Zastosowanie techniki SPR (pomiar rezonansu plazmonów

Zastosowanie techniki SPR
(pomiar rezonansu plazmonów powierzchniowych)
w badaniu oddziaływań międzycząsteczkowych
w czasie rzeczywistym
BIACORE
SPR Detection
Sensor Chips
IFC Microfluidic
Opracowanie: dr Maria Rąpała-Kozik i mgr Marta Kujda,
Zakład Biochemii Analitycznej, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ
SYSTEM BIACORE
łączy w sobie elementy chromatografii powinowactwa z nowym sposobem
detekcji oddziałujących molekuł wykorzystującym zjawisko optyczne zwane
powierzchniowym rezonansem plazmonowym - SPR (ang. surface plasmon
resonanse).
specyficzna matryca
sensora (dekstran)
Złoto 50 nm
Szkło
Zjawiska optyczne wykorzystywane
w aparacie BIACORE
Kąt graniczny θ
zjawisko całkowitego wewnętrznego
odbicia
ośrodek o większej gęstości optycznej (pryzmat)
warstwa metalu (złota)
ośrodek o mniejszej gęstości optycznej (bufor)
powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)
Pewne metale (np. złoto czy srebro) posiadają chmury elektronowe (plazmony)
będące powierzchniowymi falami elektromagnetycznymi, które mogą rezonować ze
światłem padającym pod odpowiednim kątem.
W warunkach rezonansu ściśle określona ilość energii padającej fali świetlnej jest
pochłaniana przez plazmony, co skutkuje spadkiem energii fali odbitej.
Zastosowanie SPR w urządzeniach typu BIACORE
Rezonans plazmonowy jest bardzo czuły na zmiany właściwości
dielektrycznych ośrodka optycznie rzadszego.
KaŜda zmiana stałej dielektrycznej tego ośrodka wiąŜe się ze zmianą
warunków rezonansu plazmonowego, a więc ze zmianą intensywności światła
odbitego i kąta odbicia światła pochłanianego rezonansowo.
Detektor
Źródło
światła
Pryzmat
Powierzchnia
sensora
Próbka
Celka przepływowa
Do jakich pomiarów słuŜy system BIACORE
St
ęŜenie
StęŜenie
Spec
yficzność
Specyficzność
Kinet
yka
Kinetyka
Powinowactwo
Powinowactwo
TTermodynamika
ermodynamika
ile badanej substancji znajduje się w próbce
jaka jest specyficzność i selektywność
tworzonego kompleksu
dlaczego dochodzi do oddziaływania
jak szybko ono zachodzi
z jaką mocą wiąŜą się składniki kompleksu
Praktyczne zastosowania systemu
BIACORE
Charakterystyka oddziaływań w układach:
• Ligand – Receptor
• Antygen - Przeciwciało
• Białko – Białko
• RNA – Białko
• DNA – Białko
• Komórka – Białko
poszukiwanie skutecznych leków
monitorowanie w czasie rzeczywistym ekspresji genów
Oznaczenia z wykorzystaniem systemu BIACORE
wymagają następujących etapów
Przygotowanie powierzchni
Proces analityczny
Przygotowanie powierzchni sensora –
immobilizacja liganda
a n a l y te
a n a ly t e
l ig a n d
li g a n d
c a p t u r in g
m o le c u le
Bezpośrednio
Pośrednio
Immobilizacja bezpośrednia na
powierzchni dekstranu
Immobilizacja kowalencyjna
Powierzchnie chipów stosowanych
w immobilizacji pośredniej
Immobilizacja substancji biotynylowanych
za pośrednictwem obecnej na powierzchni
chipu - streptawidyny
Immobilizacja białek błonowych
za pośrednictwem liposomów
Immobilizacja białek
zaopatrzonych w etykietę histydynową,
poddawanych nadekspresji
w komórkach bakteryjnych, bez
konieczności ich oczyszczania
Sensogram
Informacje płynące z sensogramu:
A/ czy oddziaływanie zachodzi
B/ jaka jest kinetyka oddziaływania
jaka jest jego specyficzność
jaka jest jego moc
ile analitu ulega związaniu
Wybrana wartość
Sygnał (RU)
Kształt krzywej informuje
o kinetyce oddziaływania
sygnał
wiązania
Linia podstawowa
czas
assocjacja
bufor
próbka
dysocjacja
bufor
Cykl
analityczny
Wprowadzenie analitu
i pomiar sygnału rezonansu
Regeneracja powierzchni
chipu
Analiza danych
Optymalizacja wiązania i regeneracja
sensora:
Zasady podobne do chromatografii
powinowactwa
Zmiana przepływu buforu, zmiana
pH, jony chaotropowe, detergenty
ZASTOSOWANIA (A1)
Oznaczanie specyficzności oddziaływania
róŜnych analitów z tym samym ligandem
Zestaw sensogramów dla róŜnych typów lektyn oddziałujących z
tyroglobuliną
ZASTOSOWANIA (A2)
Oznaczanie stęŜenia badanego analitu
Mierzony sygnał (RU)
x
x
xx
x
próbka
stęŜenie
Zestaw sensogramów dla analitu o róŜnych stęŜeniach
oraz dla badanej próbki
ZASTOSOWANIA (A3)
Badanie powinowactwa
Jak mocne jest wiązanie w stanie równowagi określenie stałej dysocjacji kompleksu – KD
Signal [RU]
20
15
10
5
0
Time [s]
0
60
120
Wiązanie furosemidu do anhydrazy węglanowej
ZASTOSOWANIA (A4)
Badanie oddziaływań w układach
wieloskładnikowych
Analyte
Ligand
2nd Binder
Response [RU]
31000
30000
29000
28000
27000
26000
50
100
150
200
250
300
Time [s]
- mapowanie epitopów rozpoznawanych przez
badane przeciwciała (test selektywności przeciwciał)
- testowanie powierzchni antygenu
- identyfikacja sekwencji biorącej udział w oddziaływaniu
- moŜliwość zmiany (wzrostu) limitu detekcji badanego ligandu
350
400
ZASTOSOWANIA (A3)
Oznaczanie aktywności ekspresjonowanych białek
SDS-PAGE
Fr.App 1 2 3 4 5 6
Western blot
ZASTOSOWANIA (B)
Analiza kinetyczna
A+B
ka
kd
AB
Jak szybko zachodzi proces tworzenia kompleksu
» ka kon (rozpoznawanie cząsteczek - asocjacja)
» kd koff (stabilność kompleksu - dysocjacja)
» KD = kd/ka (stała równowagi)
Badanie kinetyki procesu tworzenia kompleksu
Badania kinetyczne wprowadzają unikalną moŜliwość doboru leku
z uwzględnieniem jego farmakokinetyki i wielkości dawki
KD 10 nM
To samo powinowactwo moŜe być wynikiem
róŜnych procesów kinetycznych
Całkowite
wysycenie
100 nM
30 min
60 min
ka kd
[M-1s-1] [s-1]
106 10-2
105 10-3
104 10-4
103 10-5
1 µM
30 min
60 min
ZASTOSOWANIA (B1)
Wpływ mutacji punktowej na kinetykę oddziaływań
między domenami
Affinity measurements
Kaff*1e-7 1/M
3,5
3
2,5
2
Resonance signal (RU)
1,5
1
1850
0,5
1830
0
1810
Native
1790
L17D
1770
1750
100
200
300
400
Time (s)
D)
7
)
)
L1
8A
2
Z(
0A
)
N
3
(
F
)
1A
Z
(
3
Z
I
5A
3
Z(
K
Z(
Z
BIACORE
Binding assay
Zastosowanie Biacore w
badaniach proteomicznych
Ligand
Fishing
SPR/MS
Recovery
Enzymatic
digestion
HPLC
separation
MS
Receptor
Express 6-24 months
Kinetics, Affinity
Structure-Activity studies
BIACORE
“Classical Applications”
PODSUMOWANIE
Rezonans plazmonów powierzchniowych umoŜliwia detekcję tworzenia
oddziaływań między analitem i ligandem poprzez pomiar zmiany masy
przy powierzchni sensora
Pomiary kinetyczne w czasie rzeczywistym
Oznaczenia ilościowe
Pomiar stęŜenia
Informacje o zaleŜnościach struktury i aktywności tworzenia kompleksu
Eliminacja znakowania ligandów
Minimalne zuŜycie próbek
Większa szybkość oznaczeń w porównaniu z metodami
konwencjonalnymi (np.ELISA, RIA)
Spektrometr Masowy
HCTultra
S
Oliwia Bocheńska Spektrometria masowa
Spektrometria masowa jest techniką analityczną umożliwiającą dokładny pomiar masy i jednoznaczną identy=ikację substancji. Spektrometr masowy wytwarza i separuje jony ze względu na stosunek masy do ładunku (m/z). Umożliwia: ➭  Szczegółową analizę składników w mieszaninie; ➭  Oznaczenie struktury cząsteczek organicznych; ➭  Uzyskanie informacji o sekwencji peptydów i białek; ➭  Uzyskanie informacji o mody=ikacjach potranslacyjnych; ➭  Wykrywanie substancji endogennych na poziomie piko/femtomolowym. Znajduje zastosowanie w dziedzinach: biochemia, ochrona środowiska, analiza składu, medycyna, toksykologia, chemia sądowa, itp. Schemat blokowy budowy MS
iniekcja próbki źródło jonów transfer jonów analizator system próżni elektronika, rejestrator
detektor HCTultra firmy Bruker
➭ 
➭ 
➭ 
➭ 
➭ 
➭ 
Spektrometr masowy typu ESI-­‐IT: Jonizacja typu electrospray (ESI); Analizator typu pułapka jonowa (ang. Ion Trap – IT); Możliwość rozbudowy do: ETD (Electron Transfer Dissociation); PTR (Proton Transfer Reaction); Zakres pomiaru od 50 do 3000 m/z a nawet 6000 m/z (!) dla analiz MS i MS/MS. Programy do zapisu i analizy widm: Compass 1.3; DataAnalysis 4.0, BioTools 3.2 Wytwarzanie
jonów
Jonizacja typu ESI nebulizacja
➭  Łagodna metoda jonizacji – minimalna fragmentacja analitów; ➭  Jonizacja w warunkach ciśnienia atmosferycznego – możliwość sprzęgnięcia z HPLC (techniki połączone); ➭  Jonizację substancji w roztworach; ➭  Powstawanie jonów wielokrotnie naładowanych – możliwość analizy dużych cząsteczek jak białka i peptydy; ➭  Prosta konstrukcja źródła jonów;
Pułapka Jonowa (IT) ➭  Analizator impulsowy; ➭  Izolacja i fragmentacja jonów w tej samej przestrzeni; ➭  Możliwość wielokrotnych fragmentacji jonów (do MS/MS 11); ➭  Wysoka czułość – gromadzenie jonów w pułapce pozwala na skanowanie i fragmentację w krótszym czasie z lepszą rozdzielczością (>I/s); ➭  Stosowany głównie w analizie struktury i sekwencji złożonych cząsteczek; Zastosowanie HCTultra
➭  Proteomika: ➭  analiza i identy=ikacja peptydów; ➭  identy=kacja białek poprzez trawienie tryspyną zarówno z żelu, jak i w roztworze ; ➭  Analiza małych cząsteczek – związków organicznych; Dziękuję