Chelidonium majus

Temat: Wpływ substancji czynnych izolowanych z Glistnika jaskółcze ziele
(Chelidonium majus) na wybrane szczepy bakterii i grzybów.
Streszczenie.
Celem przeprowadzonych doświadczeo było zbadanie wpływu ekstraktu z korzenia i liścia Glistnika
jaskółcze ziele (Chelidonium majus) na wzrost wybranych szczepów bakterii i grzybów.
Potwierdzono, że izolowane substancje z korzenia i liścia mają właściwości bakterio-i grzybobójcze.
Największe zahamowanie wzrostu wśród wybranych szczepów bakterii na wyciąg z korzenia
Chelidonium majus wykazały szczepy Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis oraz Micrococcus
luteus należące do bakterii Gram-dodatnich. U żadnej z badanych bakterii nie zaobserwowano
zahamowania pod wpływem ekstraktu z liścia. Wyciąg z obu części rośliny, dawał hamujący efekt
na szczep grzybów Candida albicans, zaś z korzenia na Candida glabrata.
Wstęp.
Wiele roślin stosowanych w medycynie ludowej działa bakteriobójczo i grzybobójczo.
Jedną z takich roślin jest Chelidonium majus. Ziele to wykorzystywano wcześniej
do smarowania brodawek, gdyż sok glistnika posiada silne właściwości drażniące.
Przed zastosowaniem zmiękczano brodawkę wodą z mydłem. Następnie smarowano
ją sokiem z „ziela kurzajkowego”, jak też nazywano tą roślinę. Dodatkowo roślina
ta była stosowana jako środek leczniczy na wszelkie choroby związane z wątrobą.
Obecnie w aptekach możemy spotkad wiele leków na bazie właśnie tej rośliny. Są
to głównie specyfiki zawierające domieszkę etanolu i wody. Mają zastosowanie jako
środek wspomagający proces usuwania piasku i kamieni z pęcherzyka żółciowego
oraz walkę z egzemą. Dodatkowo łagodzą objawy uporczywego kaszlu, a także
wspomagają pracę śluzówek i śledziony.
Badanie wpływu Glistnika jaskółcze ziele na bakterie i grzyby może przynieśd nowe
rozwiązanie dla wielu innych ważnych problemów, z którymi spotykamy się
codziennie i które dotyczą nie tylko naszego zdrowia, ale również gospodarki. Oprócz
odkrycia nowych możliwości w leczeniu chorób człowieka i zwierząt, tego typu
badania mogą prowadzid także do odkrycia nieznanych dotąd właściwości tej rośliny.
Może okazad się ona pomocna na przykład w leczeniu chorób roślin uprawnych.
Materiał badawczy i metody.
Na początku wybrano szczepy bakterii (Citrobacter freundii, Micrococcus luteus,
Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Sarcina spp)
oraz grzybów (Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida albicans, Candida
glabrata, Candida spp), które były w kolekcji mikroorganizmów Katedry
Mikrobiologii UG.
Następnie posiano je na podłoża krwawe w celu otrzymania pojedynczych kolonii
szczepów. Zastosowano posiew redukcyjny, aby dokładnie upewnid się,
że na szalkach znajdują się czyste kultury bakterii i grzybów.
Z dojrzałej, kwitnącej rośliny Chelidonium majus pobranej z podłoża wraz
z korzeniem w maju, pobrano liście i fragment korzenia. Odważono je w porcjach
po 2,5 g każda i zamrożono w temperaturze -70oC. Niska temperatura zapobiegała
-1-
rozkładowi materiału biologicznego. Po kilku dniach wyjęto po jednej porcji z części
nadziemnej i korzenia i ucierano je w 50 ml 96% etanolu do uzyskania homogennego
ekstraktu, po czym przełożono je do przeźroczystych słoiczków i włożono
do sonikatora, który poprzez użycie ultradźwięków (15 sec impuls, 1 min przerwa,
30 cykli), pozwalała na fragmentację błony komórkowej i uwolnienie zawartości
komórek wraz z substancjami czynnymi, które miały byd badane. Po wyjęciu
z sonikatora roztwór odparowano do sucha w 37oC, a powstały osad zważono
i zawieszono w 2 ml 96% etanolu. Określono stężenia obu ekstraktów jako
25 mg/ml. Wiele substancji czynnych z roślin nie rozpuszcza sie z wodzie,
a w alkoholach, stąd wybór etanolu. Tak przygotowanych ekstraktów użyto do
przeprowadzenia dwóch testów.
Test jakościowy. Przygotowane ekstrakty z liścia i korzenia Chelidonium majus
zakraplano na krążki bibuły o średnicy 6 mm, po 20 l na jeden. Następnie
przygotowano płytki z pożywką stałą LA (skład: 10 g tryptonu, 10 g chlorek sodu, 5 g
ekstrakt drożdżowy, 15 g agar, 1000 ml woda). W przypadku podłoża dla grzybów
Candida to samo podłoże LA zostało zakwaszone kwasem solnym do wartości
pH 5,5, co dało bardzie optymalne środowisko dla rozwoju tych organizmów.
Na podłoże LA wysiano murawę poszczególnych bakterii i grzybów, a następnie
na każdej płytce rozłożono po trzy wcześniej przygotowane krążki nasączone
odpowiednio: 20 μl ekstraktu z liścia, 20 μl ekstraktu z korzenia oraz 20 μl etanolu
jako kontroli. Materiał inkubowano w temperaturze 37oC przez noc, po czym
odczytano wynik doświadczenia, dokonując pomiaru wielkości przejrzystej strefy
wokół krążka, która świadczyła o braku wzrostu. Wykonano dwa powtórzenia.
Test ilościowy. Wybrano dwa szczepy bakterii i jeden grzyba i przystąpiono
do dokładnego badania wpływu ekstraktów Chelidonium majus na ich wzrost
w hodowli płynnej, w pożywce LB (pH - 7.0 dla bakterii oraz pH 5,5 w wypadku
Candida). Przygotowano hodowle nocne danego mikroorganizmu. Następnie
rozdzielono je do 3 kolb, po 20 ml pożywki oraz po 300 μl hodowli nocnej.
Po inkubowaniu hodowli w kolbkach w wytrząsarce w wodzie o temperaturze
37oC (bakterie) lub 30oC (dla grzybów) przez około 0,5 h dokonano pierwszego
pomiaru gęstości optycznej bakterii (OD) za pomocą spektrofotometru. Następnie
do trzech kolbek dodano: 50 μl etanolu (próba kontrolna), 50 μl wyciągu z korzenia
oraz 50 μl wyciągu z liścia Chelidonium majus. Poczym hodowle kontynuowano
i zbierano pomiary co 0,5 h, aż do czasu kiedy OD nie wzrastało.
Równolegle, wykonano preparaty mikroskopowe badanych mikroorganizmów
i oglądano w polu mikroskopu kształty pojedynczych bakterii. Przygotowano
preparaty rozprowadzając zawiesinę bakterii na szkiełku podstawowym
oraz utrwalając materiał poprzez ogrzewanie nad płomieniem palnika. Do barwienia
preparatów użyto błękitu metylenu. Następnie obserwowano komórki bakterii
pod mikroskopem.
-2-
Wyniki.
W teście jakościowym, gdzie badano bakterie i grzyby na pożywce stałej najpierw
upewniono sie, ze żaden mikroorganizm nie był wrażliwy na etanol w próbie
kontrolnej, w którym rozpuszczono ekstrakty rośliny. Największą wrażliwością
na wyciąg z korzenia i liścia odznaczył się Candida albicans (Rysunek 1). Strefy
hamowania w pobliżu krążków nasączonych ekstraktem z korzenia i liścia
wynosiły po 3 mm. U Candida glabrata zahamowanie wzrostu zaobserwowano
tylko na ekstrakt z korzenia (Rysunek 2), strefa hamowania wynosiła 4 mm.
Inne gatunki Candida okazały się odporne na substancje zawarte w korzeniu
i liściu Chelidonium majus.
Wśród bakterii największą strefę hamowania wzrostu odczytano u bakterii
Micrococcus luteus (Rysunek 3) oraz Bacillus subtilis (Rysunek 4). Dodatkowo
strefę hamowania dało się odczytad u bakterii Staphylococcus epidermidis
oraz Sarcina spp. U żadnej z bakterii nie odczytano stref hamowania przy krążku
z wyciągiem z liścia.
-3-
Dokładne wyniki doświadczenia na bakteriach i grzybach przedstawiono w tabeli,
by ułatwid ich odczyt (Tabela 1).
Strefa hamowania przez
Strefa hamowania przez
ekstrakt
ekstrakt
Gatunek grzyba
z korzenia
z liścia
z korzenia
z liścia
Citrobacter freundii
Candida parapsilosis
Micrococcus luteus
5 mm
Candida tropicalis
Bacillus subtilis
5 mm
Candida albicans
3 mm
3 mm
Staphylococcus epidermidis
4 mm
Candida glabrata
4 mm
Escherichia coli
Candida spp
Sarcina spp
3 mm
Tabela 1 Odczyt strefy hamowania danego ekstraktu. Minus (-) oznacza odpornośd na ekstrakt.
Gatunek bakterii
Do badao w podłożu płynnym wybrałam bakterię z największą strefą hamowania
przy krążku z ekstraktem z korzenia czyli Bacillus subtilis i bakterię która okazała
się najbardziej odporna na działanie wyciągu z Chelidonium majus, Escherichia
coli.
Podczas pomiarów okazało się, że najniższe OD odnotowano w kolbie z Bacillus
subtilis i wyciągiem z korzenia w stosunku do próby kontrolnej (Wykres 1),
zaś w kolbkach z Escherichia coli nie zauważono żadnego hamowania w stosunku
do próby z etanolem (Wykres 2).
Escherichia coli
Bacillus subtilis
4
4
OD 2
1
liść
0,5
liść
0,5
etanol
2
OD 1
etanol
korzeń
0,25
0,25
korzeń
0,125
0,125
0
0
2
czas (h)
4
6
2
4
6
8
10
czas (h)
Wykres 1 Wzrost hodowli Bacillus subtilis pod wpływem
ekstraktu C. majus
Wykres 2 Wzrost hodowli Escherichia coli pod wpływem
ekstraktu C. majus
Co do grzybów z rodzaju Candida do badao wybrano Candida glabrata, której
wyniki również potwierdziły poprawnośd wcześniejszego doświadczenia.
Dodatkowo odczytano hamowanie wzrostu, podobne do hamowania korzenia,
jednak
nieco
mniejsze,
Candida glabrata
pod wpływem wyciągu z liścia
0,4
Chelidonium majus (Wykres 3).
etanol
0,3
Postanowiono bliżej przyjrzed się
liść
komórkom
Bacillus
subtilis
OD 0,2
0,1
pod mikroskopem z powodu
korzeń
0
dużego hamowania wzrostu
0
2
4
6
przez wyciąg z korzenia.
czas (h)
Normalnie komórki tej bakterii Wykres 1 Wzrost Candida glabrata pod wpływem ekstraktu C. majus
-4-
są kształtu pałeczki. Pod wpływem podanej ilości etanolu (takiej jak przy próbie
kontrolnej), bakterie zachowały swój kształt (Rysunek 5A). Pod wpływem wyciągu
z korzenia Chelidonium majus skurczyły się i stały się okrągłe (Rysunek 5B), można
było zauważyd wśród nich także nieliczne wydłużone formy.
Dyskusja.
W Chelidonium majus stwierdzono obecnośd około 20 alkaloidów, które stanowią
0,5-4% soków rośliny. Ich stężenie w korzeniu jest prawie 20 razy większe niż
w części nadziemnej. Jak donosi literatura wiele z nich ma właściwości bakterioi grzybobójcze. Są to między innymi sangwineryna i cheledonina
(Colombo, Bosisio 1996). Roślina zawiera także alkaloid – cheleretrynę,
która wykazuje działanie bakterio- i fungistatyczne (Różaoski, Poznao 2001-2005).
Hamuje ona wzrost i namnażanie się komórek organizmów, ale nie zabija
istniejących już drobnoustrojów. Można wnioskowad, że to między innymi także
ta substancja zadziałała podczas przeprowadzonego doświadczenia.
Dodatkowo zauważono, że najbardziej hamujący wpływ wywiera on na bakterie
Gram-dodatnie, takie jak Bacillus subtilis czy Staphylococcus epidermidis,
zaś na bakterie Gram-ujemne, takie jak Escherichia coli, nie ma on żadnego
wpływu. Może mied to związek z budową osłon komórkowych. U bakterii
Gram-dodatnich ściana komórkowa jest gruba (kilkadziesiąt warstw), zbudowana
głównie z peptydoglikanu, zaś u bakterii Gram-ujemnych ma tylko dwie warstwy,
cienką peptydoglikanu i błonę zewnętrzną, zawierającą polisacharydy przyłączone
do lipidów (Solomon, Berg, Martin, 2007). Mając takie wyniki, mogę sugerowad,
że substancje zawarte w Chelidonium majus działają na komórki Gram-dodatnie
podobnie jak penicylina. Antybiotyk ten działa głównie na bakterie
Gram-dodatnie, zaburzając syntezę peptydoglikanu, przez co ściana komórkowa
staje się nietrwała i nie jest w stanie ochronid komórki (Solomon, Berg,
Martin, 2007).
U bakterii Bacillus subtilis zauważono słabą odpowiedź SOS. System ten włącza
się w komórce, jeśli dochodzi do uszkodzenia DNA lub innego stresu
-5-
(Singleton P., 2000). U wielu bakterii, jak i u Bacillus subtilis, kiedy komórka broni
się przed zagrożeniem ze strony zmian w DNA, kształt jej wydłuża się, ponieważ
naprawia ona swoje DNA, przez co wstrzymuje podziały aż do zakooczenia jego
naprawy. Pod wpływem etanolu zaobserwowano typowy kształt komórek Bacillus
subtilus (Rysunek 5A), jednak pod wpływem ekstraktów z Chelidonium majus w
preparacie zaobserwowano strzępki martwych bakterii (Rysunek 5B, czarna
strzałka), jak i komórki okrągłe, z niewielką otoczką dookoła (Rysunek 5B,
czerwona strzałka) oraz nieliczne wydłużone komórki (Rysunek 5B, zielona
strzałka). Obserwowane pod mikroskopem okrągłe formy bakterii mogą
potwierdzad, że skoro bakteria straciła swoje rusztowanie w postaci
peptydoglikanu, będzie dążyła do optymalnego dla niej kształtu kuli.
Możliwe, że substancje czynne „współdziałały” ze sobą w zwalczaniu bakterii.
Podczas przeprowadzonego doświadczenia działały razem substancje zarówno
bakterio- i grzybobójcze, jak i bakterio- i fungistatyczne. Może świadczyd o tym
obecnośd w badanej pod mikroskopem próbce zarówno bakterii przyjmujących
kształt okrągły, strzępek nieżywych bakterii oraz odpowiedzi SOS bakterii
pod wpływem stresu.
Można zastanowid się nad znaczeniem efektu bakteriobójczego ze strony
Chelidonium majus na bakterie Gram-dodatnie, gdyż może mied to duże
znaczenie dla przemysłu farmaceutycznego, ponieważ wiele gatunków takich
jak gronkowce czy paciorkowce należące do tej grupy, stanowią grupę
potencjalnych patogenów i przyczyniają się do wielu zakażeo, także szpitalnych.
Candida albicans występuje u ok. 40%-80% ludzi jako składnik flory przewodu
pokarmowego. Ona też może stad się groźna dla organizmu, czemu sprzyja
przewlekła antybiotykoterapia, osłabienie odporności, sztuczne zastawki,
cewniki, zabiegi inwazyjne etc. Pożytecznym byłoby prowadzenie dalszych badao
w zakresie wyizolowania z Chelidonium majus odpowiedniego leku na te
patogeny.
1.
2.
3.
4.
Literatura.
Colombo M. L., Bosisio E., Pharmacological activities of Chelidonium
majus L. (Papaveraceae), Institute of Pharmacological Sciences, University
of Milan, Italy 1996
Różaoski H.: Zioła w praktycznej terapii: Chelidonium maius (majus) L. –
glistnik jaskółcze ziele, Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego,
Zakład Historii Nauk Medycznych, Poznao 2001-2005
Singleton P., Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie, Wydawnictwo
Naukowe PWN, Waraszawa 2000
Solomon E. P., Berg L. R., Martin D. W.: Biologia, MULTICO Oficyna
Wydawnicza, Warszawa 2007
-6-