Białka rekombinowane i ukierunkowana mutageneza (2011/2012)

INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
Instrukcja do ćwiczeń nr 1 i 2
Modyfikacja genu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody
Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków)
CEL
Wprowadzenie mutacji punktowych do genu blgB: zamiana kodonu dla Leu 1 na Ala,
zamiana kodonu dla Ile 2 na Ser i zamiana kodonu dla Val 92 na Phe. Dodatkowo,
wprowadzenie miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych NdeI oraz KpnI, odpowiednio, na
początku i na końcu genu.
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1) Na czym polega metoda Overlap Extension PCR?
2) Czynniki wpływające na wydajność PCR.
MATERIAŁY
W EKTOR
 pMAT/blgB – wektor zawierający niezmodyfikowany gen blgB (matryca do reakcji PCR)
STARTERY




blgB V92F FOR
blgB V92F REV
blgB NdeI AS FOR
blgB KpnI REV
ODCZYNNIKI








termostabilna polimeraza DNA Pfu (ThermoScientific, http://www.thermoscientificbio.com)
bufor Pfu + MgSO4 (ThermoScientific)
dNTP (ThermoScientific), mieszanina deoksynukleotydów
woda destylowana (Polfa)
standard do elektroforezy GeneRulerLowRange DNA Ladder, 25-700 bp (ThermoScientific)
bufor obciążający do próbek (ThermoScientific)
bufor TAE do elektroforezy DNA
agaroza Basica LE (Prona) do przygotowania żeli
SPRZĘT LABORATORYJNY






pipety automatyczne
termocykler
termoblok
aparat do elektroforezy horyzontalnej z zasilaczem
transiluminator
mikrowirówka
ZESTAWY
 Gene Elute – Gel Extraction Kit (Sigma) – zestaw do izolacji DNA z żelu agarozowego
1
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
WYKONANIE ĆWICZENIA
I.
W małych probówkach (poj. 0,2 ml) przygotować roztwory do dwóch reakcji PCR.
Uwaga: Wszystkie odczynniki należy trzymać w temperaturze około 0°C!
PCR 1
woda destylowana
bufor Pfu + MgSO4 (10 x stęż.)
DNA matrycowy (pMAT/blgB, 50 ng/µl)
blgB V92F FOR (50 µM )
blgB KpnI REV (50 µM)
dNTP (10 mM)
polimeraza Pfu (2,5 u/µl)
36,0 µl
5,0 µl
1,0 µl
1,0 µl
1,0 µl
1,0 µl
5,0 µl
PCR 2
36,0 µl
5,0 µl
1,0 µl
1,0 µl
1,0 µl
1,0 µl
5,0 µl
woda destylowana
bufor Pfu + MgSO4 (10 x stęż.)
DNA matrycowy (pMAT/blgB, 50 ng/µl)
blgB V92F REV (50 µM)
blgB NdeI AS FOR (50 µM)
dNTP (10 mM)
polimeraza Pfu (2,5 u/µl)
II.
Zaprogramować termocykler według poniższego schematu:
NR
1
2
3
4
5
TEMPERATURA
95°C
95°C
45°C
72°C
4°C
CZAS
3 min
30 s
30 s
30 s
∞
←
Liczba cykli
2
24
III.
Przygotować 100 ml 2-procentowego roztworu agarozy w buforze TAE. Złożyć
pojemnik do wylania żelu. Rozpuścić agarozę w kuchence mikrofalowej, wylać żel do
pojemnika (ok. 70 ml). Do lekko przestudzonego żelu dodać 5 ul roztworu barwnika
Midori Green. Zamocować plastikowy grzebień. Pozostawić żel do zastygnięcia.
IV.
Włączyć termoblok. Ustawić temperaturę grzania na 50°C.
V.
Po zakończeniu reakcji PCR dodać do próbek 8 µl buforu obciążającego. Umieścić
żel w aparacie do elektroforezy. W razie konieczności uzupełnić ilość buforu TAE do
wskazanego poziomu. Przenieść próbki do studzienek w żelu. Do osobnej studzienki
nanieść 5 µl standardu. Przeprowadzić elektroforezę.
VI.
Przygotować 2 probówki o pojemności 1,5 ml, zważyć je i podpisać: PCR1 oraz
PCR2.
VII.
Po zakończeniu elektroforezy sfotografować żel. Zdjęcie zapisać w folderze
ĆWICZENIA IB1 2014_15. Następnie położyć żel na transiluminatorze i przy pomocy
czystego skalpela wyciąć z żelu prążki zawierające produkty PCR o odpowiedniej
wielkości. Paski agarozy przenieść do zważonych probówek.
2
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
VIII.
Wyizolować DNA z agarozy stosując zestaw Gel-Out. Procedurę oczyszczania DNA
przeprowadzić zgodnie z instrukcją podaną przez producenta zestawu. Do
wymywania DNA z kolumny użyć wody destylowanej. Probówki z oczyszczonym DNA
dokładnie podpisać z boku na matowym polu wg zamieszczonego wzoru: PCR1 lub
PCR2, nr grupy.
IX.
Zmierzyć stężenie wyizolowanego DNA przy pomocy przystawki NanoQuant do
czytnika płytek TECAN Infinite 200 (w przypadku niewystarczającej ilości ta czynność
może zostać wykonana przez prowadzącego ćwiczenia). Stężenie DNA zapisać na
probówce z próbką.
X.
Przygotować roztwór dla trzeciej reakcji PCR.
PCR 3
woda destylowana
x µl
produkt PCR1 (V92F–KpnI) (100 ng) x µl
produkt PCR2 (NdeI –V92F) (100 ng) x µl
blgB NdeI AS FOR (50 µM)
1,0 µl
blgB KpnI REV (50 µM)
1,0 µl
bufor Pfu + MgSO4 (10 x stęż.)
5,0 µl
dNTP (10 mM)
1,0 µl
polimeraza Pfu (2,5 u/µl)
5,0 µl
XI.
XII.
XIII.
Ponownie uruchomić termocykler, przeprowadzić PCR korzystając z uprzednio
wprowadzonego programu:
Po zakończeniu reakcji PCR dodać do probówki 8 µl buforu obciążającego.
Przeprowadzić elektroforezę produktów PCR 3 wykorzystując do tego żel przygotowany przez prowadzącego ćwiczenia.
Wyizolować zmodyfikowany gen blgB z agarozy stosując zestaw Gene Elute – Gel
Extraction. Probówki z oczyszczonym DNA dokładnie podpisać z boku na matowym
polu wg zamieszczonego wzoru: PCR3 A1S2 V92F, nr grupy.
3
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
MATERIAŁY POMOCNICZE
MAPA WEKTORA EKSPRESYJNEGO pETDuet-1
4
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
SEKWENCJA NUKLEOTYDOWA GENU blgB
TTACCCAGAC
CAATGGCAGC
TTGAAGAACT
ATGGTGAATG
AAATCGATGC
TGCTGTTCTG
TTCGTACACC
TGCCGATGCA
AA
ATGCTGATTG
TATAGCCTGG
CGTGTTTATG
AAATGGGAAA
GCAGTGTTTA
AAAAAATACC
CAGTGTCTGG
CTGAAAGCCC
TGCCATATCT
CATGAAAGGT
AAGCGATATT
GAAACCGACA
TGCCCAGAAA
CCTGAATGAA
CATGGAAAAT
GGAAGTTGAT
TATTCGTCTG
CTGGATATTC
AGCCTGCTGG
CCGGAAGGTG
AAAATCATTG
AACAAAGTTC
AGCGCAGAAC
GATGAAGCAC
AGCTTTAATC
AGAAAGTTGC
ATGCACAGAG
ATCTGGAAAT
CCGAAAAAAC
TGGTTCTGGA
CGGAACAGAG
TGGAAAAATT
CGACCCAGCT
AGGCACCTGG
CGCACCGCTG
TCTGCTGCAG
CAAAATTCCG
CACCGATTAC
CCTGGCATGT
CGACAAAGCA
GGAAGAACAG
SEKWENCJE ROZPOZNAWANE PRZEZ ENZYMY RESTRYKCYJNE
NdeI
5'- C A ^ T A T G -3'
KpnI
5'- G G T A C ^ C -3'
TABELA Z KODEM GENETYCZNYM
Pierwszy
Drugi
U
C
A
G
Trzeci
U
Phe
Phe
Leu
Leu
Ser
Ser
Ser
Ser
Tyr
Tyr
Stop
Stop
Cys
Cys
Stop
Trp
U
C
A
G
C
Leu
Leu
Leu
Leu
Pro
Pro
Pro
Pro
His
His
Gln
Gln
Arg
Arg
Arg
Arg
U
C
A
G
A
Ile
Ile
Ile
Met/Start
Thr
Thr
Thr
Thr
Asn
Asn
Lys
Lys
Ser
Ser
Arg
Arg
U
C
A
G
G
Val
Val
Val
Val**
Ala
Ala
Ala
Ala
Asp
Asp
Glu
Glu
Gly
Gly
Gly
Gly
U
C
A
G
WYTYCZNE DO SPRAWOZDANIA NR 1
Sprawozdanie (pisane w grupach dwuosobowych) powinno zawierać:
a) krótki wstęp teoretyczny (maksimum pół strony) dotyczący białka BLG-B
i metody OE PCR oraz cel przeprowadzonych doświadczeń,
b) skrótowy opis doświadczeń przeprowadzonych na ćwiczeniach nr 1 i 2,
c) wyniki poszczególnych doświadczeń oraz komentarz do wyników (rezultat PCR
– zdjęcia żeli, ilość DNA uzyskanego po oczyszczaniu),
d) sekwencje i charakterystykę samodzielnie zaprojektowanych starterów wprowadzających 3 mutacje do genu blgB oraz umożliwiających wklonowanie zmodyfikowanych genów do wektora pET DUET-1/dsbC,
e) odpowiedzi na pytania zamieszczone poniżej,
5
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
f)
bibliografię (oraz nazwy programów do projektowania starterów, jeśli takie były
wykorzystywane).
PYTANIA DO SPRAWOZDANIA NR 1
Dwa bufory najczęściej wykorzystywane w elektroforezie DNA to TAE oraz TBE:
a) proszę wymienić ich skład,
b) określić rolę poszczególnych związków wchodzących w skład buforów,
c) wymienić zalety i wady obu buforów,
d) podać informację, na jakiej wysokości należy się spodziewać prążków pochodzących
od barwników wykorzystywanych w buforach obciążających t.j. błękitu
bromofenolowego i cyjanolu ksylanowego w 2-procentowym żelu agarozowym,
odpowiednio – w buforach TBE i TAE.
6