji MLPA, a także
analizę i interpretację uzyskanych wyników. Metoda ta pozwala na opracowanie testów do
analizy dowolnie wybranego regionu w genomie oraz na genotypowanie zarówno prostych,
jak i złożonych CNV. Relatywnie niski koszt sprawia, że metoda ta jest atrakcyjna do
genotypowania poszczególnych CNV w dużej liczbie próbek, często wymaganej w badaniach
genetycznych.