Nr kat. IR657

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
Estrogen Receptor α
Clone 1D5
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR657
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti- Human Estrogen Receptor α, klon 1D5, Ready-to-Use (Link), jest
przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciała znakują komórki
dodatnie na obecność estrogenowego receptora α i są przydatne w ocenie statusu receptorów estrogenowych w
ludzkich rakach sutka (1–3). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez
badania morfologiczne, z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych, i powinna być przeprowadzana przez
doświadczonego patologa, z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy antygenu
ERα
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Receptory steroidowe wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla ligandów. Ludzki receptor estrogenowy (ER)
jest białkiem dimerycznym o masie 65 kDa, zlokalizowanym najczęściej w błonie jądrowej. NaleŜy do klasy białek
działaniu trans – pobudzających transkrypcję przez wiązanie z określonymi elementami DNA, określanymi równieŜ
jako elementy odpowiedzi hormonalnej. PoniewaŜ po związaniu białka następuje indukcja receptora ER i stymulacja
transkrypcji, receptor estrogenowy określa się mianem indukowalnego czynnika pobudzającego (4, 5).
W badaniach z ubiegłych lat wykazano korelację stanu receptora estrogenowego ER z wynikami przypadków
nieleczonych (np. prognozowanie dobrze zróŜnicowanego inwazyjnego raka sutka) i odpowiedzią na leczenie
antyhormonalne, np. leczenie tamoksifenem. Stwierdzono, Ŝe estrogeny przede wszystkim koncentrowały się
narządach docelowych estrogenu zwierząt i ludzkim raku sutka oraz udokumentowano w stopniu dobrym mitogenny
wpływ estrogenu za pośrednictwem receptora estrogenowego ER. Na podstawie badań mechanizmu biologicznego
wzrostu raka sutka, stwierdzono Ŝe szybkość wzrostu zaleŜy od obecności estrogenu lub progesteronu oddzielnie
lub razem w większości wystąpień raka sutka (5). Tak więc stan receptora estrogenowego w przypadku raka sutka
jest uwaŜany za potwierdzony czynnik prognostyczny podczas postępowania z pacjentami w leczeniu
antyhormonalnym (5, 6).
Patrz dokument “Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych” firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciało monoklonalne jest dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym
białko stabilizujące i azydek sodu w stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: 1D5 (7). Izotyp: IgG1, kappa.
Immunogen
Rozpuszczalny, rekombinowany, ludzki receptor estrogenowy (7).
Swoistość
Przeciwciało swoiście reaguje z ERα i nie wykazuje Ŝadnej reakcji z ERβ (8, 9). Epitop jest zlokalizowany na końcu
N domeny (region A/B) ERα. W testach metodą Western blot z uŜyciem ekstraktów białkowych z komórek COS
transfekowanych wektorem plazmidowym o ekspresji ER, linii komórkowej MCF-7 ludzkiego raka sutka i ludzkiej
tkanki endometrium, przeciwciało znakuje polipeptyd o masie cząsteczkowej około 67 kDa, odpowiadający ER. Nie
zaobserwowano znakowania komórek COS transfekowanych plazmidem zawierającym deletowaną mutację o
brakującej sekwencji, kodującej region A/B ER (7).
W badaniach immunohistochemicznych wykazano, Ŝe przeciwciało reaguje z białkowym odpowiednikiem ERα u
szczurów (8).
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
(121214-004)
IR657/PL/SSM/2012.03.21 str. 1/3
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta, naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem
z przeciwciałem, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie
próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Zalecana jest wstępna
obróbka tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8004) przez
20 minut w temperaturze 97°C, a nast ępnie przez 5 minut w buforze EnVision™ FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007).
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury
wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX+ Mouse, High pH (Link) (nr kat. K8002).
Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone zakryte za pomocą środka do
trwałego zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć.
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX+ Mouse, High pH (Link) (nr kat. K8002). W systemie
Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana objętość uŜytego odczynnika
to 1 x 200 µL lub 2 x 150 µL na preparat. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i
odczynników przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w
uŜywanym systemie Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Program
instalacyjny słuŜący do aktualizowania oprogramowania DakoLink z uwzględnieniem informacji o protokołach i
odczynnikach Anti-ERα, klon 1D5, dla aparatu Austainer Link moŜna znaleźć na stronie www.dako.com/installer.
Wszystkie procedury inkubacji naleŜy przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (nr kat.
K8008). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Zaleca się jednoczesne wykonanie dodatnich i ujemnych prób kontrolnych przy uŜyciu tego samego protokołu, który
uŜywany jest do badania materiału pochodzącego od pacjentów. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować
szyjkę macicy, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji
taki, jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX
Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja
wybarwienia
Charakterystyka
działania
Komórki znakowane przez przeciwciało wykazują odczyn jądrowy. JeŜeli obserwowane jest znakowanie
cytoplazmatyczne, naleŜy je uznać za nieswoiste. Dodatnie interpretacje uzyskiwano przy wartościach odcięcia od
>0% do 45% (10-18).
1.
Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu w tkankach.
JeŜeli próbki przechowywano w temperaturze pokojowej, powinny być poddane barwieniu w ciągu 2 miesięcy
od momentu osadzenia preparatów tkankowych na szkiełkach (19).
2.
W celu uzyskania optymalnych, powtarzalnych wyników, w preparatach utrwalanych standardowo (w obojętnej
buforowanej formalinie) i zatapianych w parafinie, naleŜy zastosować cieplne odmaskowanie antygenu (HIER)
białka ER.
3.
Nie przeprowadzono weryfikacji stosowania Dako Monoclonal Mouse Anti-Human ERα, klon 1D5 na tkankach
utrwalanych środkami innymi niŜ formalina.
4.
Parametry przedanalityczne, w tym sposób utrwalenia tkanek i obróbka mogą wpływać na warunki procedury
barwienia.
Tkanki zdrowe: Komórki płaskonabłonkowe szyjki macicy oraz komórki podścieliska wykazują odczyn jądrowy
umiarkowany do silnego, natomiast komórki pośrednie i powierzchniowe komórki nabłonka płaskiego wykazują
odczyn jądrowy słaby do umiarkowanego. Przeciwciało przebadano na szerokiej gamie innych tkanek prawidłowych.
Dodatni odczyn jądrowy stwierdzono w gruczole sutkowym, migdałku (słaby, zogniskowany odczyn komórek
nabłonka płaskiego i komórek ośrodków rozmnaŜania), macicy (endometrium) oraz komórkach mezenchymalnych i
wyściełających pęcherzyki płucne. W przypadku granulocytów, makrofagów i komórek włóknisto-mięśniowego zrębu
gruczołu krokowego odczyn wyjątkowo występuje w cytoplazmie. Sporadycznie obserwuje się nieswoiste barwienie
tkanki martwiczej i wydzielin w płucach (20).
Tkanki patologiczne: Liczne badania utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków raka sutka,
wykazały Ŝe przeciwciało Anti-ERα, klon 1D5, jest wiarygodne i skuteczne w określaniu statusu ERα (1, 2, 21, 22).
Przeciwciało to dostarcza równieŜ dokładnych informacji prognostycznych dotyczących odpowiedzi na terapię
hormonalną (2, 21, 22). Porównując znakowanie przeciwciałem z odpowiedzią na terapię tamoksyfenem,
stwierdzono czułość równą 90% (2) i 89% (21), i swoistość równą 51% (2) i 73% (21). W (2) metodzie oceny H
(H-score) z uŜyciem dowolnej wartości odcięcia dla odczynu dodatniego równej 50, podczas gdy (21) uŜyto punktu
odcięcia równego 10% komórek dodatnich. W innym badaniu, przeciwciała oznakowały 10/25 trzustkowych
gruczolaków wysepkowatokomórkowych (23). Niekiedy znakowaniu ulegają nowotwory z tkanki limfoidalnej i
nowotwory nielimfoidalne, np. czerniaki.
(121214-004)
IR657/PL/SSM/2012.03.21 str. 2/3
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Piśmiennictwo
1.
Mauri FA, Veronese S, Frigo B, Girlando S, Losi L, Gambacorta M, et al. ER1D5 and H222 (ER-ICA) antibodies to human estrogen
receptor protein in breast carcinomas. Appl Immunohistochem 1994;2:157-63.
2.
Goulding H, Pinder S, Cannon P, Pearson D, Nicholson R, Snead D, et al. A new immunohistochemical antibody for the assessment of
estrogen receptor status on routine formalin-fixed tissue samples. Hum Pathol 1995;26:291-4.
3.
Shaw JA, Udokang K, Mosquera J-M, Chauhan H, Jones JL, Walker RA. Oestrogen receptors alpha and beta differ in normal human
breast and breast carcinomas. J Pathol 2002;198:450-7.
4.
Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin J-R, Chambon P. Functional domains of the human estrogen receptor. Cell 1987;51:941-51.
5.
Elledge RM, Fuqua SAW. Ch. 31: Estrogen and Progesterone Receptors. In: Diseases of the Breast. Harris JR et al. eds. Philadelphia:
Lippincott Williams & Wilkins 2000:471-85.
Fitzgibbons FK, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer: College of American
Pathologists consensus statement 1999. Arch Pathol Lab Med 2000; 124:966-78.
6.
7.
Al Saati T, Clamens S, Cohen-Knafo E, Faye JC, Prats H, Coindre JM, et al. Production of monoclonal antibodies to human
estrogenreceptor protein (ER) using recombinant ER (RER). Int J Cancer 1993;55: 651-4.
8.
Nishihara E, Nagayama Y, Inoue S, Hiroi H, Muramatsu M, Yamashita S, et al. Ontogenetic changes in the expression of estrogen
receptor α and β in rat pituitary gland detected by immunohistochemistry. Endocrinology 2000;141:615-20.
9.
Pettersson K, Grandien K, Kuiper GGJM, Gustafsson J-Å. Mouse estrogen receptor β forms estrogen response element-binding
heterodimers with estrogen receptor α. Mol Endocrinol 1997;11:1486-96.
10.
Chebil G, Bendahl PO, Fernö M; South Sweden Breast Cancer Group; North Sweden Breast Cancer Group. Estrogen and progesterone
receptor assay in paraffin-embedded breast cancer--reproducibility of assessment. Acta Oncol 2003;42:43-7.
11.
Fernö M, Andersson C, Fallenius G, Idvall I. Oestrogen receptor analysis of paraffin sections and cytosol samples of primary breast
cancer in relation to outcome after adjuvant tamoxifen treatment. The South Sweden Breast Cancer Group. Acta Oncol 1996;35:17-22.
12.
Andersen J. Determination of estrogen receptors in paraffin-embedded tissue. Techniques and the value in breast cancer treatment. Acta
Oncol 1992;31:611-27.
13.
Ferrero-Poüs M, Trassard M, Le Doussal V, Hacène K, Tubiana-Hulin M, Spyratos F. Comparison of enzyme immunoassay and
immunohistochemical measurements of estrogen and progesterone receptors in breast cancer patients. Appl Immunohistochem Mol
Morphol 2001;9:267-75.
14.
Santeusanio G, Mauriello A, Ventura L, Liberati F, Colantoni A, Lasorella R, et al. Immunohistochemical analysis of estrogen receptors in
breast carcinomas using monoclonal antibodies that recognize different domains of the receptor molecule. Appl Immunohistochem Mol
Morphol 2000;8:275-84.
15.
Grabau DA, Thorpe SM, Knoop A, Vach W, Schrøder HD, Blichert-Toft M, et al. Immunohistochemical assessment of oestrogen and
progesterone receptors: correlations with the DCC method and clinical outcome in primary breast cancer patients. Breast 2000;9:208-17.
16.
Molino A, Micciolo R, Turazza M, Bonetti F, Piubello Q, Corgnati A, et al. Estrogen receptors in 699 primary breast cancers: a comparison
of immunohistochemical and biochemical methods. Breast Cancer Res Treat 1995;34:221-8.
17.
Layfield LJ, Gupta D, Mooney EE. Assessment of tissue estrogen and progesterone receptor levels: A survey of current practice,
techniques, and quantitation methods. Breast J 2000;6:189-96.
18.
Leers MP, Hoop JG, van Beers M, van Rodijnen N, Pannebakker M, Nap M. Determination of threshold values for determining the size of
the fraction of steroid hormone receptor-positive tumor cells in paraffin-embedded breast carcinomas. Cytometry B Clin Cytom
2005;64:43-52.
19.
Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. Approved
guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5)- CLSI, 940 west Valley Road, Suite 1400. Wayne, PA 19087-1898 USA 1999.
20.
Dako Technical Report TR10-52.
21.
Pertschuk LP, Feldman JG, Kim Y-D, Braithwaite L, Schneider F, Braverman AS, et al. Estrogen receptor immunocytochemistry in paraffin
embedded tissues with ER1D5 predicts breast cancer endocrine response more accurately than H222Spγ in frozen sections or cytosolbased ligand-binding assays. Cancer 1996;77:2514-9.
22.
Barnes DM, Harris WH, Smith P, Millis RR, Rubens RD. Immunohistochemical determination of oestrogen receptor: comparison of
different methods of assessment of staining and correlation with clinical outcome of breast cancer patients. Br J Cancer 1996;74:1445-51.
23.
Alabraba EB, Taniere P, Reynolds GM, Stewart PM, Wigmore SJ, Bramhall SR. Expression and functional consequences of oestrogen
and progesterone receptors in human insulinomas. Endocr Relat Cancer 2007;14:1081-8
Objaśnienie symboli
(121214-004)
N ume r ka ta log owy
Tempe ratura
prze chow ywan ia
Zu Ŝyć p rzed
Wyró b medyczny do
d ia gno styki in vi tro
Zawa rto ść w ysta rcza na
<n> testów
Produ cent
S prawd zić w instrukcj i
sto sowa nia
Nu mer serii
IR657/PL/SSM/2012.03.21 str. 3/3
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17