Wyniki i opis analizy jakościowej

ANALIZA FITOCHEMICZNA I OCENA AKTYWNOŚCI
ANTYOKSYDACYJNEJ EKSTRAKTÓW
Z COCHLOSPERMUM ANGOLENSE (WELW.)
Tomasz Baj1, Agnieszka Najda2, Karolina Mikulska1, Elwira Sieniawska1, Kazimierz Głowniak1
1 Katedra i Zakład Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych, Uniwersytet Medyczny w Lublinie
2 Katedra Warzywnictwa i Roślin Leczniczych, Laboratorium Jakości Warzyw i Surowców Zielarskich, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie
WSTĘP
Cochlospermum angolense (C. angolensis), zwane także Maximilianea angolensis (Welw. ex Oliv.) lub Borututu, to drzewo występujące na obszarze Angolii (zachodnia Afryka), osiągające od
3 do 6 metrów wysokości, szeroko rozgałęzione. Liście są łykowate,
lancetowate lub podłużnie-lancetowate, spiczaste i drobnoząbkowane. Kwiaty mają intensywnie żółte, zebrane w większą grupkę,
działki kielicha są niemal zupełnie nagie. Owoce są obłe, spłaszczone u góry, gdy dojrzeją rozdzielają się na cztery cienkie, łykowate
i prążkowane części. Nasiona są nerkowate, czarne i błyszczące,
otoczone jedwabnymi kosmkami.
Borututu od wielu dziesięcioleci znane było ze swoich silnych
właściwości oczyszczających i detoksykacyjnych. Potocznie określane przez mieszkańców „darem natury dla wątroby”. Napar
z korzenia używany był w najróżniejszych kuracjach, zarówno
do picia jak i mycia. Cochlospermum angolense (Welw.) jest
bogate w chinony, katechiny, kwas galusowy oraz biflawonoidy.
W XX wieku ogromnym propagatorem oraz entuzjastą Borututu
został Portugalczyk – Julio de Sousa Lopes. Jego spostrzeżenia rozpoczęły proces pozyskiwania korzenia Cochlospermum angolense
na skalę przemysłową i dystrybuowania jako suplement diety.
WYNIKI i OMÓWIENIE
Materiał badany
Wyniki analizy jakościowej kwasów fenolowych metodą HPLC
przedstawiono na ryc 2.
Ekstrakcja chloroformem
Ekstrakcja metanolem
Ekstrakt metanolowy
0,35
Oddestylowanie rozpuszczalnika
Wytrawianie wrzącą wodą
Sączenie
 Ekstrakcja eterem dietylowym
Warstwa eterowa
Wyciąg eterowowodny
MATERIAŁ I METODY
Substancją roślinną wykorzystaną w badaniach był korzeń Cochlospermum angolense (Welw.). Materiał do badań został zebrany
w środkowej części Angoli, w maju 2008 roku. Suszony był na otwartej przestrzeni, zawieszony na sieciach rybackich umocowanych pod
strzechą. Proces suszenia trwał 3 miesiące – od czerwca do końca
sierpnia, następnie korzenie zostały umyte, wyczyszczone i wysuszone ponownie.
Oczyszczanie próbek metodą SPE (Solid-Phase Extraction)
Dalsze oczyszczenie próbki zostało przeprowadzone metodą SPE na kolumience oktadecylowej C18. Etapy oczyszczania:
kondycjonowanie metanolem i 50% wodnym roztworem metanolu.
Z roztworu (SOX) pobrano określoną ilość i rozcieńczono w znanej
objętości wody dejonizowanej. Tak przygotowaną próbkę zaaplikowano na kolumienkę i wymywano jej zawartość metanolem 50%.
Otrzymany eluat przeniesiono do kolbki miarowej o pojemności 10
ml i uzupełniono do kreski 50% metanolem. Z tak otrzymanego roztworu pobrano próbki do analizy HPLC.
0,15
1
2
3
0,05
-0,05
Wytrząsanie z 5% roztworem wodorowęglanu sodu
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Retention Time (min)
Warstwa eterowa
Wyciąg eterowowodnowęglanowy
Warstwa wodno-wodorowęglanowa
 Zakwaszenie do pH=3
 Ekstrakcja eterem dietylowym
Warstwa eterowa
Ryc. 2. Chromatogram HPLC wolnych kwasów fenolowych wyizolowanych z
ekstraktów Cochlospermum angolense: 1: kwas galusowy,
2: kwas protokatechowy, 3: kwas elagowy, 4: kwas p-hydroksybenzoesowy,
5: kwas ferulowy.
Analiza HPLC na podstawie porównania czasów retencji otrzymanych pików z wzorcowymi kwasami fenolowymi wykazała obecność 5 kwasów fenolowych. Z których 3 były już wcześniej wyizolowane i zidentyfikowane w gatunku Cochlospermum, zaś kwasy:
elagowy i p-hydroksybenzoesowy zostały zidentyfikowane raz pierwszy w Cochlospermum angolense.
Wyniki analizy aktywności antyoksydacyjnej ekstraktów otrzymanych przy użyciu 100% i 80% roztworu metanolu przedstawiono
na ryc. 3 i 4.
Ryc. 1. Schemat zolacji wolnych kwasów fenolowych
Warunki analizy jakościowej wolnych kwasów fenolowych
metodą HPLC
Analizę jakościową kwasów fenolowych metodą HPLC przeprowadzono stosując chromatograf typu LaChrom (Merck, Niemcy)
z detektorem diodowym DAD L-7450, pompą L-7100, pętlą dozującą
20 ul, kolumną chromatograficzną LiChrospher 100 RP-C18 o wymiarach 250x4 mm i średnicy ziaren dp = 5 um. Fazą rozwijającą
stanowił gradient rozpuszczalników: woda + 1% kwas octowy:metanol:acetonitryl, szybkość przepływu wynosiła 1 ml/min, Tożsamość
związków badano porównując czasy retencji oraz widma DAD związków wzorcowych ze związkami badanymi.
Warunki analizy HPLC kwasów fenolowych:
Temperatura
Czas analizy
Szybkość przepływu fazy ruchomej
Objętość nastrzyku
Ryc. 3. Wykres zależności stężenia ekstraktu od % inhibicji wolnego rodnika
dla ekstraktu 100% metanolowego.
25ºC
45 min
1 ml/min
10 μl
A – 1% kwas octowy w wodzie
B – MeOH
Izolacja kwasów fenolowych z ekstraktów z korzenia
Cochlospermum angolense
Zastosowano klasyczną metodę ekstrakcji typu ciecz – ciało stałe
w aparacie Soxhleta. Rozdrobniony surowiec - korzeń Cochlospermum angolense wstępnie ekstrahowano chloroformem aby usunąć
związki balastowe. Wyciąg chloroformowy odrzucono, gilzę z surowcem dokładnie wysuszono pod wyciągiem i poddano wyczerpującej ekstrakcji metanolem w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika.
Schemat izolacji wolnych kwasów fenolowych przedstawiono na ryc.
1. Frakcję wolnych kwasów fenolowych poddano oczyszczaniu metodą SPE.
5
Warstwa wodna
Aktualnie, na polskim rynku suplementów diety, obecny jest preparat, będący wysuszonym korzeniem Cochlospermum angolense.
Zalecany jest on do stosowania w przypadku takich dolegliwości jak:
• marskość wątroby różnego pochodzenia,
• niewydolność wątroby, woreczka żółciowego, trzustki i śledziony,
• problemy wątroby po usunięciu woreczka żółciowego,
• poalkoholowa destrukcja komórek wątroby,
• rozprzestrzenianie się trujących metabolitów alkoholowych we krwi
i ich akumulacja w komórkach nerwowych (środek na kaca),
• polekowa obstrukcja przewodów żółciowych (chemoterapia),
• bakteryjne owrzodzenie przewodu pokarmowego (H. Pyllori),
• wirus opryszczki (jako płukanki i okłady),
• podwyższony poziom cholesterolu.
Absorbance (AU)
Wyciąg wodny
4
0,25
Skład fazy ruchomej
C - acetonitryl
Czas
Skład gradientu (%)
analizy
A
B
C
(min.)
0 -10
20
45
35
10,1-15,0
20
40
40
15,1-25,0
20
20
60
25,1-45,0
20
50
30
Oznaczenia aktywności antyoksydacyjnej
ekstraktu w teście DPPH
Przed ekstrakcją miałko sproszkowaną substancję roślinną macerowano porcjami 20 ml metanolu w czasie 12 godzin. Następnie
ekstrahowano surowiec metanolem (równolegle 100% i 80%) pod
chłodnicą zwrotną w koszyczku grzewczym w czasie 120 min. Ekstrakty przesączano i przygotowano odpowiednie rozcieńczenia, które poddano pomiarowi potencjału antyoksydacyjnego.
Różne ilości badanych ekstraktów (0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4 μl zostały
zmieszane z roztworem DPPH. Mieszaniny inkubowano w ciemności przez 30 minut, a następnie zmierzono absorbancję przy długości fali 517 nm, jako odnośnika użyto metanolu (Cary 50 UV-Vis
Spectrophotometer, Varian INC, USA). Określono kinetykę reakcji za
pomocą oprogramowania Cary WinUV Software. Wszystkie pomiary
wykonano w trzech powtórzeniach dla obu stężeń ekstrahenta.
Ryc. 4. Wykres zależności stężenia ekstraktu od % inhibicji wolnego rodnika
dla ekstraktu 80% metanolowego.
Jak przedstawiono na powyższych rycinach, ekstrakty metanolowe otrzymane z korzeni Cochlospermum angolense wykazywały
właściwości antyoksydacyjne. Przy czym bardziej aktywny okazał
się ekstrakt 80% metanolu IC50 5,62 ug/ml, w przypadku 100% ekstraktu metanolowego IC50 wynosiło 7,97 ug/ml.
WNIOSKI
Z przeprowadzonych badań fitochemicznych oraz oceny aktywność antyoksydacyjnej ekstraków z korzeni Cochlospermum angolese wynikają następujące wnioski:
1. Analiza HPLC wykazała obecność 5 kwasów fenolowych: galusowego, protokatechowego, elagowego, p-hydroksybenzoesowego i ferulowy. Z których kwasy: elagowy i p-hydroksybenzoesowy zostały zidentyfikowane raz pierwszy w Cochlospermum
angolense.
2. Ekstrakty metanolowe wykazywały właściwości antyoksydacyjne – bardziej aktywny okazał się ekstrakt 80% metanolu IC50 5,62
ug/ml, w przypadku 100% ekstraktu metanolowego IC50 wynosiło
7,97 ug/ml.