Zapisz jako PDF

Spis treści
1 Definicja
2 Pojęcia podstawowe
2.1 Faza stacjonarna i ruchoma (mobilna)
2.2 Współczynnik podziału (partition coefficient)
2.3 Czas i objętość retencji (retention time , volume )
2.4 Współczynnik migracji
2.5 Rozdzielczość
2.6 Liczba półek teoretycznych (N)
2.7 Wysokość półki teoretycznej
2.8 Poszerzenie pików
2.9 Krzywa van Deemetera (Rys. rys_2)
2.10 Współczynnik pojemności,
2.11 Współczynnik rozdziału
2.12 Uwagi
3 Elementy cieczowego systemu chromatograficznego
4 Typy chromatografii cieczowej
4.1 Filtracja żelowa (inaczej: sita molekularne, size exclusion chromatography, SEC)
4.2 Chromatografia jonowymienna
4.3 Chromatografia powinowactwa
4.3.1 Wiązanie ligandów
4.3.2 Aktywacja złoża
4.3.3 Elucja białek z kolumny
4.3.4 Chromatografia powinowactwa do unieruchomionych jonów metali (IMAC,
Immobilised Metal Affinity Chromatography)
4.4 Chromatografia odwróconej i normalnej fazy
4.5 Chromatografia oddziaływań hydrofobowych
4.5.1 Porównanie chromatografii oddziaływań hydrofobowych z chromatografią
odwróconej fazy
5 Rodzaje chromatografii cieczowej
5.1 Chromatografia otwartokolumnowa
5.2 HPLC (High Performance Liquid Chromatography – wysokosprawna chromatografia
cieczowa)
5.2.1 Budowa aparatu HPLC
5.3 Chromatografia FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)
5.4 Chromatografia perfuzyjna
5.5 Chromatografia membranowa
6 Projektowanie procedury oczyszczania
7 Chromatografia gazowa (Gas chromatography, GC)
7.1 Układ wprowadzania próbki
7.2 Podstawowe rodzaje kolumn
Definicja
Początkowo chromatografia dotyczyła separacji barwników na składowe obserwowalne w świetle
widzialnym. Jednym z pionierów tej techniki rozdziału substancji był Michaił Cwiet, który na
Politechnice Warszawskiej w 1905 roku dokonał separacji barwników w sproszkowanym węglanie
wapna (w kredzie).
Obecnie chromatografia (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze) to technika analityczna lub
preparatywna służąca do badania (rozdzielania) składu mieszanin związków chemicznych.
Wykorzystuje się w niej różnice w podziale składników mieszaniny między fazę stacjonarną i
ruchomą.
Pojęcia podstawowe
Faza stacjonarna i ruchoma (mobilna)
W chromatografii podział składników próbki odbywa się pomiędzy dwiema fazami, stacjonarną (np.
złoże kolumny), do którego przyczepia się część składników próbki oraz ruchomą (np. bufor), razem
z którą przemieszczają się inne składniki próbki pomiędzy ziarnami fazy stacjonarnej.
Materiały tworzące fazę stacjonarną powinny być stabilne mechanicznie, niereaktywne
chemicznie w warunkach ich zastosowań w chromatografii oraz powinny spełniać dodatkowe
wymagania (hydrofobowość, powinowactwo do ligandu) związane ze konkretnym typem
chromatografii. Typowe obojętne złoża to: celuloza, agaroza, sephadex, poliakrylamid, polistyren.
Złoża te różnią się wielkością ziaren, porowatością itp. Do nich przyłącza się grupy aktywne
związane ze stosowanym typem chromatografii.
Skład fazy ruchomej jest ściśle związany z materiałem próbki oraz z zastosowana metodą
chromatograficzną, może być ustalony, zmieniać się skokowo lub w sposób ciągły.
Współczynnik podziału (partition coefficient)
gdzie:
— stężenie molekuł danego rodzaju w fazie stacjonarnej i mobilnej. K' zależy od
warunków eksperymentu (temperatura, polarność roztworu itp.).
Czas i objętość retencji (retention time
, volume
)
gdzie: f – szybkość przepływu (ml/min).
Retencja zależy od powinowactwa cząsteczek do fazy ruchomej lub stacjonarnej i charakteryzuje
czas przebywania substancji chromatografowanej w kolumnie chromatograficznej.
Współczynnik migracji
Określa jak szybko porusza się dany składnik próbki w stosunku do prędkości czoła fazy ruchomej.
gdzie:
— prędkość ruchu i położenie składnika próbki,
i położenie czoła fazy ruchomej.
7mdash; prędkość ruchu
Rozdzielczość
Charakteryzuje zdolność do separacji cząsteczek. Pozwala ustalić jak efektywna jest dana kolumna w
separacji składników próbki.
gdzie: W — szerokość piku u podstawy dla danego składnika próbki, V — objętość retencji.
Rozdzielczość jest tym lepsza im piki są węższe (mała wartość W) i im lepiej rozseparowane (duże
).
— objętość po jakiej czoło fazy ruchomej dociera do końca kolumny. Jest równa objętości kolumny
i doprowadzeń roztworu minus objętość substancji, którą kolumna jest upakowana (Rys. Figure 1)
Rozdzielczość kolumny chromatograficznej
Liczba półek teoretycznych (N)
Liczba równowag absorpcji i desorbcji wzdłuż kolumny. Jest to wielkość charakteryzująca kolumnę i
bezpośrednio zależy od wielkość cząsteczek tworzących fazę stałą. Im wyższe N tym lepszy rozdział.
gdzie
— czas retencji, W — szerokość u podstawy dla danego piku.
Wysokość półki teoretycznej
Dwie kolumny o różnej długości mogą mieć tą sama ilość półek teoretycznych. Wtedy lepsza jest
krótsza kolumna. Określamy wysokość półki teoretycznej jako
gdzie L — długość kolumny. Im lepsza kolumna tym mniejsze H. Im więcej półek teoretycznych tym
mniejsze poszerzenie piku.
Poszerzenie pików
Nawet jeśli na kolumnę nałożymy pojedynczą próbkę w małej objętości
miał pewną szerokość i większą objętość
od nałożonej .
to schodzący pik będzie
Poza niewielka ilością półek teoretycznych wyróżniamy następujące przyczyny poszerzenia pików:
a. Dyfuzja wirowa.
b. Rozdział masy fazy ruchomej.
c. Zatrzymanie przepływu fazy ruchomej.
d. Oddziaływanie próbki z fazą stacjonarną .
gdzie :
— współczynniki dla cząsteczek tworzących fazę stacjonarną,
— średnica cząsteczek
fazy stacjonarnej,
— grubość fazy stacjonarnej, —szybkość przepływu fazy mobilnej,
i
—
współczynniki dyfuzji próbki w fazie ruchomej i stacjonarnej.
małe, możemy pominąć oraz zapisać równanie w postaci:
Obniżenie H może nastąpić poprzez zmniejszenie: średnicy cząstek fazy stacjonarnej
, rozmiaru cząsteczek próbki
.
, przepływu
Krzywa van Deemetera (Rys. rys_2)
Zależność H od szybkości przepływu fazy mobilnej, może być wykorzystywana do wyznaczenia
optymalnej szybkości przepływu fazy mobilnej. Korzysta się z empirycznego równania:
A — dyfuzja wirowa, B — dyfuzja wzdłuż kierunku ruchu fazy mobilnej, C' — przeniesienie masy.
Krzywa van Deemetera
Współczynnik pojemności,
Możemy go zapisać jako:
— objętość po jakiej czoło fazy ruchomej dociera do końca kolumny,
dla składnika 1.
— współczynnik pojemności
Współczynnik rozdziału
Definiujemy współczynnik rozdziału jako:
Im jest on wyższy, tym lepszy jest rozdział chromatograficzny.
Uwagi
Kształt pików zwykle odbiega od krzywej Gaussa.
Możliwe przyczyny: nieliniowa szybkość przepływu, niecałkowite rozdzielenie pików, stosowanie
gradientu przy wymywaniu substancji
Wprowadzone pojęcia są niezależne od rodzaju rozdziału chromatograficznego i typu próbki, mogą
być stosowane do porównania różnych typów chromatografii.
Dla dobrego rozdziału chromatograficznego wymagamy:
wysokiej rozdzielczości (R),
dużej liczby półek teoretycznych (N),
niskiej wysokości półki teoretycznej (H)
wysokiej wartości współczynnika rozdziału ( ).
Elementy cieczowego systemu chromatograficznego
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Bufory w rezerwuarach stanowiące fazę mobilną
Mikser
Pompy
Iniektor
Kolumna zawierająca materiał fazy stacjonarnej
Detektor
Rejestrator
Kolektor frakcji
Materiał fazy stacjonarnej i mobilnej zależy od właściwości separowanego układu.
Typy chromatografii cieczowej
Filtracja żelowa (inaczej: sita molekularne, size exclusion chromatography,
SEC)
Białka są rozdzielane ze względu na ich wielkość, masę i kształt. Cząsteczki za duże dla danego złoża
nie wnikają w jego pory i przechodzą przez kolumnę razem z czołem fazy ruchomej Natomiast małe
cząsteczki błądzą w żelu, im mniejsze tym dłużej przebywają w złożu. Zakres rozdziału molekuł
metodą filtracji żelowej jest ściśle związany z zastosowanym złożem (typowe złoża to: sephadex,
sepharose, saphacryl, biogel, fractogel).
Zastosowanie filtracji żelowej:
1. Usuwanie składników o małej masie z próbki (odsalanie). Zastosowanie w przypadku wymiany
buforów bez znacznego rozcieńczania próbki.
2. Wyznaczanie masy próbki (np. natywnego białka) przy znanych masach markerów nakładanych
na kolumnę razem z próbka lub osobno.
3. Rozdział peptydów, białek, kwasów nukleinowych, kompleksów białkowych i wirusów ze
względu na różnicę mas.
Chromatografia jonowymienna
W chromatografii jonowymiennej wykorzystuje się zależność wielkości ładunku białka w roztworze
od jego składu aminokwasowego i struktury, a tym samym od punktu izoelektrycznego (pI) oraz od
pH roztworu.
Pierwszym etapem separacji jest odwracalne wiązanie biomolekuł ze złożem. Białka w buforach o pH
< pI będą się wiązać z wymieniaczem jonowym poprzez jego grupy karboksylowe (z kationitem),
białka w buforach o pH >pI będą wiązane przez anionity, natomiast nie związane z kolumną związki
zostaną wypłukane.
Do rozdziału tego samego białka można używać zarówno anionitów i kationitów. Związane białka o
ładunku ujemnym wymywa się z kolumny buforem o zwiększającym się stężeniu chlorku sodu. Jony
chloru współzawodniczą z ujemnymi grupami białka o miejsca wiązania na złożu wypełniającym
kolumnę. Pierwsze uwalniają się białka słabo związane.
Złoże w chromatografii jonowymiennej tworzy baza powiązana z związkami chemicznymi, t.zw.
wymieniaczami jonowymi. Mogą to być wymieniacze anionowe lub kationowe, słabe (wąski zakres
pH) i silne (pracujące w szerokim zakresie pH).
Związki chemiczne związane ze złożem to naładowane dodatnio (anionity) lub ujemnie (kationity)
zawierające grupy polarne takie jak:
dwuetyloaminoetylowa (DEAE) –OCH2CH2NH+(CH2CH3)2 (słaby anionit, zakres pH 2 - 9),
czwartorzędowa zasada aminowa (QAE) – OCH2CH2N+(C2H5)CH2-CH(OH)-CH3 (silny anionit,
zakres pH 2 - 12),
reszta kwasu fosforowego –PO4H2- (silny kationit, zakres pH 2 - 12),
karboksymetylowa (CM) –OCH2COO- (słaby kationit, zakres pH 6 - 11).
Chromatografia powinowactwa
Chromatografia powinowactwa stosowana jest do rozdziału białek ze względu na ich duże
powinowactwo do specyficznych ligandów, które związane są ze złożem. Procedura obejmuje
następujące etapy:
kowalencyjne przyłączenie liganda do złoża ,
nałożenie mieszany białek i przemycie kolumny w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek,
elucja związanych z kolumną białek.
Ligandy stosowane w chromatografii powinowactwa musza spełniać następujące warunki:
posiadanie co najmniej jednej grupy aktywnej, która umożliwia związanie do złoża np.
aminowej, amidowej, karboksylowej, hydroksylowej, tiolowej,
powinowactwo do związku oczyszczanego,
stabilność w warunkach reakcji wiązania do złoża .
Wiązanie ligandów
Ligandy mogą być połączone bezpośrednio ze złożem lub poprzez „ruchome ramię”. Poprzez ramię
łączy się ligandy o niskiej masie cząsteczkowej oraz takie, do których przy bezpośrednim połączeniu
dostępność będzie ograniczona. Zwykle jako ramię stosuje się nierozgałęziony łańcuch
węglowodorowy, na którego końcu znajduje się grupa aktywna za pomocą której łączy się ligand.
Aktywacja złoża
Złoże (celuloza, agaroza, sephadex, poliakrylamid i inne) aktywuje się z użyciem odczynników jak
aldehyd glutarowy (białka, kwasy nukleinowe, aminy), siarczan dwuwinylu (wielocukry, aminy, grupy
tiolowe i fenolowe), benzochinon (białka, wielocukry, aminy), epichlorohydryna (wielocukry, kwasy
nukleinowe, aminy, grupy tiolowe i fenolowe).
Do zaktywowanego złoża przyłącza się ligand metodą inkubacji złoża z rozpuszczonym ligandem, a
następnie wysyca pozostałe miejsca aktywne na złożu inkubując kolumnę z etanoloaminą lub innymi
aminami takimi jak: lizyna, glukozamina. Zaktywowane złoże przechowuje się w obecności 0,02%
azydku sodu lub mertiolatu w temperaturze 4°C.
Elucja białek z kolumny
Białka związane z kolumną wymywa się odpowiednim buforem. Jako bufor elucyjny najczęściej
stosuje się:
roztwór liganda ,
roztwory zawierające jony chaotropowe najczęściej 3M roztwór rodanku potasu,
roztwory o niskim pH np. bufor octanowy o pH 3.0, bufor glicynowy o pH 2.5-3,
roztwory mocznika lub siarczanu dodecylu.
W przypadku denaturacji białka podczas elucji należy pamiętać, aby ten proces przeprowadzić
możliwie jak najszybciej oraz szybko usunąć czynnik denaturujący z wyeluowanego białka. C zasem
można stosować gradient powinowactwa, polegający na stopniowym zwiększaniu w fazie ruchomej
zawartości konkurującego ligandu. Jest to sposób separacji izoenzymów różniących się
powinowactwem do ligandu.
Popularne zastosowanie chromatografii powinowactwa:
białka eksprymowane w E. coli z glutatione-S-transferazą (GST),
GST wiąże się z glutationowo-agarozową kolumną,
białka mogą być wymywane za pomocą glutationu,
białko właściwe jest odłączane dzięki trawieniu trombiną miejsca połączenia z GST.
Chromatografia powinowactwa do unieruchomionych jonów metali (IMAC, Immobilised
Metal Affinity Chromatography)
Odmianą chromatografii powinowactwa jest chromatografia powinowactwa do unieruchomionych
jonów metali (IMAC, Immobilised Metal Affinity Chromatography).
W tym przypadku faza stacjonarna jest powiązana z metalem, np.:Cu,Zn, Ca, Ni, Fe, z którym łączą
się odpowiednie obszary białka.
Przykład: system z His-tagiem — białko jest eksprymowane z ogonem histagowym, który łączy się z
niklem. Histag może być usuwany z pomocą enterokinazy.
Chromatografia odwróconej i normalnej fazy
W chromatografii odwróconej fazy faza stacjonarna jest niepolarna (np. polimery), a faza ruchoma
jest fazą polarną (np. woda, metanol).
Cząsteczki biologiczne i ich fragmenty różnią się hydrofobowością. Fragmenty hydrofobowe wiążą
się z hydrofobowym złożem (węglowodorowym). Krótsze łańcuchy węglowodorów wiążą białka,
dłuższe — peptydy. W metodzie chromatografii odwróconej fazy białka są często zdenaturowane —
jest to dobra metoda do analizy białek, ma mniejsze zastosowanie w oczyszczaniu aktywnych
biologicznie cząsteczek.
W procesie separacji próbkę nakłada się w polarnym rozpuszczalniku (woda, metanol), a następnie
wymywa się poprzez zwiększający gradient roztworów organicznych (acetonitryl). Polarne próbki
wymywane są w pierwszej kolejności ze względu na słabe oddziaływania z hydrofobowa
powierzchnią.
W porównaniu z innymi typami chromatografii niewielka zmiana polarności, temperatury i pH
powoduje bardzo szybka reakcję składników próbki — bardzo duża rozdzielczość metody.
Chromatografia normalnej fazy jest rzadziej stosowana. W tym przypadku faza stacjonarna jest
polarna, a faza ruchoma niepolarna. Technika jest użyteczna dla białek słabo rozpuszczalnych, a
ponieważ wprowadzono ją jako pierwszą stąd nazwa chromatografia fazy normalnej.
Chromatografia oddziaływań hydrofobowych
Rozpuszczalne białka posiadają wodną otoczkę solwatacyjną, zasłaniającą grupy hydrofobowe. W
obecności reagentów wiążących wodę z otoczki, np. (NH4)2SO4, otoczkę można przerwać i
wyeksponować grupy hydrofobowe. W tym przypadku fazę stacjonarną stanowią związki
hydrofobowe, np. oktyl lub fenyl, a wymywanie odbywa się poprzez wzrost polarności roztworu (np.
zmniejszanie stężenia (NH4)2SO4).
Porównanie chromatografii oddziaływań hydrofobowych z chromatografią odwróconej fazy
Hydrofobowa faza mobilna w chromatografii odwróconej fazy często denaturuje białko.
Chromatografia odwróconej fazy zależy od całkowitej hydrofobowości białka.
W chromatografii oddziaływań hydrofobowych oddziaływania są związane z delikatnym
uszkodzeniem otoczki solwatacyjnej — oddziaływania hydrofobowe występują pomiędzy
powierzchnią białka i fazą stacjonarną — białka oczyszczane są w stanie aktywnym biologicznie.
Zastosowanie kolumn w zależności od typu chromatografii:
1. Filtracja żelowa — długie i wąskie kulumny.
2. Chromatografie związane z absorpcją cząstek przez złoże — krótkie i szerokie kolumny.
Rodzaje chromatografii cieczowej
Chromatografia otwartokolumnowa
Czasochłonna (godzinę lub dni, konieczność utrzymania niskiej temperatury),
niska rozdzielczość,
tania — wygodna do oczyszczań preparatywnych, kolumny o dużej pojemności,
faza stała złożona z żeli policukrowych jest miękka, stosuje się ciśnienie atmosferyczne,
zastosowanie w przemyśle np. produkcja białek o znaczeniu farmaceutycznym,
diagnostycznym (reagenty, dodatki do żywności).
HPLC (High Performance Liquid Chromatography – wysokosprawna
chromatografia cieczowa)
Najczęściej opiera się na chromatografii odwróconej fazy (RP).
Wysokie ciśnienie, przekraczające 100 atm w układzie HPLC wynika z:
budowy pomp HPLC (wąskie przekroje kapilar),
typu wypełnienia kolumn,
stosowanego przepływu fazy ruchomej (od ułamków ml/min do kilkudziesięciu ml/min).
Wysoka sprawność i rozdzielczość układu HPLC umożliwia rozdział analizowanych mieszanin
na poszczególne związki chemiczne w krótkim czasie, przy niewielkim zużyciu eluenta i małej
ilości analizowanej próbki.
Analiza próbki o objętości od 1 do 200 µl w analitycznej HPLC(w preparatywnej do
kilkudziesięciu mililitrów) trwa od kilku do kilkudziesięciu minut.
Kolumny HPLC mają przeciętnie długość od 3 do 25 cm, przekrój wewnętrzny rzędu kilku
milimetrów i mogą być zestawiane w układy.
Zużycie eluenta to kilkudziesiąt mililitrów (głównie są to rozpuszczalniki organiczne: metanol,
chlorek metylenu, THF, toluen, etanol, acetonitryl i inne.)
Budowa aparatu HPLC
Zbiornik na bufory,
automatyczny odgazowywacz,
zawory proporcjonujące, w których faza ruchoma osiąga zadany skład,
pompy,
nastrzykiwacz (iniektor) umożliwiający wprowadzanie analizowanych próbek bez
rozszczelnienia układu,
odpowiednie filtry,
prekolumna, która usuwa z eluenta zanieczyszczenia, mogące zniszczyć wypełnienie kolumn,
kolumna (kolumny) z odpowiednim wypełnieniem,
termostat,
detektor przepływowy: spektrofotometr UV-VIS absorpcyjny lub fluorescencyjny, spektrometr
mas, laserowy spektrometr rozproszeniowy, amperometr,
kolektor frakcji,
zbiornik na zużyty eluent.
Chromatografia FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)
Nie zawsze HPLC jest idealnym rozwiązaniem:
wymaga organicznych rozpuszczalników, które denaturują białka,
kolumny dedykowane HPLC o dużej pojemności są drogie, a małe mają mniejszą pojemność,
FPLC lepsze do rozdziału pochodnych DNA, nukleotydów, peptydów, białek, biopolimerów,
niższe ciśnienia, mniej przecieków,
różne kolumny, różne fazy stacjonarne i ruchome,
ciśnienia stosowane w FPLC są znacznie niższe niż w HPLC, max. 3-4 Mpa, co skutkuje
dłuższym czasem separacji cząstek.
Chromatografia perfuzyjna
Chromatografia perfuzyjna umożliwia duże szybkości przepływu ze względu na nowy typ
cząsteczek fazy stacjonarnej, a w związku z tym bardzo szybka separację cząsteczek.
W chromatografii perfuzyjnej cząsteczki fazy stacjonarnej posiadają duże prawie 1 μm kanały,
prze które ułatwiony jest szybki przepływ fazy mobilnej.
Cząsteczki wykorzystywane w chromatografii perfuzyjnej nazywane są POROS.
Chromatografia membranowa
warstwy membran zamiast kolumny.
Projektowanie procedury oczyszczania
Zdefiniować cel pracy (jakie białko, ilość, aktywność i czystość).
Określić właściwości białka i krytycznych zanieczyszczeń.
Określić metodę rozróżnienia białka i zanieczyszczeń.
Wybrać procedurę oczyszczania.
Zminimalizować czas kolejnych etapów oczyszczania.
Zminimalizować ilość dodawanych odczynników.
Jak najwcześniej zneutralizować/usunąć zanieczyszczania szkodzące białku (np. proteazy).
Używać różnych technik na każdym etapie oczyszczania (wykorzystać różne właściwości
białka: hydrofobowość, powinowactwo, rozmiar, ładunek).
Zminimalizować liczbę etapów oczyszczania.
Chromatografia gazowa (Gas chromatography, GC)
Fazę mobilną stanowi niereaktywny chemicznie gaz (najczęściej hel, argon, azot, dwutlenek
węgla).
Umożliwia ustalenie procentowego składu mieszanin związków chemicznych, nawet dla
kilkuset związków.
Detekcja klasyczna umożliwia przybliżoną identyfikację składników mieszaniny na podstawie
czasu retencji.
Pełna identyfikacja – gdy detektorem jest spektrometr masowy.
Zastosowanie: szybka analiza mieszanin związków chemicznych oraz ocena czystości tych związków
w: przemyśle petrochemicznym, ochronie środowiska, kryminalistyce, kontroli antydopingowej, w
przemyśle spożywczym.
Zaleta chromatografii gazowej — możliwość użycia niewielkiej próbki analizowanej substancji - od
0,01 μl.
Chromatografia gazowa opiera się na zjawisku występowania oddziaływań międzycząsteczkowych
między składnikami analizowanej mieszaniny i wypełnieniem kolumn.
Analizowana mieszanina jest przeprowadzana w fazę gazową w odparowywaczu. Następnie próbka
jest porywana przez gaz nośny i przechodzi przez długą kolumnę chromatograficzną, umieszczoną w
termostatowanym piecu, gdzie następuje rozdział mieszaniny na poszczególne związki chemiczne.
Na wyjściu znajduje się detektor, za pomocą którego wykrywa się i mierzy stężenie składników
mieszaniny w gazie nośnym oraz rejestrator.
Na czas retencji wpływ mają warunki analizy: temperatura, szybkość przepływu gazu nośnego,
wymuszanego przez ciśnienie podawane na szczyt kolumny.
Czas retencji w danych warunkach jest wartością specyficzną dla każdego składnika analizowanej
mieszaniny.
Składniki próbki analizowane metodą chromatografii gazowej muszą być lotne i trwałe w
temperaturze analizy. Najczęściej są to rozmaite mieszaniny gazów i roztwory zawierające lotne
związki chemiczne.
Układ wprowadzania próbki
Układ nastrzykowy składa się z membrany, którą nakłuwa się igłą strzykawki chromatograficznej
oraz odparowywacza, w którym następuje odparowanie składników próbki. Odparowywacz to rurka
metalowa lub szklana otoczona spiralą grzejną, która rozgrzewa rurkę do ponad 200 °C.
Nastrzyki wykonuje się ręcznie (za pomocą strzykawki) lub automatycznie (z użyciem
autodozownika).
Autodozownik to urządzenie, w którym wstawia się fiolki z analizowanymi mieszaninami w
odpowiednich miejscach a specjalny manipulator pobiera do strzykawki odpowiednią objętość
analizowanej próbki i nastrzykuje ją do aparatu.
Najważniejszą częścią układu nastrzykowego jest miejsce, do którego trafia próbka po pobraniu jej
przez autodozownik lub strzykawkę.
dozownik typu split — nastrzyknięta próba trafia do rozdzielacza, w którym ściśle ustalona
część nastrzyku jest kierowana do odparowywacza, reszta trafia do tzw. martwej pętli.
dozownik on-column — cała próbka trafia od razu na kolumnę.
Podstawowe rodzaje kolumn
Kolumny z wypełnieniem stałym.
Kolumny z wypełnieniem stało-ciekłym.
Kolumny kapilarne.
Piec — odizolowany od otoczenia i wysokowydajny grzejnik z dokładną kontrolą temperatury.
Wewnątrz pieca umieszczona jest zwinięta w pętlę kolumna.
Detektor w chromatografie gazowym mierzy stężenie wypływających związków w gazie nośnym.
Przykłady detektorów:
Detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID).
Detektor foto-jonizacyjny [PID].
Detektor masowy.
Rejestrator — zwykle komputery wraz z oprogramowaniem umożliwiającym sterowanie parametrami
pracy całego aparatu i gromadzenie oraz analizowanie chromatogramów.