Wyznaczanie parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej
Transkrypt
Wyznaczanie parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej
Pracownia specjalizacyjna z chemii organicznej Instrukcja do ćwiczenia A1 „WYZNACZANIE PARAMETRÓW KINETYCZNYCH REAKCJI ENZYMATYCZNEJ” 1. Wstęp teoretyczny Reakcje enzymatyczne można scharakteryzować odpowiednimi parametrami kinetycznymi (stałe szybkości reakcji) i termodynamicznymi (stałe równowagi reakcji). Wśród parametrów kinetycznych można wyróżnić stałe przed osiągnięciem stanu stacjonarnego (można je wyznaczyć za pomocą tzw. rapid kinetics) i stałe charakteryzujące stan stacjonarny, czyli szybkość maksymalną Vmax i stałą Michaelisa Km (dla enzymów zachowujących się według mechanizmu Michaelisa-Menten, w praktyce jest to większość enzymów katalizujących reakcje pierwszego lub pseudopierwszego rzędu). Vmax to szybkość reakcji przy hipotetycznym nieskończonym stężeniu substratu, wiąże się ona ze stężeniem enzymu [E] za pomocą równania: Vmax = k cat ∗ [ E ] gdzie kcat to stała katalityczna reakcji. Km to takie stężenie substratu, przy którym szybkość jest połową szybkości maksymalnej. W praktyce jednak nie wyznacza się samej wartości Km, lecz Vmax/Km lub kcat/Km. Szybkość reakcji v dla danego stężenia substratu [S] jest opisana równaniem Michaelisa-Menten: v= k cat ∗ [ S ] ∗ [ E ] ( K m + [ S ]) Wyznaczenie wartości parametrów kinetycznych charakteryzujących reakcję enzymatyczną ma duże znaczenie w badaniach własności biokatalizatorów. Celem ćwiczenia będzie wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji katalizowanej przez fenololiazę tyrozynową (β-tyrozynazę, TPL; E.C. 4.1.99.2) - enzym występujący głównie u Gramujemnych Enterobacteriaceae, a także u części stawonogów. Enzym ten katalizuje reakcję hydrolitycznego rozkładu L-tyrozyny do pirogronianu, fenolu i amoniaku. Kofaktorem TPL jest fosforan pirydoksalu (PLP). COOH HO NH2 + TPL H 2O PLP HO + O COOH + NH3 2. Podstawowe zasady pomiaru parametrów kinetycznych charakteryzujących stan stacjonarny reakcji enzymatycznej Pomiary kinetyki stanu stacjonarnego reakcji prowadzi się przygotowując typowo od 6 do 10 próbek zawierających różne stężenia substratu. Podczas przygotowania najlepiej jest sporządzić mieszaninę zwierającą bufor, kofaktory i enzym, a następnie rozpipetować ją na próbki. Reakcję inicjuje dodanie różnych ilości substratu. Taka strategia minimalizuje błędy pipetowania reagentów. Równoległe przeprowadzenie pomiarów dla różnych stężeń wychodząc ze wspólnej mieszaniny enzymu i kofaktora pozwala uniknąć błędów spowodowanych różnymi warunkami reakcji, co ma miejsce podczas eksperymentów nierównoległych. Do pomiaru kinetyki najczęściej stosuje się spektrofotometrię UV-VIS. Jeśli żaden z substratów lub produktów reakcji nie posiada znaczącej absorpcji, stosuje się układ sprzężony, który z dużo większą szybkością (aby szybkość była limitowana tylko zachodzeniem głównej reakcji) od badanej reakcji nieodwracalnie przekształca któryś z produktów dając jednocześnie możliwość detekcji zmian. Mierzy się początkową szybkość reakcji, gdy cały proces biegnie liniowo, a zużycie substratu jest niewielkie i nie ma wpływu na tempo procesu. Stężenia substratu dużo wyższe od Km pozwalają na dość dokładne wyznaczenie kcat, stężenia niższe sprzyjają bardziej dokładnym pomiarom kcat/Km. Reakcje przeprowadza się równolegle. Po zmierzeniu szybkości reakcji należy optymalizować dane (szybkości reakcji dla odpowiadających im stężeń substratów) do równania kinetycznego (tutaj jest to równanie Michaelisa-Menten). Pomiary parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznych są obciążone dużymi błędami eksperymentalnymi, zwykle nie mniejszymi niż 5%. 3. Układ eksperymentalny stosowany w ćwiczeniu Do mieszaniny reakcyjnej należy dodawać duży nadmiar układu LDH (dehydrogenaza mleczanowa)/NADH (zredukowany dwunukleotyd nikotynamido-adeninowy). W pomiarach kinetyki reakcji katalizowanej przez TPL umożliwia to detekcję powstającego pirogronianu, albowiem w wyniku jego szybkiej, następczej redukcji do L-mleczanu NADH ulega utlenianiu do NAD+. Obydwie formy nukleotydu różnią się znacznie absorpcją przy długości fali 340nm, gdzie NAD+ ma absorpcję zaniedbywalnie małą, a NADH silnie absorbuje światło (milimolowy współczynnik ekstynkcji wynosi 6.22). Ponieważ stosuje się duży nadmiar LDH, o szybkości pojawiania się NAD+ (i wynikającego z tego spadku absorpcji) decyduje tylko i wyłącznie szybkość pojawiania się pirogronianu – produktu reakcji rozkładu L-tyrozyny. W celu wykonania pomiarów najpierw należy przygotować mieszaninę zawierającą wszystkie reagenty bez substratu (tzn. enzym, kofaktor, LDH, NADH), oraz oddzielnie roztwór substratu o stężeniu 3mM (trudno jest sporządzić roztwory tyrozyny o dobrze określonym wyższym stężeniu ze względu na niską rozpuszczalność tego aminokwasu w wodzie; jest to przyczyna zwiększenia błedów eksperymentalnych). Z przygotowanej mieszaniny bez substratu należy pobrać równe objętości do 6 kwarcowych kuwet, dodać odpowiednią ilość buforu, a potem substratu tak, aby końcowa objętość roztworu w każdej kuwecie była równa 1.5ml. Do pomiarów używa się zakresu stężeń substratu od 0.4mM do 2.5mM. Każda z sześciu kuwet zawiera inne stężenie substratu. Szybkość reakcji można przeliczyć ze spadku absorpcji w czasie. Ponieważ NADH ulega w warunkach reakcji powolnemu rozkładowi (30.4nM/min) należy uwzględnić poprawkę na tę reakcję uboczną. Uzyskane dane (zależność szybkości reakcji od stężenia substratu) z każdego równoległego pomiaru (dla sześciu stężeń substratu) wykorzystuje się do optymalizacji parametrów kinetycznych reakcji (kcat i kcat/Km) do równania Michaelisa-Menten. Optymalizację wykonuje się za pomocą programu Enzfitter 1.05. Następnie należy uśrednić parametry otrzymane z wszystkich pomiarów dla danego substratu. Błędy pomiaru wyznacza się z równania Studenta dla 95% poziomu ufności. 4. Procedura eksperymentalna: Należy przygotować mieszaninę zawierającą 0.326mM PLP (dodając 0.450ml 1mM roztworu), 0.652mM NADH (0.450ml 2mM), 88.4U/ml LDH z mięśnia królika (0.450ml 271U/ml), i 14.3nM (4.35U/ml) TPL z Citrobacter freundii. (0.030ml 0.658µM). Do sześciu kuwet kwarcowych o grubości 1.00cm należy dodać po 0.230ml sporządzonego roztworu, a następnie różne objętości buforu i 3mM roztworu L-tyrozyny tak, aby objętość roztworu wynosiła 1.5ml. Stężenie substratu w tak przygotowanych roztworach wynosiło od 0.5 do 2.5mM. Należy mierzyć równolegle początkowy spadek absorpcji we wszystkich 6 kuwetach przy 340nm za pomocą spektrofotometru UV-VIS 1202 Shimadzu. Uwzględniając milimolowy współczynnik NADH (6.22) należy wyznaczyć szybkości reakcji dla różnych stężeń substratu, a następnie fitować do nich kcat i kcat/Km używając równania MichaelisaMenten za pomocą programu Enzfitter 1.05 (Elsevier).