Małgorzata Marcinkowska

„Nowa metoda do genotypowania powszechnego polimorfizmu
liczby kopii (CNV) w genomie człowieka”
Małgorzata Marcinkowska
Stypendystka projektu pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za
strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu
Operacyjnego Kapitał Ludzki
Ukończenie w 2003 roku projektu poznania ludzkiego genomu, przyczyniło się do
podjęcia licznych badań, mających na celu identyfikację czynników genetycznych,
odpowiedzialnych za powszechne cechy człowieka. Początkowo zakładano, że główną
przyczyną zmienności w populacji ludzkiej jest polimorfizm pojedynczych nukleotydów
(SNP). Chociaż dzięki analizie asocjacji zidentyfikowano setki SNP skorelowanych z
chorobami człowieka, to jednak wykryte sygnały asocjacji tłumaczą zaledwie część
szacowanej zmienności genetycznej, a w wielu przypadkach pomimo wykrycia sygnału
asocjacji, nie udało się zidentyfikować funkcjonalnych wariantów sekwencji, faktycznie
modyfikujących ryzyko choroby. Nowe spojrzenie na polimorfizm genomu człowieka pojawiło
się w 2004 roku, kiedy to wykazano, że duże zmiany strukturalne powszechnie występują w
ludzkim genomie. Polimorfizm ten, zwany zmiennością liczby kopii (ang. copy number
variation, CNV) obejmuje segmenty DNA o wielkości od około 500 pz do nawet 1 mln pz, w
których obserwuje się relatywne zwiększenie lub zmniejszenia liczby kopii w porównywanych
genomach. Dotychczas wykazano, że CNV ze względu na swoją powszechność oraz
strukturę, ma znaczący udział w zmienności genomu człowieka, a liczne CNV skorelowane
są z występowaniem u człowieka chorób nowotworowych (np. raka piersi) [Holst 2007 Nat
Genet], podatnością na infekcje (np. wirusem HIV) [Gonzalez 2005 Science] oraz
predysponują do powszechnie występujących chorób (np. łuszczycy, osteoporozy) [Hollox
2008 Nat Genet; Yang 2008 AJHG]. Prowadzone nad CNV badania wykorzystują głównie
metody całogenomowe (m.in. aCGH, macierze SNP), które jednak są drogie i umożliwiają
analizę jedynie ograniczonej liczby próbek, ponadto są zbyt nieprecyzyjne oraz nie pozwalają
na oszacowanie dokładnej liczby kopii danego CNV w pojedynczej próbce. Konieczność
opracowania metody, która pozwoli na efektywne i precyzyjne genotypowanie (określenie
liczby kopii) CNV w dużej liczbie próbek DNA człowieka jest dyskutowana w licznych
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
artykułach z dziedziny genetyki (McCaroll and Altshuler 2007, Nature Genetics; McCaroll
2008, Nature).
W związku z powyższym w ramach pracy doktorskiej, podjęłam się opracowania
metody do genotypowania CNV, która spełni kryteria wysokiej precyzyjności oraz niskiej
ceny, tym samym umożliwi zastosowanie jej do analizy dużej liczby próbek DNA. Podstawą
opracowywanej strategii jest opisana w 2002 roku metoda MLPA (Schouten et al. 2002,
NAR). Metoda ta jest obecnie stosowana niemalże wyłącznie do identyfikacji dużych mutacji
w genach związanych z chorobami człowieka (m.in. geny DMD, BRCA1, BRCA2, NF1,
MLH1 i MSH2). Jednak zastosowania tej metody w znacznym stopniu ograniczają się do
genów objętych komercyjnie dostępnymi testami, dostarczanymi przez firmę MRC-Holland.
Ograniczenie to wynika głównie ze skomplikowanego i kosztownego systemu generowania
długich sond w specjalnie przygotowanych wektorach. Proponowana przeze mnie strategia
pozwala na opracowanie testów MLPA, składających się w całości z krótkich sond, które
można wygenerować na drodze chemicznej syntezy. Pozwala to zaprojektować test dla
dowolnego miejsca w genomie i umożliwia swobodny wybór obiektów badawczych, co
znacznie poszerza wachlarz zastosowań metody MLPA.
Analiza zmienności liczby kopii w asocjacji z powszechnie występującymi chorobami
człowieka będzie miała duże znaczenie medyczne, zarówno w zrozumieniu mechanizmów
patogenezy oraz rozpoznaniu czynników biorących udział w patogenezie, jak i w bardziej
precyzyjnym rozpoznaniu indywidualnego ryzyka czy podatności na choroby. Opracowane
według proponowanej strategii testy będą mogły znaleźć zastosowanie w analizach dowolnie
wybranych polimorfizmów CNV o dużym potencjale funkcjonalnym i znaczeniu dla zdrowia
człowieka. Ponadto będą mogły służyć do analizy genów i mutacji somatycznych w
niestabilnych genomach nowotworowych. Opracowane testy mają znaczenie przede
wszystkim jako ważne narzędzie badawcze, ale również, po spełnieniu odpowiednich
warunków, będą mogły być stosowane w celach diagnostycznych w różnych laboratoriach,
tak w Wielkopolsce, jak i w całej Polsce czy za granicą.
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego