Aktywność mikroorganizmów wodnych

EKOFIZJOLOGIA MIKROORGANIZMÓW WODNYCH
I.
AKTYWNOŚĆ
ENZYMATYCZNA
PLANKTONU JEZIORNEGO
Prowadzący ćwiczenia:
Mgr Tomasz Kaliński
1
Aktywność enzymatyczna
mikroplanktonu
Uwagi ogólne
Aktywność ektoenzymów (m. inn. fosfatazy alkalicznej, aminopeptydazy,
β- i α-glukozydazy, N-acetylo-glukozaminazy), enzymów pozakomórkowych
(extracellular enzymes) oraz niektórych enzymów wewnątrzkomórkowych (m.
inn. esterazy i ureazy) jest, obok szybkości produkcji pierwotnej i wtórnej oraz
tempa respiracji, jednym z podstawowych parametrów charakteryzujących
aktywność metaboliczną mikroplanktonu.
Eksperymentalne określenie aktywności enzymu w wodzie polega na
dodaniu
do
badanej
próbki
jednego
ze
standardowych
substratów
enzymatycznych i pomiarze tempa przyrostu w niej stężenia barwnego lub
fluoryzującego produktu reakcji uwalnianego przez badany enzym. Jednakże ze
względu na dużą zmienność fizykochemicznych i biologicznych naturalnych
środowisk
wodnych, ilości
i
jakości
enzymów wytwarzanych
przez
mikroorganizmy wodne, a także na nie zawsze określone podobieństwo
substratu standardowego do substratów naturalnych pomiar rzeczywistej
aktywności określonego enzymu in situ jest niezwykle trudny a czasem wręcz
niewykonalny. Dlatego też w badaniach ekofizjologicznych rutynowo określa
się przede wszystkim tzw. potencjalną aktywność maksymalną enzymu (V max).
Wartość ta charakteryzuje maksymalną aktywność enzymu w badanej próbce
wody w określonych warunkach pomiaru i przy całkowitym wysyceniu
substratem dodanym do badanej próbki centrum aktywnych enzymu.
2
Stężenie substratu wysycające badany enzym w badanej próbce wody jest
zwykle
nieznane.
Jego
doświadczalne
wyznaczenie,
a
oszacowanie, jest warunkiem koniecznym dla ustalenia
przynajmniej
prawidłowych
warunków pomiaru Vmax. Zarówno ilość i jakość enzymu jak również pula jego
naturalnych substratów podlegają w środowiskach wodnych ciągłym i
dynamicznym zmianom. Dlatego też stężenie substratu konieczne do wysycenia
badanego enzymu w próbkach pobranych z różnych środowisk rzadko bywa
podobne. W krańcowych przypadkach, może wahać się ono nawet o rząd
wielkości. W praktyce więc zbyt mała (niewysycająca) ilość substratu dodanego
do badanych próbek przed pomiarem zaniża w sposób istotny wartość V max, zaś
duży jego nadmiar może czasami znacząco hamować aktywność niektórych
enzymów.
Dokładne doświadczalne wyznaczenie stężenia standardowego substratu
wysycającego badany enzym umożliwia procedura opisana w rozdziale
“Kinetyka reakcji enzymatycznej”.
Na
potrzeby
ćwiczeń
aktywność
badanych
enzymów
zewnątrzkomórkowych zostanie zmierzona w dwóch frakcjach: frakcji < 3.0
µm – zawierającej głównie aktywność związaną z bakteriami swobodnie
pływającymi i autotroficznym pikoplanktonem oraz frakcji całkowitej –
zawierającą także aktywność większych organizmów planktonowych i bakterii
osiadłych. W celu określenia aktywności we frakcji > 3 µm należy od Vmax
enzymu zmierzonego we frakcji całkowitej odjąć Vmax enzymu zmierzonego
we frakcji < 3.0 µm. W celu uzyskania frakcji < 3.0 µm należy przesączyć 50
ml próby przez filtr poliwęglanowy o średnicy porów 3.0 µm.
3
Kinetyka reakcji enzymatycznej
Uwagi ogólne
Zasada pomiaru
Szybkość rozkładu enzymatycznego substratów przez większość enzymów
hydrolitycznych (np. fosfatazy, aminopeptydazy, itp.) opisuje równanie
Michaelis’a-Menten:
Vmax x [S]
V=
Km + [S]
Zależność opisaną wzorem obrazuje wykres przedstawiony na Rys. 1.
Vmax
v (nmol/L/godz)
60
50
1/2 Vmax
40
30
20
Km
10
0
0
50
100
150
200
250
[s] (µmol/L)
Rys. 1. Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu.
4
v=
szybkość reakcji
Vmax = szybkość maksymalna reakcji zachodząca, kiedy wszystkie centra
aktywne enzymu zostały wysycone substratem. V max zależy of ilości i
aktywności enzymu w badanych próbkach.
Km = stężenie substratu, przy którym zachodzi połowiczna szybkość
maksymalna reakcji (1/2 Vmax). Km charakteryzuje powinowactwo
enzymu
do
substratu
(im
mniejsza
wartość
tym
większe
powinowactwo). Km nie zależy od ilości badanego enzymu w próbce;
na jego wartość może wpływać szereg warunków fizykochemicznych
środowiska reakcji enzymatycznej (np. obecność stymulatorów i/lub
inhibitorów enzymu)
[S] = stężenie substratu enzymatycznego
Parametry charakteryzujące powyższe równanie wylicza się na podstawie
określonej eksperymentalnie zależności szybkości reakcji enzymatycznej (v) od
stężenia substratu [S] dodanego do badanych próbek.
5
Aktywność L-Leucyno-Aminopeptydazy (AMP)
Zasada oznaczania
Aktywność
L-leucyno-aminopeptydazy
może
zostać
określona
z
wykorzystaniem sztucznego substratu L-leucyny-7-amido-4-metylkumaryny
(LAMK), którego hydroliza przez aminopeptydazę prowadzi do uwolnienia
silnie
fluorescencyjnego
rodnika
7-amino-metylkumaryny
(AMK).
Fluorescencję mierzy się przy ekscytacji 380 nm i emisji 440 nm.
L-leucyno- aminopeptydaza
LAMK
L-leucyna + 7-amino-metylkumaryna
(silnie fluorescencyjna)
Odczynniki
1. Substrat: L-Leucyna-7-amido-4-metylkumaryna (LAMK; m.cz. 324.8)
2. Produkt reakcji: 7-amino-metylkumaryna (AMK; m.cz. 175.2)
3. Etanol 95% (m.cz. 46.0)
Przygotowanie odczynników i roztworów
Standard 10 nM AMK
Rozpuścić 17.52 mg AMK w 10 ml alkoholu etylowego.
Roztwór substratu LAMK
Odważyć 16.240 mg L-leucyno-7-amido-4-metylkumaryny i w kolbce 25 ml
rozpuścić w alkoholu etylowym i dopełnić do kreski. 1 ml tak przyrządzonego
roztworu zawiera 2 µM substratu. Po dodaniu 0.1ml tego roztworu do 3.9 ml
próbki finalna koncentracja będzie 50 µM.
6
Oznaczenie
Kalibracja
Roztwory kalibracyjne sporządza się dodając do 3.9 ml wody destylowanej 0.1
ml odpowiedniego stężenia AMK etanolu tak aby ostatecznie uzyskać stężenia
0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 20, 50, 100, 200 nM. Roztwór wyjściowy 2 mM.
Próbki wody
Należy przygotować serię 7−9 probówek i napełnić je 3.9 ml badanej wody.
Przy spektro-fluorymetrze, z timerem w ręku, dodawać do kolejnych 3
probówek po 0.1 ml kolejnych stężeń (LAMK) tak aby uzyskać ostateczne
stężenia substratu w próbkach wynosiły 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0,
12.5, 15.0
µM. Po dodaniu substratu natychmiast wymieszać i mierzyć
fluorescencję (ekscytacja 336, emisja 444 nm) w czasie T0. Po 20 - 90 min.
inkubacji w ciemności, z timerem w ręku mierzyć fluorescencję próbek
ponownie. Wyniki podać jako przyrost stężenia AMK/godz.
Blank
Blank stanowi fluorescencja AMK (Fb) w badanych próbkach wody, w czasie
T0 inkubacji.
7
Obliczenia
Aktywność aminopeptydazy przy określonym stężeniu substratu (v) wyliczyć
wg wzoru:
[(Fp – Fb) – b ] * 60
AMP (nmol/l/godz) =
a*t
Fp
= fluorescencja próbki badanej po inkubacji
Fb
= fluorescencja próbki badanej w czasie T0 inkubacji
a, b = współczynniki równania regresji liniowej fluorescencji r-rów
kalibracyjnych
t
= czas inkubacji (min)
Szybkość reakcji enzymatycznej przy określonym stężeniu substratu (v)
oraz parametry kinetyczne hydrolizy LAMK przez AMP (Km+Sn ,Vmax oraz Tt)
określić analogicznie jak w przypadku EST.
8
Aktywność alkalicznej fosfatazy (APA)
Zasada oznaczenia
Fosfataza alkaliczna (APA; fosfohydrolaza monoestrów fosforowych; E.C.
3.1.3.1.) reagując z susbtratem sztucznym fosforanem 4-metylumbelliferonu
(MUFP) powoduje jego hydrolizę enzymatyczną uwalniając do środowiska
reakcji
silnie
fluorescencyjny
rodnik
(7-metylumbelliferon),
którego
fluorescencję mierzy się fluorometrycznie (ekscytacja 365 nm, emisja 460 nm)
w środowisku alkalicznym (pH = 10,2).
APA
4-metylumbelliferyl-PO43- + H2O
(nie fluorescencyjny)
H 20
4-metylumbelliferon + PO43(silnie fluorescencyjny)
Odczynniki
31. Substrat: 4-metylumbelliferyl-PO4 (MUFP; m.cz. 300.1)
2. Produkt reakcji: 4-metylumbelliferon (MUF; m.cz. 194.2)
3. Eter glikolu etylenowego (Cellosolve)
Przygotowanie odczynników i roztworów
1. Roztwór substratu 0,4 mM MUFP
Rozpuścić 24 mg MUFP w 1-2 ml Cellosolve, po całkowitym rozpuszczeniu
roztwór uzupełnić woda destylowaną do objętości końcowej 20 ml.
Uzyskany roztwór rozcieńczyć 10x wodą destylowaną. 1ml tak uzyskanego
r-ru „roboczego” zawiera 0,4 µmol MUFP, i po dodaniu 0.1 ml tegoż
9
roztworu do badanej próbki finalne stężenie MUFP w badanej próbce będzie
10.0 µM. Przygotowany roztwór roboczy, rozcieńczony wodą dejonizowaną
użyć do sporządzenia pozostałych roztworów „roboczych” substratu.
2. Standard 20 µM MUF
Rozpuścić 19.4 mg MUF w 10 ml Cellosolve. Rozcieńczyć 5 00x (100x a
nastepnie 5x) wodą dejonizowaną. 1 ml tak przygotowanego roztworu
zawiera 20 µmol MUF.
Oznaczenie
Kalibracja
Roztwory kalibracyjne sporządza się dodając do 3.9 ml zbuforowanej (pH 8)
wody destylowanej 0.1 ml odpowiedniego stężenia rozcieńczonego wodą
destylowaną standardu MUF tak, aby ostatecznie uzyskać stężenia 0.5, 1.0, 2.5,
5, 10, 20, 50, 100, 500 nM. Po sporządzeniu rozcieńczeń należy zmierzyć ich
fluorescencję (ekscytacja 365 nm, emisja 460 nm) i wykreślić zależność:
Fluorescencja = f (S) (krzywą wzorcową).
FluorescencjaMUF = a * [SMUF] + b
[SMUF] = (FluorescencjaMUF – b)/a
[SMUF] = stężenie MUF w standardize
a, b
= współczynniki kierunkowe prostej
Próbki wody
Należy przygotować serię 7-9 probówek i napełnić je 3.9 ml badanej wody.
Przy spektrofluorymetrze, z timerem w ręku, każdą z probówek uzupełnić 0.1
10
ml kolejnego roztworu „roboczego” MUFP tak, aby ostateczne stężenia
substratu w próbkach wynosiły 0.1 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0, µM.
Po dodaniu substratu każdą z próbek natychmiast wymieszać i zmierzyć
fluorescencję (ekscytacja 365, emisja 460 nm) w czasie T0 (Fb). Po 0.30 - 60
min. inkubacji w ciemności, z timerem w ręku mierzyć fluorescencję próbek
ponownie (Fp).
Blank
Blank stanowi fluorescencja MUF (Fb) w badanych próbkach wody, w czasie
T0 inkubacji.
Obliczenia
Aktywność APA przy określonym stężeniu substratu (v) wyliczyć wg wzoru:
[(Fp – Fb) – b ] x 60
v APA (nmol/l/godz) =
axt
Fp
= fluorescencja próbki badanej po inkubacji
Fb
= fluorescencja próbki badanej w czasie T0 inkubacji
a, b = współczynniki równania regresji liniowej fluorescencji r-rów
kalibracyjnych
t
= czas inkubacji (min)
Ponieważ zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia
substratu w badanych próbkach wody ma charakter funkcji hiperboli, aby
wyliczyć Vmax i Km analizuje się równanie regresji nieliniowej zależności v od
[S] stosując odpowiedni program komputerowy (np. Origin 6.1 lub Enzfitter,
Biosoft). Na podstawie parametrów (Vmax i Km) charakteryzujących kinetykę
11
enzymatycznej hydrolizy badanych związków organicznych wylicza się czas
potrzebny do całkowitego ich rozkładu w próbkach wody, tzw. "turnover time"
(Tt):
Tt = Km/Vmax
12