7PŒYW METIONINY NA TOKSYCZNOu¿ FLUORU W OSOCZU

7PŒYW METIONINY NA TOKSYCZNOu¿ FLUORU W OSOCZU

&ARM0RZEGL.AUK†
7PŒYWMETIONINYNATOKSYCZNOu¿FLUORU
WOSOCZUKRWISZCZURÌW
4HEEFFECTOFMETHIONINEONTOXICITYOFFLUORIDEINBLOODPLASMAOFRATS
)WONA"ŒASZCZYK%WA"IRKNER%WA2OMUK
:AKŒAD"IOCHEMII/GÌLNEJ+ATEDRY"IOCHEMIIW:ABRZUgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Zbadano wpływ metioniny na system antyoksydacyjny
osocza podczas intoksykacji fluorkiem sodu. Badania przeprowadzono na 18 dorosłych szczurach, samicach szczepu
Wistar FL, którym podawano wodę destylowaną, NaF lub
NaF wraz z metioniną (NaF: 10 mg/kg m.c./dobę, metionina: 10 mg/kg m.c./dobę) przez okres 35 dni. Oznaczono
aktywność całkowitą SOD oraz jej izomerów: CuZnSOD
i MnSOD, stężenie jonów fluorkowych, a także całkowitą
zdolność antyoksydacyjną (FRAP) w osoczu krwi.
Stwierdzono niekorzystny wpływ podawanego NaF na
układ antyoksydacyjny szczurów (zmniejszenie aktywności SOD, CuZnSOD, MnSOD oraz FRAP). Suplementacja
metioniną spowodowała wzrost aktywności CuZnSOD,
całkowitej zdolności antyoksydacyjnej osocza i zmniejszenie stężenia jonów fluorkowych. Zatem metionina wykazuje korzystne działanie w czasie zatrucia fluorkiem
sodu.
Słowa kluczowe: fluor, metionina, dysmutaza ponadtlenkowa, całkowita zdolność antyoksydacyjna, osocze,
szczury.
Wstęp
Skażenie wody pitnej i żywności związkami fluoru
oraz powszechne stosowanie ich w stomatologii to główne
przyczyny nadmiernego narażenia na fluor. Jony fluorkowe
przenikając przez błony komórkowe indukują wiele stanów
patologicznych, w tym tworzenie nieprawidłowej struktury
kości i zębów [1,2], zaburzenia funkcji nerek [3] i wątroby
[4].
W mechanizmie toksycznego działania fluoru istotną
rolę odgrywa jego zdolność do wywoływania stresu oksydacyjnego poprzez indukowanie wzmożonych procesów wolnorodnikowych [5]. Wolne rodniki powodują utlenianie lipidów, DNA, białek a nawet wolnych aminokwasów. Jednak
utlenianie metioniny (Met) jest reakcją odwracalną. Uważa
się nawet, że cykliczne procesy utleniania metioniny do sulfotlenku metioniny (MetO) i redukcji MetO mogą stanowić
ważny mechanizm antyoksydacyjny. Przypuszczalnie reszty
metioninowe białek pełnią funkcję odtwarzalnych zmiataczy reaktywnych form tlenu i azotu [6].
Celem przeprowadzonych badań było określenie jaki
wpływ może mieć podawanie metioniny w czasie intoksy-
Abstract
The aim of the study has been to determine the influence
upon the plasma antioxidative system, exercised by administration of methionine (Met), under exposure to sodium fluoride. The experiment was carried out on Wistar
FL rats (adult females) that, for 35 days, were administered distilled water, NaF or NaF with methionine (doses:
10 mg NaF/kg bw/day, 10 mg Met/kg bw/day). The influence of administered NaF and Met was examined by analyzing the activity of superoxide dismutase (SOD- total
and both its isoenzymes: CuZnSOD and MnSOD), fluoride concentration and total ability antioxidant (FRAP) in
blood plasma.
The studies carried out confirmed the disadvantageous effect of NaF upon the antixodative system in rats (decrease
activity of SOD, CuZnSOD, MnSOD, FRAP). The administration of methionine increased the activity of CuZnSOD, total ability antioxidant and decreased the concentration of fluoride in blood plasma. Therefore methionine
has an ameliorative effect on NaF-exposed rats.
Key words: fluoride, methionine, superoxide dismutase,
total ability antioxidant, plasma, rats.
kacji fluorkiem sodu na całkowitą zdolność antyoksydacyjną
osocza, aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) oraz
stężenie jonów fluorkowych w osoczu krwi szczurów.
Materiał i metody
Badania przeprowadzono na 18 dorosłych, 3-miesięcznych szczurach, samicach szczepu Wistar FL, o masie 200g. Zwierzęta pochodziły z Centrum Medycyny Doświadczalnej SUM w Katowicach. Na przeprowadzenie
eksperymentu uzyskano zgodę Komisji Etycznej Śląskiego
Uniwersytetu Medycznego (zgoda nr 29/2006).
W trakcie doświadczenia zapewniono zwierzętom
12-godzinny cykl dzienno-nocny oraz swobodny dostęp
do wody i standardowej paszy (Labofeed B). Po dwutygodniowym okresie adaptacyjnym szczury umieszczono
pojedynczo w klatkach i podzielono na 3 grupy liczące po
6 osobników.
1. Grupa kontrolna (Kontrola) - szczury, które do picia
otrzymywały wyłącznie wodę destylowaną.
2. Grupa fluorkowa (NaF) - zwierzęta otrzymujące NaF
(Sodium fluoride, POCH Gliwice) w dawce 10 mg/kg
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
m.c./dobę [7], w postaci roztworu (w ilości 10 ml), a po
jego wypiciu miały swobodny dostęp do wody destylowanej.
3. Grupa fluorkowo-metioninowa (NaF+Met) - szczury,
które otrzymywały NaF w dawce 10 mg/kg m.c./dobę
[7] oraz metioninę (L-Methionine, Sigma) w dawce
10 mg/kg m.c./dobę [7].
Eksperyment prowadzono przez okres 5 tygodni. Po tym
czasie zwierzęta usypiano, stosując iniekcję dootrzewnową
1% roztworem heksobarbitalu, w dawce 0,5 ml /100g m.c.
Do dalszych badań pobrano krew na heparynę, a w osoczu
krwi oznaczono:
- stężenie jonów fluorkowych (F - ) przy użyciu jonoselektywnej elektrody fluorkowej Orion 96-09 (USA),
- całkowitą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD)
[EC 1.15.1.1] oraz jej izoenzymów CuZnSOD i MnSOD
metodą Oyanagui [8],
- całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza (FRAP)
wg metody Benzie i Strain [9].
Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej, wykorzystując test ANOVA Kruskala-Wallisa oraz U MannaWhitney’a. Za znamienne statystycznie przyjęto zmiany
przy poziomie istotności p a 0,05.
Wyniki
Uzyskane wyniki przedstawia tabela I.
Stwierdzono zwiększone stężenie jonów fluorkowych
w osoczu krwi szczurów grupy NaF i zmiana ta była statystycznie znamienna w porównaniu z kontrolą. U zwierząt,
które dodatkowo otrzymywały metioninę stężenie F- było
mniejsze zarówno w stosunku do kontroli jak i grupy NaF
(znamienność statystyczna).
Wykazano niekorzystny wpływ fluorków na aktywność dysmutazy ponadtlenkowej. W grupie NaF wystąpiło
zmniejszenie całkowitej aktywności SOD (zmiana statystycznie znamienna) oraz jej obu izoenzymów CuZnSOD
i MnSOD w porównaniu z grupą kontrolną.
Podawana metionina częściowo ograniczała szkodliwe
działanie fluoru, zwiększając aktywność CuZnSOD, ale
zmniejszając aktywność SOD i MnSOD (znamienność statystyczna) w stosunku do kontroli.
Zdolność antyoksydacyjna osocza zmniejszyła się w
osoczu krwi szczurów po ekspozycji na NaF (zmiana statystycznie znamienna w porównaniu z grupa kontrolną), natomiast w grupie NaF+Met uległa zwiększeniu.
Dyskusja
W Polsce spożycie fluorków wraz z niektórymi produktami spożywczymi może przekraczać zalecaną bezpieczną
dawkę, a podstawowym źródłem fluoru w diecie jest woda
i napoje z ekstraktem herbaty [10]. Po doustnym przyjęciu
F- jest wchłaniany z przewodu pokarmowego, a jego transport z krwią do tkanek i narządów może prowadzić do wielu zmian strukturalnych i funkcjonalnych [1-4]. Toksyczne
działanie fluoru wynika m.in. z właściwości generowania
wolnych rodników i hamującego wpływu na aktywność
enzymatycznego układu antyoksydacyjnego [5,7]. Badania
naukowe dowodzą, że związki fluoru mogą indukować powstawanie anionorodnika ponadtlenkowego oraz rodnika
hydroksylowego [11].
Narażenie na fluorki skutkuje zwiększeniem ich stężenia w surowicy [2]. Potwierdzają to wyniki prezentowanego
eksperymentu. Przyjmowany fluorek sodu wywołał zwiększenie stężenia F- w osoczu krwi szczurów. Podawanie metioniny skutecznie temu wzrostowi przeciwdziałało choć
mechanizm tego zjawiska pozostaje nieznany. Poza tkankami miękkimi fluorki są w znacznej części wiązane przez
tkankę kostną i zęby [2]. Niestety brak doniesień na temat
tego, czy metionina wpływa na tę kumulację, w ten sposób
zmieniając stężenie F- w osoczu.
Nadmierna podaż jonów fluorkowych jest czynnikiem
rozwoju stresu oksydacyjnego. W tym czasie wzmożone lub
niekontrolowane powstawanie wolnych rodników prowadzi
do nasilonej peroksydacji lipidów [5,7]. Ograniczone przenikanie F- do osocza może wynikać z ochronnej roli podawanej metioniny wobec błon komórkowych. Wiadomo, że
metionina uczestniczy w syntezie choliny, składnika lecytyny i sfingomieliny, które budują komórkowe membrany
[12]. Poza tym metionina dzięki cyklicznym przemianom
utleniania i redukcji może również uczestniczyć w zmiataniu wolnych rodników. Jej utlenianie, jako wolnego aminokwasu lub jako białkowych reszt metioninowych prowadzi
do powstania mieszaniny izomerów R i S-sulfotlenku metioniny (MetO). W obecności reduktazy sulfotlenku metioniny (Msr), tioredoksyny, reduktazy tioredoksyny i NADPH
następuje redukcja MetO ponownie do metioniny.
Met + H2O2 l MetO + H2O
MetO + NADPH + H+ l Met + NADP+ + H2O
zięki tym procesom metionina może unieszkodliwiać
rodnik hydroksylowy, nadtlenek wodoru i tlen singletowy,
ograniczając procesy peroksydacji lipidów [6]. Potwierdzają to badania stężenia dialdehydu malonowego, jednego ze
Tab. I. Stężenie jonów fluorkowych, aktywność dysmutazy ponadtlenkowej oraz całkowita zdolność antyoksydacyjna
osocza krwi szczurów.
Grupa
Kontrola
NaF
NaF+Met
Stężenie F[μmol/l]
5,59 ±0,57
7,89 ± 0,49a
4,21 ± 0,74a,b
Aktywność SOD
[NU/ml]
33,60 ± 0,84
31,90 ± 0,75a
31,10 ± 0,60a
Aktywność
MnSOD [NU/ml]
7,98 ± 1,78
6,50 ± 1,33
4,97 ± 1,83a
a – wyniki statystycznie znamienne (p a 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną
b – wyniki statystycznie znamienne (p a 0,05) w porównaniu z grupą NaF
Aktywność
CuZnSOD [NU/ml]
25,60 ± 1,47
25,40 ± 1,40
26,20 ± 1,94
FRAP [μmol/l]
226,50 ± 23,87
157,3 ± 26,4a
175,0 ± 43,10
&ARM0RZEGL.AUK
wskaźników utleniania lipidów w wątrobie, nerkach, erytrocytach i osoczu krwi [7]. Zatem metionina ochraniając błony plazmatyczne przed destrukcyjnym działaniem wolnych
rodników oraz uczestnicząc w regeneracji tych struktur być
może zapobiega przenikaniu fluorków do osocza.
Fluor wpływa również na aktywność enzymów antyoksydacyjnych [5]. Jednym z nich jest dysmutaza ponadtlenkowa, która katalizuje reakcję dysmutacji anionorodnika
ponadtlenkowego, w efekcie której powstaje nadtlenek wodoru i tlen.
2O2u- + 2H+ l H2O2 + O2
Na całkowitą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej
składa się aktywność jej izoenzymów MnSOD i CuZnSOD.
Aktywność MnSOD jest uwarunkowana dostępnością manganu. CuZnSOD jest natomiast enzymem miedzio- i cynko-zależnym, a rola obu pierwiastków wchodzących w jego
skład jest różna. Cynk utrzymuje strukturę trzeciorzędową,
miedź jest odpowiedzialna za aktywność katalityczną enzymu, będąc jego aktywatorem [13].
Fluor powoduje zmiany aktywności SOD. Zmiany te
wynikają m.in. z hamowania biosyntezy enzymu o czym
może świadczyć zmniejszenie stężenia mRNA CuZnSOD
w wątrobie [14]. Nadmierna lub długotrwała ekspozycja na
fluorek sodu przyczynia się do zmniejszenia aktywności CuZnSOD i MnSOD w trzustce [15] oraz nerkach szczurów
[5]. Fluorki przyłączają się do centrum katalitycznego CuZnSOD, będąc jego kompetycyjnym inhibitorem. Poza tym
fluor wiąże jony magnezu, cynku i manganu [16]. To może
tłumaczyć obniżoną aktywność SOD u zwierząt poddanych
intoksykacji fluorkiem sodu.
W opisywanym doświadczeniu szkodliwe działanie fluorków częściowo znosiła podawana metionina. Wystąpiło
bowiem zwiększenie aktywności CuZnSOD, ale zmniejszenie całkowitej aktywności SOD i MnSOD.
Metionina jest chelatorem metali ciężkich m.in. Cd,
Hg, Pb. Niektórzy autorzy sugerują nawet, że podstawowa
ochronna rola reszt metioninowych albumin to wiązanie jonów tych metali, nie zaś bezpośrednie zmiatanie wolnych
rodników [17]. Metionina może wpływać na stężenie miedzi [18] i być może uczestniczy również w metabolizmie
Zn i Mn, wpływając ostatecznie na aktywność dysmutazy
ponadtlenkowej.
Wyniki eksperymentu wskazują na niekorzystny wpływ fluorku sodu na całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza.
Działanie to wyraźnie znosiła podawana metionina, zapewne dlatego, że oprócz bezpośredniego zmiatania wolnych
rodników, uczestniczy w syntezie i działaniu innych antyoksydantów. Jednym z najważniejszych antyoksydantów
płynów ustrojowych jest bowiem glutation, który reaguje
m.in. z rodnikiem OHu, a powstałe rodniki GSu są neutralizowane w reakcji dysmutacji [19]. Komórkowa homeostaza
zredukowanego glutationu jest utrzymywana przez syntezę
z metioniny i cysteiny oraz regenerację jego utlenionej formy
i absorpcję zewnątrzkomórkowego glutationu. Ponad połowa Met jest zużywana do syntezy glutationu w wątrobie,
który jest przekazywany potem do osocza [20]. Peterson i
wsp. [21] wykazali, że nawet w przypadku diety ubogiej w
Se i witaminę E, która skutkuje m.in. zmniejszeniem zawartości glutationu, suplementacja wyłącznie Met przywraca
jego prawidłowe stężenie.
Podaż glutationu warunkuje również prawidłową aktywność peroksydazy glutationowej, enzymu antyoksydacyjnego osocza, który katalizuje reakcję rozkładania H2O2
i nadtlenków lipidowych [19]. Podobnie jest w przypadku
antyoksydacyjnych właściwości witaminy C, obecnej w
osoczu w postaci anionu askorbinianowego, który w czasie
zmiatania rodników tlenowych przekształca się w dehydroaskorbinian. Aby zaszła reakcja redukcji dehydroaskorbinianu ponownie do askorbinianu niezbędny jest glutation,
a jak wykazano fluorki zmniejszają stężenie glutationu we
krwi i wątrobie [22].
Metionina poza uczestnictwem w syntezie glutationu,
odgrywa również ważną rolę w wiązaniu, transporcie i bioaktywności selenu w organizmie, zwiększając jego przyswajanie [21]. Selen wchodzi w skład peroksydazy glutationowej [19] oraz reduktazy sulfotlenku metioniny i reduktazy
tioredoksyny [6]. Tak więc synteza i funkcja tych enzymów
wymaga obecności selenu, podczas gdy zwiększona podaż
fluorków powoduje nasilone wydalanie selenu z moczem
i niedobory tego pierwiastka w organizmie [23].
Na podstawie wyników przeprowadzonego eksperymentu można stwierdzić, że podawanie metioniny w przypadku
zatrucia fluorkiem sodu może być bardzo korzystne z uwagi
na fakt wzmocnienia całkowitej zdolności antyoksydacyjnej osocza i redukcji stężenia jonów fluorkowych w osoczu
krwi.
Wnioski
1.
2.
3.
Nadmierna ekspozycja na NaF skutkuje zwiększeniem
stężenia jonów fluorkowych w osoczu, czemu skutecznie przeciwdziała podawanie metioniny.
Fluor hamuje aktywność dysmutazy ponadtlenkowej,
natomiast metionina nieznacznie zwiększa aktywność
izoenzymu CuZnSOD.
Metionina zwiększa całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza w czasie zatrucia fluorem.
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
Wang J i wsp. Amino acid composition and histopathology of goat teeth in an industrial fluoride polluted area.
Fluoride 2003; 36: 177-184.
Grucka-Mamczar E i wsp. Wpływ kofeiny i fluorku
sodu na stężenie fluorków w surowicy krwi i ich zawartość w zębach i kościach szczurów. Ann Acad Med
Stetin 2006; 52: 37-40.
Rao MV, Chawla SL, Patel N. Melatonin reduction of
fluoride-induced nephrotixicity in mice. Fluoride 2009;
42: 110-116.
He LF, Chen JG. DNA damage, apoptosis and cell
cycle changes induced by fluoride in rat oral mucosal
cells and hapatocytes. World J Gastroenterol 2006; 12:
1144-1148.
Błaszczyk I i wsp. Influence of fluoride on rat kidney
antioxidant system: efects of methionine and vitamin E.
Biol Trace Elem Res 2008; 121: 51-59.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Moskovitz J. Roles of methionine sulfoxide reductases
in antioxidant defense, protein regulation and survival.
Curr Pharm Des 2005; 11: 1451-1457.
Błaszczyk I i wsp. Influence of methionine upon the
concentration of malondialdehyde in the tissues and
blood of rats exposed to sodium fluoride. Biol Trace
Elem Res 2009; 129: 229-238.
Oyanagui Y. Revaluation of assay methods and establishment of kid for superoxide dismutase activity. Anal
Biochem 1984; 142: 290-296.
Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: The
FRAP assay. Anal Biochem 1996; 239: 70-76.
Dębiński A i wsp. Zawartość fluoru w diecie populacji
polskiej – próba oszacowania. Żyw Człow Metab 2006;
4: 300-308.
Przybylska D, Długosz A. Wpływ fluorku sodu na procesy
wolnorodnikowe. Bromat Chem Toksykol 2007; 1: 9-14.
Brosnan JT, Brosnan ME. The sulfur-containing amino
acids: an overview. J Nutr 2006; 136: 1636-1640.
Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Ann Rev Biochem 1995; 64: 97-112.
Zhan XA i wsp. Effects of fluoride on hepatic antioxidant system and transcription of Cu/Zn SOD gene in
young pings. J Trace Elem Med Biol 2006; 20: 83-87.
Chlubek D i wsp. Activity of pancreatic antioxidantive enzymes and malondialdehyde concentations in rats
with hyperglycemia caused by fluoride intoxication. J
Trace Elem Med Biol 2003; 17: 57-60.
16. Machoy Z. Biochemiczne mechanizmy działania związków fluoru. Folia Med Cracov1987; 1-2: 61-78.
17. Bourdon E i wsp. Differential effects of cysteine and
methionine residues in the antioxidant activity of human serum albumin. Free Radic Res 2005; 39: 15-20.
18. Patra RC, Swarup D. Effect of antioxidant ascorbic
acid, l-methionine or A tocopherol alone or along with
chelator on cardiac tissue of lead-treated rats. Veterinarski Archiv 2004; 74: 235-244.
19. Shoveller AK i wsp. Nutritional and functional importance of intestinal sulfur amino acid metabolism. J Nutr
2005; 135: 1609-1612.
20. Garcia RAG, Stipanuk MH. The splanchnic organs, liver and kidney have unique roles in the metabolism of
sulfur amino acids and their metabolites in rats. J Nutr
1992; 122: 1693-1701.
21. Brigelius-Flohe R. Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases. Free Radic Biol Med
1999; 27: 951-965.
22. Kaushik T i wsp. Glutathione metabolism in rats to high-fluoride water and effect of spirulina treatment. Fluoride 2001; 34: 132-138.
23. Wąsowicz W, Gołębiowska M, Chlebna-Sokół D. Increased urinaty excretion of selenium in children- a response to surplus fluoride in drinking water. Trace Elem
Med 1988; 5: 43-46.
Adres do korenspondencji:
dr n.med. Iwona Błaszczyk
Zakład Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Jordana 19, 41-808, Zabrze
tel./fax +48 32 272 23 18
e-mail: [email protected]