Pobierz plik

Prof. dr hab. n. med. Paweł Grieb
Kierownik Zakładu Farmakologii Doświadczalnej
Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej
im. Mirosława Mossakowskiego Polskiej Akademii Nauk
02-106 Warszawa,
ul. Pawińskiego 5
tel.: (0-22)- 608-64-74
fax: (0-22)- 608-65-27
E-mail: [email protected]
Warszawa, 19.08.2016
Recenzja rozprawy doktorskiej mgr inż. Anny Antosiewicz
p.t. „Oddziaływania między ludzkimi enzymami cyklu syntezy tymidylanu:
syntazą tymidylanową i reduktazą dihydrofolianową”
Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska Pani mgr inż. Anny Antosiewicz
napisana pod kierunkiem Pani dr hab. Joanny Cieślik z Wydziału Chemicznego
Politechniki Warszawskiej obejmuje badania interakcji pomiędzy dwoma ludzkimi
enzymami o kluczowym znaczeniu dla szlaku syntezy tymidylanu, syntazą
tymidylanową (TS) i reduktazą dihydrofolianową (DHFR). Te współdziałające ze sobą
enzymy mają istotne znaczenie dla życia komórek, w szczególności dla komórek
dzielących się (proliferujących) - biorą one bowiem udział w jedynym szlaku syntezy de
novo prekursora DNA, tymidylanu.
Właściwości tych dwóch enzymów są bardzo ważne dla medycyny. Ich „klasyczne”
inhibitory, fluorouracyl (5-FU) hamujący TS i metotreksat hamujący DHFR, są od ponad
pół wieku szeroko używane w chemioterapii chorób nowotworowych oraz
immunoagresyjnych. Badacze poświęcili wiele uwagi molekularnym i komórkowym
mechanizmom działania tych enzymów i ich inhibitorów. Opracowano wiele rozwiązań o
znaczeniu praktycznym, takich jak optymalizacja schematów dawkowania metotreksatu
oraz kilka nowych leków i kandydatów na leki. Przykładem jest pemetreksed będący
inhibitorem zarówno TS jak i DHFR, noszący nazwę firmową Alimta. Warto wspomnieć,
że lek ten, który jest stosowany w jednej z postaci raka płuc, należy pod względem
wielkości sprzedaży na rynku światowym do pierwszej pięćdziesiątki produktów
przemysłu farmaceutycznego i w samym 2014r. przyniósł producentowi, firmie Lilly,
przychody w wysokości 2,8 miliarda USD.
Nie ulega więc wątpliwości, że rozprawa doktorska Pani Anny Antosiewicz dotyczy
tematyki ważnej i intensywnie eksplorowanej przez wiele grup badaczy zarówno w
laboratoriach akademickich, jak przemysłowych. Czy w tak licznym „towarzystwie”
doktorantka zdołała zaproponować i rozwinąć oryginalną tematykę badań? Z dużą
przyjemnością stwierdzam, że odpowiedź na tak postawione pytanie jest pozytywna.
Punktem wyjścia do jej badań było zawarte we wstępie rozprawy stwierdzenie, że
syntaza tymidylanowa i reduktaza dihydrofolinanowa występują w większości
organizmów w postaci odrębnych białek, podczas gdy w komórkach pierwotniaków i
roślin tworzą bifunkcyjny enzym DHFR-TS. Stąd wyniknęła hipoteza autorki, której
udowodnieniu poświęcona została rozprawa: że ludzkie białka DHFR i TS... mają
zdolność do tworzenia kompleksu białko-białko. Podobną hipotezę wysunęli ostatnio
badacze amerykańscy Wang i McCammon z University of California, San Diego.
Ograniczyli się oni jednak do modelowania interakcji enzymów DHFR i TS. Co ciekawe,
mogli oni być inspirowani doświadczalną publikacją Pani Anny Antosiewicz i
współpracowników, którzy w 2015r. opisali tworzenie kompleksu ludzkich DHFR i TS.
Rozprawa doktorska Pani Anny Antosiewicz ma formę „klasyczną”. Jej treść
rozpoczyna obszerne liczące 41 stron Wprowadzenie, w którym w przejrzyście
ustrukturyzowanej formie omówione są w poprawny sposób zagadnienia związane ze
szlakiem syntezy tymidylanu, właściwościami trzech kluczowych enzymów tego szlaku:
DHFR, TS i hydroksymetylo-transferazy serynowej (SHMT), oraz z medycznymi
zastosowaniami ich inhibitorów. Jedyna krytyczna uwaga jaka nasunęła mi się podczas
czytania tej części rozprawy dotyczy braku informacji o dość podstawowej różnicy
pomiędzy ludzkimi i pierwotniaczymi/roślinnymi enzymami DHFR i TS. Chodzi mi o to,
że u pierwotniaków i roślin te dwie aktywności enzymatyczne wywodzą się ze
wspólnego genu który podlega ekspresji jako jedno białko z dwoma centrami
aktywnymi, podczas gdy u człowieka i ssaków kodowane one są przez geny położone
na innych chromosomach. Podanie tej informacji pozwoliłoby czytelnikowi łatwiej (czy
może szybciej) zrozumieć, dlaczego koncepcja ścisłego molekularnego oddziaływania
pomiędzy ludzkimi DHFR i TS była nieoczywista do tego stopnia, że pomysł jej
doświadczalnego sprawdzenia „urodził się” lata po opisaniu pierwotniaczego/ roślinnego
metabolonu obejmującego w jednym białku obie aktywności enzymatyczne.
2
Drugi, bardzo krótki (2 strony) rozdział rozprawy nosi tytuł Cel pracy badawczej. Na
pierwszej stronie jest tam pokrótce przedstawiona istota problemu jaki doktorantka
zamierzała podjąć - czyli luka w wiedzy na temat interakcji ludzkich enzymów DHFR i
TS. Na stronie następnej, pod śródtytułem Hipotezy badawcze i cele pracy
przedstawione są najpierw dwie „hipotezy badawcze”. Hipoteza nr 1 mówiąca, że
ludzkie białka DHFR i TS, występujące w postaci odrębnych enzymów mają zdolność
do tworzenia kompleksu białko-białko i że utworzenie kompleksów jest potrzebne do
oddziaływań z trzecim enzymem cyklu - SHMT, jest sformułowana prawidłowo. Moje
zastrzeżenia budzi jednak Hipoteza nr 2 mówiąca, że kompleks DHFR-DS może stać
się nowym celem molekularnym dla leków opracowywanych pod kątem zaburzania
interakcji między obydwoma enzymami. Nie da się wykazać ani potwierdzić, że coś
„może stać się” w przyszłości - choć można przypuszczać, że tak będzie. Dla mnie jest
to więc raczej wniosek z badań niż hipoteza badawcza.
W dalszym ciągu rozdziału Cel pracy badawczej wymienione zostało osiem
wyodrębnionych celów badawczych. Niestety – moim zdaniem - nie wszystkie są
adekwatnie sformułowane. Czym bowiem różni się cel nr 1 zbadanie interakcji między
rekombinowanymi enzymami cyklu od celu nr 2 weryfikacja oddziaływań pomiędzy
natywnymi enzymami cyklu? Czy cele nr 3 wyznaczenie parametrów kinetycznych
tworzenia kompleksu i nr 4 opis stoichiometrii i charakterystyka interakcji nie mieszczą
się w zakresie celu nr 1? Moim zdaniem lepiej było liczbę wyodrębnionych celów
badawczych zredukować do trzech: 1. charakterystyka interakcji rekombinowanych
ludzkich enzymów DHFR i TS w roztworach wodnych; 2. badania nad występowaniem
kompleksu tych enzymów w komórkach ludzkich w hodowli i 3. molekularny model
kompleksu jako narzędzie do projektowania potencjalnych inhibitorów jego tworzenia.
Co ciekawe, następny rozdział rozprawy Metodyka badań zawiera, zgodnie z powyższą
propozycją, trzy wyodrębnione podrozdziały opisujące A) Metodykę badań z użyciem
rekombinowanych białek, B) Metodykę badań na liniach komórkowych i C) Metodykę
modelowania molekularnego.
Godną podkreślenia i pochwały cechą rozprawy doktorskiej Pani Anny Antosiewicz jest
jej „wielometodyczność” - doktorantka zastosowała wiele uzupełniających się metod
badawczych do „rozpracowania” zagadnień związanych z hipotetycznym kompleksem
ludzkich DHFR i TS. Rozpoczęła od otrzymania i oczyszczenia rekombinowanych
ludzkich białek przy pomocy platformy E. coli, następnie wykorzystała szereg
3
nowoczesnych metod biofizycznych i biochemicznych, takich jak technika
mikrotermoforezy, do scharakteryzowania otrzymanych białek i tworzonego przez nie
kompleksu w roztworach buforowych, wykonywała badania na ludzkich komórkach w
hodowli wykorzystując m.in. techniki cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej,
oraz także badania modelowe in silico. Opis licznych zastosowanych przez autorkę
metod nie budzi zastrzeżeń.
Kolejny rozdział rozprawy zatytułowany Wyniki badań również nie budzi zastrzeżeń.
Doktorantka zgromadziła i przedstawiła zestaw licznych, spójnych, uzupełniających się i
w większości wzajemnie potwierdzających wyników. W przekonywający sposób
pokazują one, że z trzech ludzkich enzymów cyklu syntezy tymidylanu dwa, DHFR i TS,
mogą tworzyć ścisły choć niekowalencyjny kompleks, podczas gdy trzeci enzym,
SHMT, pozostaje z tym kompleksem luźniej związany. Równie przekonywające wydają
się dane pokazujące różnice pomiędzy lokalizacją białek DHFR i TS w normalnych
fibroblastach (przede wszystkim w cytoplazmie podstawowej) i w komórkach raka jelita
(równomiernie w cytoplazmie podstawowej i w jądrach komórkowych). Pozwolę sobie
mieć jednak inne niż autorka zdanie na temat interpretacji nałożonych na siebie
obrazów z mikroskopu konfokalnego. Moim zdaniem nakładające się obrazy białek
DHFR i TS wyznakowanych różnymi barwnikami nie stanowią dowodu na istnienie w
komórkach kompleksu DHFR-TS. Te kolorystycznie piękne obrazy zostały bowiem
uzyskane z użyciem niewielkiego powiększenia optycznego i przypuszczam, że
kolokalizacja dwóch różnych białek nie tworzących kompleksu dałaby podobny obraz.
Szkoda, że autorka nie spróbowała nałożyć obrazów wyznakowanych różnymi
barwnikami par enzymów należących do cyklu tymidylanowego ale nie tworzących ze
sobą ścisłego kompleksu, tj. pary DHFR i SHMT lub TS i SHMT. Gdyby dla takich par
obrazy nakładały się inaczej (mniej ściśle) niż dla pary DHFR i TS, to dopiero wtedy
mielibyśmy dowód, że metoda nakładania obrazów wykrywa w komórkach nie
współwystępowanie niezwiązanych ze sobą białek, a ich kompleks enzymatyczny.
W Dyskusji która stanowi kolejny rozdział rozprawy autorka prezentuje dobrze
zaplanowane, zwarte i logiczne rozważania na temat interpretacji i ewentualnego
znaczenia uzyskanych wyników. Ze względu na skomplikowaną materię dyskutowanych
zagadnień nie jest to tekst łatwy w czytaniu, ale trudno w nim dostrzec wady.
Przedstawiony tok rozumowania wydaje się prawidłowy, choć niektóre tezy są
kontrowersyjne. Na str. 153 autorka napisała: Możliwe, że to właśnie ponad 2-krotne
4
zmniejszenie poziomu kompleksu DHFR-TS w jądrach komórkowych stanowi
prawdziwy terapeutyczny wpływ 5-FU na leczenie komórek jelita grubego. Za główny
aktywny metabolit 5-FU uważa się 5-FdUMP, który jest nieodwracalnym inhibitorem
syntazy tymidylanowej, poprzez tworzenie kowalencyjnego trójskładnikowego
kompleksu złożonego z FdUMP, TS i CH2-THF hamującym syntezę tymidylanu już w
niskich nanomolarnych stężeniach. Czy zwiększenie wydajności reakcji poprzez
kanałowanie pośredniego substratu w ramach kompleksu DHFR i TS rzeczywiście ma
tak zasadnicze znaczenie dla zwiększenia wydajności syntezy tymidylanu, że
hipotetyczny inhibitor tworzenia tego kompleksu mógłby jeszcze silniej ją hamować niż
5-FU albo pemetreksed? Czy może taki inhibitor tworzena kompleksu miałby być mniej
toksyczny dla komórek zdrowych, a bardziej dla komórek nowotworowych?
Zakończenie rozprawy stanowią rozdział Literatura będący spisem dobrze dobranego i
prawidłowo cytowanego piśmiennictwa zawartym na 13 stronach i obejmującym sporo
ponad 100 pozycji, oraz załączniki rozszerzające opisy niektórych metod badawczych
wykorzystanych przez autorkę. W rozprawie nie ma, niestety, rozdziału zawierającego
wnioski. Jak już wspomniałem, faktycznie najważniejszym wnioskiem z pracy jest to, co
autorka – moim zdaniem niesłusznie – uznała za hipotezę badawczą.
Materiał doświadczalny zawarty w rozprawie był podstawą dwóch publikacji w
czasopismach z Listy Filadelfijskiej. Doktorantka jest pierwszym autorem obu z nich.
Podsumowując – uważam rozprawę doktorską Pani mgr inż. Anny Antosiewicz za pracę
bardzo interesującą. Zawiera ona oryginalną i nowatorską propozycję rozwiązania
problemu naukowego związanego z hipotezą o tworzeniu przez ludzkie białka syntazę
tymidylanową i reduktazę dihydrofolinanową kompleksu enzymatycznego (metabolonu).
Rozprawa ta dowodzi, że kandydatka legitymuje się wiedzą teoretyczną w jej
dyscyplinie naukowej oraz umiejętnością samodzielnego prowadzenia pracy naukowej
– a więc spełnia wszystkie warunki określone przez aktualnie obowiązującą ustawę o
stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki. W
związku z powyższym wnoszę o dopuszczenie kandydatki do dalszych etapów
przewodu doktorskiego.
5