Zapisz jako PDF

Spis treści
1 Wstęp
2 Podstawy fizyczne MS
3 Podstawowe pojęcia spektrometrii mas
3.1 Rozdzielczość
3.2 Dokładność wyznaczenia masy cząsteczkowej
3.3 Masa monoizotopowa
3.4 Jonizacja cząsteczek
4 Układy wprowadzania próbki
5 Metody jonizacji próbki
5.1 Jonizacja strumieniem elektronów (EI — electron ionization)
5.2 Jonizacja chemiczna (CI — Chemical Ionization)
5.3 Jonizacja laserem wspomagana matrycą (MALDI — Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization)
5.4 Jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym (ESI — electrospray ionization)
5.5 Jonizacja wysokoenergetycznymi atomami (FAB — fast atom bombardment)
5.6 Inne metody jonizacji próbki
6 Analizatory masy
6.1 Analizator czasu przelotu (Time Of Flight TOF)
6.2 Tandemowa spektrometria masowa (MS/MS)
6.3 Sektor magnetyczny i elektryczny
6.4 Kwadrupol i pułapka jonowa
6.5 Analizator cyklotronowego rezonansu jonów i analizator cyklotronowego rezonansu
jonów z fourierowską transformacją wyników
7 Detektory
8 Zastosowania spektrometrii mas w badaniach biologicznych
8.1 Przykłady wykorzystania spektrometrii mas
Wstęp
Spektrometria masowa (ang. Mass Spectrometry, MS) to technika analityczna pozwalająca na
dokładny pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego jonu, co, przy znanym ładunku jonu
pozwala obliczyć masę z dokładnością do pojedynczych atomów.
Do lat 70-tych XX w. masy białek szacowano metodami takimi jak: elektroforeza, chromatografia,
ultrawirowanie. Jednak wyniki uzyskiwane tymi metodami były nieprecyzyjne, a błąd wynosił 10 100%. Wprowadzenie techniki MS umożliwiło znaczny postęp w tej dziedzinie. Dzięki MS w
przypadku małych układów można dokonać pomiaru masy z dokładnością do 0.0001 u, na przykład
możliwe jest rozróżnienie związków C5H12 o masie M = 72.0939 u oraz C4H8O o masie M =
72.0575 u.
Technika MS początkowa ograniczona była do zjonizowanych substancji lotnych, ale rozwój metod
jonizacji umożliwił dokładne określanie mas w szerokim zakresie, również dla substancji będących
wyjściowo w stanie stałym i ciekłym.
Spektrometria masowa znajduje zastosowania w badaniach:
1.
2.
3.
4.
5.
Masy cząsteczkowej.
Składu chemicznego.
Budowy strukturalnej cząsteczek.
Czystości substancji.
Identyfikacji zanieczyszczeń.
Zalety spektrometrii masowej:
1. Dokładność wyznaczenia masy.
2. Zakres zastosowania: od peptydów do dużych białek (>200 kDa). MS umożliwia detekcję
strukturalnych wariantów białek (mutanty, białka zmodyfikowane posttranslacyjnie).
3. Rozdzielczość: kilka jednostek masy atomowej.
Początki rozwoju spektrometrii masowej sięgają końca XIX wieku, kiedy to po odkryciu promieni
katodowych Thompson dokonał pierwszego pomiaru stosunku masa/ładunek dla elektronu w 1896
roku z zależności:
,
gdzie: E — wartość przyłożonego pola elektrycznego, B — wartość przyłożonego pola magnetycznego
prostopadłego do E, l — długość płytek odchylających, y — przesunięcie plamki na ekranie.
Podstawy fizyczne MS
Jonizacja cząsteczek umożliwia przyspieszenie ich w polu elektrycznym w próżni. Energia kinetyczna
przyspieszanego jonu jest opisana równaniem:
.
Wiązka przyspieszonych jonów wpada w jednorodne pole magnetyczne o wektorze indukcji B i ulega
odchyleniu. Zakładając równość siły dośrodkowej i siły Lorentza otrzymujemy:
,
gdzie: m — masa jonów, z — ładunek jonów, B — wektor indukcji magnetycznej, v — prędkość jonu, r
— promień krzywizny toru w polu magnetycznym,
— różnica potencjałów. Korzystając z
powyższych równań otrzymujemy:
.
I dalej:
Wniosek:
Za pomocą pola magnetycznego, działającego na monoenergetyczną wiązkę jonów,
można wyznaczać stosunki m/z, a przy znanym ładunku jonów wprost ich masy.
Heterogeniczny strumień jonów można rozdzielić na składowe, zależnie od stosunku
masy do ładunku
.
Podstawowym warunkiem zastosowania spektrometrii mas jest posiadanie przez badane cząsteczki
ładunku. Cząsteczka musi być jonem! Jeśli próbka zawiera cząsteczki obojętne należy nadać im
ładunek poprzez jonizację. W przypadku jonizacji polegającej na protonacji lub deprotonacji masa
mierzona w spektrometrze będzie powiększona lub pomniejszona o masę protonu lub protonów
przyłączonych lub odłączanych od cząsteczki analizowanej substancji. Jonizacja elektronami
powoduje jedynie wybicie elektronu bez przyłączania protonu.
Podstawowe pojęcia spektrometrii mas
Rozdzielczość
Rozdzielczość jest zdefiniowana jako
, gdzie
jest określona dla sąsiadujących,
rozróżnialnych mas
i
. Rozdzielczość 100 000 umożliwia np. rozdzielenie mas równych
100 000 Da i 100 001 Da. Stosuje się dwa kryteria rozdzielczości:
1. „10%-owa dolina” — jeśli dwa sąsiednie piki przekrywają się na poziomie 10 % wysokości jest
to szerokość piku mierzona na poziomie 5% wysokości,
2. „pełna szerokość w połowie maksimum”, FWHM – full width, half-maximum - szerokość
połówkowa.
Rozdzielczość piku = masa piku [Da] podzielona przez odległość między punktami odpowiadającymi
połowie maksymalnej wartości piku [Da].
Zgodnie z zastosowanym kryterium:
.
Dokładność wyznaczenia masy cząsteczkowej
Dokładność wyznaczenia masy cząsteczkowej jest zdefiniowana jako różnica pomiędzy zmierzoną i
obliczoną masą dla danego jonu. Jest ona podawana w % zmierzonej masy (10 000 ± 0.01%) lub w
ppm (10 000 ± 100 ppm).
Masa monoizotopowa
Węgiel występuje w przyrodzie w postaci izotopów: 12C — 98.8%, 13C — 1.1 %.
Podobnie azot: 14N — 99.6 %, 15N — 0.4 %
Monoizotopowe piki uzyskuje się dla cząsteczek, w których występuje jeden izotop pierwiastka. W
rzeczywistości cząsteczki jednego związku mogą mieć masy różniące się ze względu na obecność w
cząsteczce różnych izotopów np. n-butan, C4H10 – 4%-owe prawdopodobieństwo występowania w
cząsteczce izotopu 13C (prawdopodobieństwo występowania cząsteczek zawierających 2 lub 3 takie
atomy jest zaniedbywalne).
Dla cząsteczek biologicznych zawierających setki atomów węgla i azotu widmo masowe staje się
bardzo skomplikowane. Jego rozkład można przewidzieć teoretycznie. Chemiczna średnia masa
cząsteczki jest średnią mas zawierających wszystkie stabilne izotopy.
Jonizacja cząsteczek
Jony tworzą się pod wpływem bombardowania substancji elektronami, atomami, jonami. Utworzony
jon rozpada się następnie na pewną liczbę mniejszych jonów, o charakterystycznych masach
pozwalających na ich identyfikację.
Wyróżniamy następujące typy jonów:
Jon molekularny — jon o masie równej masie cząsteczkowej związku z dokładnością do masy
elektronu.
Jon pseudomolekularny — jon powstający po dołączeniu do cząsteczki jonów H+, Na+, Cl+ lub
lub odłączeniu jonu H+.
Jony fragmentacyjne — pod wpływem jonizacji cząsteczka może ulec rozbiciu na pewną
liczbę jonów o charakterystycznych masach.
W typowym widmie MS widzimy jony związane z różną masą izotopową cząsteczek, jony
molekularne, jony pseudomolekularne oraz jony fragmentacyjne.
Nawet niewielka cząsteczka może mieć skomplikowane widmo masowe, zależne dodatkowo od
sposobu jonizacji.
Układy wprowadzania próbki
Poszczególne układy różnią się zależnie od stanu skupienia analizowanej próbki i metody jonizacji:
stan stały – sondy z probówką, płytki (jonizacja typu EI, MALDI),
stan ciekły – zawory wstrzykowe, pompy strzykawkowe, systemy HPLC, FPLC, systemy
elektroforezy kapilarnej (jonizacja typu ESI, MALDI),
stan gazowy – układy chromatografii GC, komory próżniowe, systemy strzykawek
gazoszczelnych (jonizacja typu EI, CI, ICP).
Metody jonizacji próbki
Jonizacja strumieniem elektronów (EI — electron ionization)
Po przyłożeniu napięcia katoda emituje elektrony o ściśle określonej energii, które zderzając się z
cząsteczkami próbki wybijają elektron lub elektrony z ich orbit walencyjnych. Konieczne jest
przeprowadzenie badanej substancji w stan pary. Jonizacja odbywa się w próżni. Metoda ta
powoduje zwykle fragmentację badanych cząsteczek. EI charakteryzuje się stosunkowo małą
wydajnością — poniżej 1% cząsteczek ulega jonizacji.
Postać wyników: piki jonów molekularnych obserwowane w widmie masowym posiadają zazwyczaj
ładunek +1. W przypadku niskorozdzielczej analizy typu EI masa cząsteczkowa próbki jest zazwyczaj
równa
.
Najczęściej stosowany zakres analizy to 10-1000 Da — cząsteczki o wyższych masach ulegają
łatwo dekompozycji przy stosowaniu jonizacji typu EI.
Najczęściej analizowane próbki: niskocząsteczkowe, nieorganiczne, organiczne w postaci stałej.
Zastosowania: potwierdzanie masy cząsteczkowej substancji po syntezie, analiza
niskocząsteczkowych zanieczyszczeń, nadzór prawidłowości procesów technologicznych.
Jonizacja chemiczna (CI — Chemical Ionization)
Konieczność przeprowadzenia związku w stan pary (podobnie jak dla EI) — ograniczona możliwość
analizy cząsteczek takich jak: peptydy, cukry, białka.
W wyniku jonizacji wiązką elektronów gazu buforowego (najczęściej jest nim metan) pod ciśnieniem
10-4 mm Hg powstają jony molekularne CH5+, które następnie jonizują cząsteczki analizowanej
substancji. Gaz buforowy jest obecny w dużym nadmiarze (~ 100 razy) w stosunku do analizowanej
substancji. Jest to stosunkowo delikatny sposób jonizacji, pozwala na zmniejszenie stopnia
fragmentacji cząsteczki, produkuje jony MH+. Jony te ulegają w małym stopniu dalszemu rozpadowi,
gdyż nie mają one dużego nadmiaru energii wewnętrznej. Z tego powodu jony MH+ są jonami o dużej
intensywności, często o największej.
Jonizacja laserem wspomagana matrycą (MALDI — Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization)
Analizowana substancja jest rozpuszczana w lotnym rozpuszczalniku, a następnie mieszana z
roztworem matrycy (roztwór cząstek organicznych absorbujących promieniowanie laserowe).
Mieszaninę nanosi się na płytkę ze stali nierdzewnej i pozwala odparować rozpuszczalnikowi w
strumieniu powietrza. Po wysuszeniu próbkę wprowadza się do komory pomiarowej i usuwa
powietrze. Następnie próbkę naświetla się impulsami lasera, co powoduje wzbudzenie matrycy.
Matrycami stosowanymi w technice MALDI są substancje, które:
Dobrze absorbują promieniowanie z zakresu UV.
Łatwo sublimują.
Po desorpcji dostarczają dużych ilości jonów (protonów) potrzebnych do jonizacji badanej
substancji.
Skoncentrowany impuls laserowy trwający ok. 3 ns oddziałujący z matrycą wywołuje ciąg
następujących po sobie reakcji:
Absorpcja promieniowania przez materiał matrycy.
Odparowanie próbki i wyrzucenie strumienia gazów.
Dysocjacja termiczna matrycy.
Tworzenie jonów.
Reakcje jonów z badaną substancją i jej jonizacja.
Przyjmuje się, że możliwe są następujące drogi jonizacji próbki:
Dysocjacja termiczna z utworzeniem pary kation–anion.
Oderwanie elektronu.
Oderwanie bądź przyłączenie protonu.
Przyłączenie kationu bądź anionu.
Wytworzone jony są przyspieszane w polu elektrycznym i kierowane do detektora.
Technika MALDI jest zaliczana do łagodnych sposobów jonizacji, pokrewnych jonizacji chemicznej.
Główną część energii cieplnej, przekształcanej następnie w energię drgań wiązań chemicznych,
pochłania matryca, co chroni badaną substancję przed rozkładem.
Stwierdzono:
Bardzo krótkie (3 ns) impulsy promieniowania o dużej koncentracji energii aplikowane
próbkom znajdującym się w wysokiej próżni (10-6 – 10-8 Torr) powodują raczej odparowanie
materiału, aniżeli jego rozkład, nawet w przypadku materiałów tak wrażliwych, jak białka o
masie cząsteczkowej > 100 000 Da.
Substancje o małej masie cząsteczkowej
często ulegają w tych warunkach
fragmentacji (duże cząsteczki mają wiele stopni swobody — zaabsorbowana energia ulega
rozproszeniu bez rozerwania wiązań chemicznych).
Metoda ta jest stosowana głównie do sekwencjonowania peptydów i określania masy cząsteczkowej
białek. Zakres analizy to 500 - 1000000 Da. Najczęściej analizowane są średnio- i
wysokocząsteczkowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe. Metoda
znajduje zastosowanie w biochemii, biotechnologii, farmakologii, neurochemii, immunologii.
Postać wyników: najczęściej jonizacja +1, rzadziej +2, możliwość obserwacji niekowalencyjnych
kompleksów. W widmie pojawiają się jony pojedynczo (M+) i wielokrotnie (M2+, M3+) zjonizowane
oraz jony agregatów polimeru o różnym stopniu zjonizowania 2M+, 3M2+, 2M3+.
Zalety metody:
wysoka czułość, możliwość analizy pikomolowych ilości białka,
delikatna jonizacja, umożliwiająca małą fragmentację,
tolerancja dla soli w stężeniu milimolowym.
Wady metody:
stosowanie matryc może stanowić problem w pomiarach dla związków o masie poniżej 700Da,
możliwość fotodegradacji na skutek desorpcji/jonizacji laserem,
stosowanie kwaśnych matryc może powodować rozpad niektórych badanych substancji
Jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym (ESI — electrospray
ionization)
Pierwszym etapem jest jonizacja próbki w stanie ciekłym pod ciśnieniem atmosferycznym w silnym
polu elektrycznym (napięcia rzędu 2000-5000 V). Na powierzchni cieczy opuszczającej kapilarę
akumulują się ładunki. Następnie strumień cieczy ulega rozbiciu na naładowane kropelki.
Kolejnym etapem jest odparowanie rozpuszczalnika. Powoduje to kurczenie kropelek do momentu,
gdy odpychanie elektrostatyczne przewyższy siły spójności cieczy, co rozrywa kropelki i powoduje
powstanie jonów często o ładunku wielokrotnym.
Najczęściej analizowane próbki: średnio- i wysokocząsteczowe substancje organiczne, peptydy,
białka, polimery, kwasy nukleinowe w postaci ciekłej o zakresie mas 50 – 80000 Da. Metodę jonizacji
ESI stosuje się w biochemii, biotechnologii, farmakologii, neurochemii, medycynie sądowej, oraz w
detekcji w chromatografii cieczowej.
Postać wyników: serie pików odpowiadających kolejnym, wielokrotnie naładowanym,
protonowanym jonom [M+zH]z+, [M+(z+1)H](z+1)+, itd.
Zalety metody:
uniwersalna metoda, umożliwiająca przeprowadzenie substancji z roztworu w formę
zjonizowanego gazu,
minimalna fragmentacja próbki podczas jonizacji,
wysoka czułość,
kompatybilność z technikami chromatograficznymi (LC) oraz elektroforetycznymi,
możliwość analizy dużych cząsteczek,
możliwość badania substancji rozpuszczonych w różnych rozpuszczalnikach.
Wady metody:
obecność soli i mieszanin może obniżać czułość,
wymagana duża czystość próbki.
Jonizacja wysokoenergetycznymi atomami (FAB — fast atom bombardment)
Metoda FAB jest stosowana w przypadku jonów zawartych w nielotnych rozpuszczalnikach, takich
jak gliceryna, alkohol m-nitrobenzymowy. Nie można jej stosować do substancji niepolarnych.
Wiązka szybkich atomów (argonu, ksenonu) uzyskiwana jest z wykorzystaniem jonów (np. cezu).
Przyspieszane jony trafiają do komory zderzeniowej, gdzie przekazują atomom pęd. Obojętne atomy
uderzają w roztwór analizowanej substancji wyrzucając z roztworu jony i cząsteczki obojętne.
Wyrzucane jony są kierowane do analizatora. Metodę można stosować do mieszanin o maksymalnej
masie 10 kDa.
Postać wyników: widmie obserwuje się jony [M+H]n+ lub [M+H]n-. Zalety metody:
szybkość i łatwość wykonania,
łatwe do interpretacji widma,
możliwość prostego regenerowania źródła atomów/jonów.
Wady metody:
średnia czułość metody,
problemy z analizą mieszanin,
możliwość wpływu matrycy na jakość widma.
Inne metody jonizacji próbki
1.
2.
3.
4.
5.
Jonizacja polem (field ionisation, FI).
Termorozpylanie (termospray, TE) .
Desorpcja polem (field desorption, FD).
Desorpcja laserowa (laser desorption, LD).
Plazma wzbudzona indukcyjnie (ICP).
Należy pamiętać, że w wyniku jonizacji cząsteczek jednego rodzaju różnymi metodami otrzymuje się
różne widma masowe.
Techniki jonizacyjne stosowane w przypadku biomolekuł zamieszczono w poniższej tabeli:
Biomolekuły
Metoda jonizacji
Mechanizm jonizacji
Peptydy
FAB, MALDI, ESI protonacja, deprotonacja
Białka
MALDI, ESI
Węglowodory
FAB, MALDI, ESI protonacja, deprotonacja, kationozacja (inny kation niż H+)
Oligonukleotydy MALDI, ESI
protonacja
protonacja, deprotonacja, kationozacja
Małe biomolekuły FAB, MALDI, ESI protonacja, deprotonacja, kationozacja, wybicie elektronu
Próbki białek do badań zwykle wykonuje się w objętości 5 – 50 μl i stężeniu 10 – 100 μM.
Analizatory masy
Analizator czasu przelotu (Time Of Flight TOF)
Powstałe jony są wprowadzane do analizatora, gdzie pod wpływem impulsu elektrycznego ulegają
przyspieszeniu i zaczynają przemieszczać się w kierunku detektora jonów połączonego z
urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia
określonego jonu w detektor. Czas przelotu jest przeliczany na stosunek
. Ze wzrostem
jony poruszają się coraz wolniej.
Rozdzielczość analizatora początkowo wynosiła < 1000. Obecnie stosuje się analizatory ze
zwierciadłem elektrostatycznym, które zwiększa rozdzielczość aparatu do kilkudziesięciu tysięcy, ale
zmniejsza zakres dopuszczalnych mas cząsteczkowych. Analizatory TOF są najczęściej stosowane
razem ze źródłami jonów MALDI.
Tandemowa spektrometria masowa (MS/MS)
Podstawowy układ składa się z dwóch spektrometrów masowych. Za pomocą pierwszego
spektrometru selekcjonuje się wybrany jon (najczęściej jon molekularny) na podstawie stosunku
.
Jon ten (macierzysty, parent ion) poddawany jest zderzeniom np. z wprowadzonym gazem
obojętnym. Na skutek zderzeń jon macierzysty rozpada się na jony fragmentacyjne (daughter ions),
które można analizować za pomocą drugiego spektrometru. Układy stosowane w tandemowej
spektrometrii mas mogą składać się z szeregu spektrometrów, MSn (gdzie
), co wydatnie
zwiększa możliwość identyfikacji próbek.
Sektor magnetyczny i elektryczny
Sektor magnetyczny umożliwia pomiary zmiany toru lotu jonów w polu magnetycznym. Stopień
zakrzywienia toru zależy od stosunku masy do ładunku (
), prędkości jonu i od parametrów pola
magnetycznego. Sektor magnetyczny charakteryzuje się niską rozdzielczością (< 5000) związaną z
dużymi różnicami prędkości cząsteczek wpadających do urządzenia. Problem rozdzielczości
rozwiązuje przez zastosowanie sektora elektrycznego przed sektorem magnetycznym, w którym
cząsteczki są rozpędzane, dzięki czemu różnice prędkości są mniejsze.
Sektor elektryczny jest zbudowany z dwóch równoległych, zakrzywionych płyt do których
przyłożono potencjał elektryczny umożliwiający przyspieszanie jonów. Jony o jednakowej prędkości
mają jednakowe tory lotu w sektorze elektrycznym. Za sektorem elektrycznym znajduje się szczelina
przez którą przelatują tylko jony o określonej energii trafiające następnie do sektora magnetycznego.
Kwadrupol i pułapka jonowa
Kwadrupol — zbudowany z czterech symetrycznie ułożonych równoległych prętów. Działa jako filtr
masy – w jednym momencie przepuszcza tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku (
).
Dzieje się to dzięki przykładaniu do prętów prądu zmiennego o określonej częstotliwości i napięciu
oraz napięcia stałego. Kwadrupol można ustawić tak, aby przepuszczał jony o szerokim lub wąskim
zakresie
.
Pułapka jonowa (Ion trap — IT) jest analizatorem pozwalającym na przetrzymywanie jonów. Działa
na zasadzie podobnej do kwadrupola. Manipulując parametrami prądu przyłączonego do elektrod
można uwięzić w pułapce jony o określonym stosunku masy do ładunku (
) lub jony o szerokim
zakresie
. Pomiaru masy dokonuje się przez uwięzienie w pułapce jonów o szerokim zakresie
i
wyrzucanie z pułapki kolejnych grup jonów o określonym
. Pułapki jonowe charakteryzują się
zwykle dość niewielką rozdzielczością (kilku tysięcy) oraz bardzo dużą czułością.
Analizator cyklotronowego rezonansu jonów i analizator cyklotronowego
rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników
Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (Ion Cyclotron Resonance ICR) W tym typie
analizotora jony są pułapkowane w cyklotronie, gdzie wpadają w ruch kołowy. Widmo
jest
tworzone przez działanie na jony polem elektromagnetycznym o zmieniającej się częstotliwości i
rejestrację zmian natężenia prądu w płytach detektorowych lub zmiany absorpcji fali
elektromagnetycznej. W analizatorze panuje bardzo wysoka próżnia — ciśnienie nie większe niż 10-4
Pa, zwykle 10-6 Pa lub mniejsze. Rozdzielczości analizatorów cyklotronowych mogą być bardzo duże,
zwykle kilkaset tysięcy, mogą dochodzić nawet do miliona (przy
), ale zmniejszają się
wraz ze wzrostem
analizowanej cząsteczki.
Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników (Fourier
Transform Ion Cyclotron Resonance FT-ICR) działa podobnie jak analizator cyklotronowego
rezonansu jonowego. W analizatorze FT-ICR zastosowano bardziej wydajną metodę zbierania danych
niż w ICR. Przy pomocy złożonej fali elektromagnetycznej wzbudzane są jednocześnie wszystkie jony.
Na płytach detektora rejestrowany jest sygnał zawierający wiele częstotliwości charakterystycznych
dla jonów o różnym
, który nastepnie jest przekształcany w widmo
przy pomocy transformacji
Fouriera. Analizatory FT-ICR są znacznie szybsze niż analizatory ICR, inne parametry (rozdzielczość,
czułość itp.) są podobne. Analizatory FT-ICR wyparły obecnie z rynku analizatory ICR.
Detektory
Zadaniem detektorów jest rejestracja jonów przechodzących przez analizator.
1. Puszka Faradaya to metalowa, cylindryczna komora z otworem przez który wlatują jony. Gdy
jony docierają do dna puszki oddają jej swój ładunek, co powoduje przepływ niewielkiego
prądu podlegającego rejestracji. Detektory te charakteryzują się małą czułością.
2. Powielacz elektronowy jest to detektor zbudowany z serii płytek, do których przyłączono
wysokie napięcie. Jony po uderzeniu w pierwszą płytkę (dynodę konwersyjną), powodują emisję
elektronów, które z kolei uderzają w następną płytkę (dynodę) powodując wybicie większej
liczby elektronów. W ten sposób sygnał jest kaskadowo wzmacniany i trafia ostatecznie na
anodę powodując przepływ rejestrowanego prądu. W nowszych konstrukcjach powielaczy
elektronowych serię dynod zastępuje się zakrzywioną zwężającą się rurą (powielacz
elektronowy o dynodzie ciągłej). Elektrony uderzają wielokrotnie w ściany rury powodując
emisję kolejnych elektronów. Powielacze elektronowe są bardzo czułymi detektorami.
3. Detektor mikrokanalikowy zbudowany jest z płytki z niewielkimi (4-25 μm), zakrzywionymi
otworami. Powierzchnia otworów pokryta jest półprzewodnikiem mającym zdolność emisji
elektronów. Na stronie wejściowej płytki utrzymywany jest potencjał ujemny (napięcie rzędu 1
kV) w stosunku do strony wyjściowej. Jony wpadają do kanalików i zderzają się ze ścianami
otworów powodując kaskadową emisję elektronów, podobnie jak w powielaczu elektronowym.
Za każdym z kanalików znajduje się metalowa anoda zbierająca elektrony. Sygnał powstały w
ten sposób jest mierzony.
4. Detektor fotopowielaczowy — składająca się z dwóch dynod konwersyjnych (jedna dla jonów
dodatnich druga dla jonów ujemnych), ekranu fluorescencyjnego i fotopowielacza. Jony
wpadające do detektora uderzają w dynodę konwersyjną powodując emisję elektronów.
Elektrony są kierowane na ekran fluorescencyjny przy pomocy pola elektrycznego. Po
uderzeniu elektronu w ekran emitowane są fotony, które trafiają do fotopowielacza.
Fotopowielecz wzmacnia sygnał, który potem jest rejestrowany.
5. Detekcja w analizatorze cyklotronowego rezonansu jonów (ICR) — analizatory ICR są
jednocześnie detektorami jonów, nie wymagają one instalacji dodatkowych detektorów.
Zastosowania spektrometrii mas w badaniach biologicznych
Etapem milowym w zastosowaniu spektrometrii mas w badaniach struktury i funkcji białek było
wynalezienie metod łagodnej jonizacji. Przy wysokiej dokładności pomiarów wymaga niewielkich
ilości i objętości próbki białka. Umożliwia detekcję z dokładnością do pojedynczych aminokwasów
(mutageneza, modyfikacje posttranslacyjne, np. fosforylacja).
Jak każda metoda doświadczalna ma ona pewne ograniczenia i wady. Aby uzyskać wiarygodne
wyniki próbka musi być idealnie czysta. Z tym wymaganiem łączą się trudności z selektywną analizą
mieszanin. W przypadku dużych białek widma są skomplikowane i trudne do interpretacji. Pomimo
tych ograniczeń spektrometria mas jest jedna z najbardziej precyzyjnych metod pomiarowych.
Przykłady wykorzystania spektrometrii mas
1. Określenie masy i identyfikacja białek.
2. Sekwencjonowanie białek — technika MS-MS, połączona z chemiczną lub enzymatyczną
degradacją cząsteczek białek w celu uzyskania oligopeptydów o masach < 3 kDa, pozwala
określić sekwencje białka i ustalić które aminokwasy uległy modyfikacji posttranslacyjnej.
3. Dynamika fałdowania białek — pomiędzy białkami a otoczeniem zachodzi stała wymiana
wodorów amidowych. Jej szybkość zależy od struktury białka. Jeśli białko umieścimy w D2O
zaobserwujemy wymianę protonu na deuter. W przypadku białka rozwiniętego wymiana
wodorów na deuter zachodzi z podobną szybkością dla wszystkich aminokwasów. Dla białek
zwiniętych szybkość wymiany zależy od otoczenia wodoru amidowego:
ekspozycja wodoru amidowego na solwent — szybka wymiana,
zaangażowanie wodoru amidowego w tworzenie struktur lokalnych — wolniejsza
wymiana,
zaangażowanie wodoru amidowego w tworzenie struktur globalnych (np. alfa-helisa) —
wolna wymiana lub jej brak w białku zwiniętym.
Analiza masowa pokazuje dla których peptydów nastąpiła wymiana proton-deuter — na tej
podstawie możemy identyfikować struktury tworzące się podczas fałdowania białek.
4. Identyfikacja stanów pośrednich.
W metodzie ESI białka zjonizowane w stanie natywnym posiadają węższy rozkład stanów i
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
mniejszy ładunek niż białka zjonizowane w stanie zdenaturowanym. Obserwacja rozkładu
w funkcji „stanu zwinięcia” białka pozwala określić czy istnieją stany pośrednie procesu
faldowania.
Identyfikacja modyfikacji posttranslacyjnych.
Modyfikacje postranslacyjne takie jak: fosforylacja, glikozylacja, acylacja, tworzenie mostków
dwusiarczkowych, izomeryzacja ładunku, odcinanie końców C lub N, lub cięcie białka przez
karboksypeptydazy, aminopeptydazy lub endopeptydazy powodują zmianę masy biomolekuł
widoczną w widmach MS.
Identyfikacja białek po dwuwymiarowej elektroforezie (2-DE).
Potwierdzenie prawidłowości syntezy peptydów.
Synteza peptydów, projektowanie antybiotyków, nietypowych ligandów polega na stopniowym
blokowaniu, odblokowywaniu i aktywacji gryp aminowych i karboksylowych w białkach. W
trakcie syntezy mogą pojawiać się następujące problemy: delecja peptydów, niekompletne
zablokowanie, utlenianie metioniny, trifluoroacetylacja seryny. Zmiany mas z tym związane są
widoczne w widmach MS. Na tej podstawie można ocenić jakość wykonanej syntezy.
Badania kompleksy białkowych.
W obecności 5 mM Mg2+ zarejestrowano rybosomy 70S. Poprzez obniżenie stężenia jonów
magnezu uzyskano dysocjację podjednostki 70S na podjednostki 30S i 50S oraz określono
dokładnie ich masy.
Analiza kwasów nukleinowych, w tym analiza mieszanin oligonukleotydow i długich łańcuchów
kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie DNA.
Analiza węglowodorów.
Obrazowanie w medycynie.
Zamrożona tkanka jest cięta na cienkie plastry i umieszczana na metalowej płytce pokrytej
materiałem absorbującym UV. Następnie oświetlana jest punktowo (przemiatana) laserem. Na
skutek absorpcji energii wybijane są cząsteczki budujące tkankę. W kolejności wybicia
cząsteczki analizowane są metodami spektroskopii masowej. Następnie tworzy się mapy
masowe tkanki.