Autoreferat - Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Transkrypt

Anna Belcarz
Załącznik 2
Autoreferat
Katedra i Zakład Biochemii i Biotechnologii
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej
Uniwersytet Medyczny w Lublinie
LUBLIN 2015
1
INFORMACJE O EDUKACJI, POSIADANE DYPLOMY I STOPNIE
NAUKOWE
Edukacja:
1978-1986 - Szkoła Podstawowa im. ks. Jana Twardowskiego nr 7 w Lublinie.
1986-1990 - II Liceum Ogólnokształcące im. Hetmana Jana Zamoyskiego w Lublinie, klasa o
profilu biologiczno-chemicznym.
1990-1995 – Studia magisterskie na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi UMCS w Lublinie,
kierunek Biotechnologia (wynik studiów - bardzo dobry; dyplom uznania za bardzo dobre
wyniki w nauce).
2009-2010 - Studia podyplomowe: „Public Relations w badaniach naukowych”, Wyższa
Szkoła Ekonomii i Innowacji w Lublinie.
2010-2011 - Studia podyplomowe: „Kształcenie kadry akademickiej do roli wykładowców
przedmiotu Ochrona Własności Intelektualnej”, Wydział Biologii i Biotechnologii UMCS,
Lublin.
Znajomość języków:
Angielski – zaawansowany (Dyplom First Certificate in English, Cambridge University,
England, 1994, nr ref.: 946PL0100089)
Francuski – średnio zaawansowany; płynny w mowie
Rosyjski – średnio zaawansowany
Kursy i szkolenia:
02-06.04.2001 – Kurs „Obsługa autoklawów laboratoryjnych”, Ośrodek Doskonalenia Kadr
„Mechanika”, Lublin.
2.07.2001-21.07.2001 – Kurs “Challenges of Sustainable Development”, poświęcony
współczesnej problematyce ochrony środowiska, organizowany przez Sendzimir
Foundation, Uniwersytet Florydzki i Polską Fundację Partnerstwa Środowiskowego.
6-8.09.2006 – Kurs „Podstawy hodowli komórek ludzkich i zwierzęcych”, Centrum
Biotechnologii UMCS w Lublinie.
10-11.06.2010 – Seminarium „Nowoczesne techniki obrazowania ramanowskiego i w
podczerwieni”, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie.
2
2010 – „Bądź przedsiębiorcą – cykl szkoleń dla pracowników akademickich, absolwentów i
studentów”, Europejskie Centrum Integracji i Współpracy Samorządowej „Dom Europy”.
29.09.2011 – Szkolenie z zakresu obsługi Aparatu do badania uwalniania substancji czynnej
metodą USP 4 – CE1 z wyposażeniem firmy SOTAX zgodnie w wymogami GLP i ISO
9001.
25-27.05.2012 – Szkolenie z zakresu nowoczesnych metod diagnozowania i procedur
terapeutycznych narządu żucia z wykorzystaniem najnowszej aparatury diagnostycznej
(Konferencja Naukowa „Inżynieria Biomedyczna w Stomatologii”.
29-30.01.2013 – Kurs: „Zastosowanie statystyki w medycynie z użyciem oprogramowania
STATISTICA”.
Posiadane dyplomy i stopnie naukowe:
21.04.1995 – tytuł magistra biotechnologii na podstawie pracy magisterskiej pt.
„Subkomórkowa lokalizacja kinazy białkowej S-60 w komórkach drożdży Saccharomyces
cerevisiae” wykonanej pod kierunkiem prof. dr hab. Nikodema Grankowskiego (ocena bardzo dobra), w Zakładzie Biologii Molekularnej, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej
w Lublinie.
15.01.2003 – stopień doktora nauk biologicznych na podstawie rozprawy pt. „Wykrycie,
izolacja i określenie właściwości 2 form zewnątrzkomórkowej inwertazy z Candida utilis”
ukończonej pod kierunkiem prof. dr hab. Jerzego Łobarzewskiego, w Zakładzie Biochemii,
Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie.
INFORMACJE O ZATRUDNIENIU W JEDNOSTKACH NAUKOWYCH
01.09.1995-30.04.2003 – asystent w Zakładzie Biochemii UMCS w Lublinie (zespół prof. dr
hab. Jerzego Łobarzewskiego).
01.11.1998-31.09.2000 – dwuletni staż naukowy i dydaktyczny na stanowisku asystentdoktorant na Wydziale Fizjologii Roślin, Uniwersytet Genewski w Szwajcarii (opiekun
naukowy: prof. Hubert Greppin).
01.05.2003-31.08.2005 – adiunkt w Zakładzie Biochemii UMCS w Lublinie (zespół dr hab.
Grażyny Ginalskiej).
01.09.2005 do chwili obecnej – adiunkt w Katedrze i Zakładzie Biochemii i Biotechnologii,
Uniwersytet Medyczny w Lublinie (zespół prof. dr hab. Grażyny Ginalskiej).
3
OSIĄGNIĘCIE NAUKOWE ZGŁOSZONE DO POSTĘPOWANIA
HABILITACYJNEGO
Osiągnięcie naukowe zgłoszone do postępowania habilitacyjnego stanowi cykl 7
publikacji z lat 2005-2015 o sumarycznym IF wynoszącym 12,708 (pkt. MNiSW = 161) oraz
2 patenty (1 polski i 1 międzynarodowy). Temat zgłoszonego osiągnięcia to: „Modyfikacja
ceramiki wapniowo-fosforanowej i jej zastosowanie w otrzymywaniu
kompozytowych biomateriałów kościozastępczych nowej generacji”.
PUBLIKACJE
1. BELCARZ
ANNA,
ZALEWSKA
JUSTYNA,
GINALSKA
GRAŻYNA,
ŚLÓSARCZYK
ANNA:
Immobilizacja
gentamycyny
na
nośnikach
hydroksyapatytowych w celu nadania im własności antybakteryjnych./Gentamicin
immobilization on hydroxyapatite carriers for increasing their antibacterial properties.
Inż. Biomater./Engineering of Biomater. 47-53 (2005) 34-36. (autor korespondencyjny)
IF = 0,0
punkty KBN/MNiSW = 6
Mój wkład w tej pracy polegał na wyznaczeniu koncepcji doświadczeń, immobilizacji białka i
gentamycyny na nośnikach wraz z ich ilościowym oznaczeniem oraz oceną sposobu wiązania leku
z matrycą, określeniu stabilności leku w trakcie przechowywania oraz oznaczaniu aktywności
mikrobiologicznej nośników. Opracowałam wyniki badań, przygotowałam tekst manuskryptu w
języku polskim i angielskim oraz brałam udział w korektach wydawniczych jako autor
korespondencyjny.
Mój udział procentowy w całej pracy określam na 70%.
2. BELCARZ ANNA, GINALSKA GRAŻYNA, ZALEWSKA JUSTYNA, RZESKI
WOJCIECH, ŚLÓSARCZYK ANNA, KOWALCZUK DOROTA, GODLEWSKI
PIOTR, NIEDŹWIADEK JUSTYNA: Covalent coating of hydroxyapatite by keratin
stabilizes gentamicin release. J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 89B (2009)
102-113. (autor korespondencyjny)
IF = 2,185 punkty KBN/MNiSW = 20
Mój wkład w tej pracy polegał na wyznaczeniu koncepcji doświadczeń, immobilizacji białka i
antubiotyku na nośnikach oraz współuczestnictwie w ocenie uwalniania leku z matrycy oraz w
ocenie aktywności mikrobiologicznej nośnika. Współuczestniczyłam w opracowaniu wyników
badań, przygotowałam tekst manuskryptu w języku angielskim oraz brałam udział w korektach
wydawniczych jako autor korespondencyjny.
3. BELCARZ ANNA, GINALSKA GRAŻYNA, PYCKA TEODOZJA, ZIMA ANETA,
ŚLÓSARCZYK ANNA, POLKOWSKA IZABELLA, PASZKIEWICZ ZOFIA,
PIEKARCZYK WOJCIECH: Application of β-1,3-glucan in production of ceramicsbased elastic composite for bone repair. Centr. Eur. J. Biol. 8(6) (2013) 534-548. (autor
korespondencyjny)
4
Mój wkład w tej pracy polegał na wyznaczeniu koncepcji doświadczeń, opracowaniu formuły
kompozytu kościozastępczego, wyznaczeniu współczynników sorpcji wody i zmiany objętości
kompozytu oraz doborze i określeniu efektywności sterylizacji. Współuczestniczyłam w
opracowaniu wyników badań, przygotowałam tekst manuskryptu w języku angielskim oraz
brałam udział w korektach wydawniczych jako autor korespondencyjny.
4. BELCARZ ANNA, ZIMA ANETA, GINALSKA GRAŻYNA: Biphasic mode of
antibacterial action of aminoglycoside antibiotics-loaded elastic hydroxyapatite-glucan
composite. Int. J. Pharm. 454 (2013) 285-295. (autor korespondencyjny)
kompozytu kościozastępczego zawierającego lek i przygotowaniu próbek, wyznaczeniu i analizie
widm FTIR, określeniu uwalniania leku z badanych matryc kompozytowych oraz ich aktywności
przeciwbakteryjnej. Opracowałam wyniki badań, przygotowałam tekst manuskryptu w języku
angielskim oraz brałam udział w korektach wydawniczych jako autor korespondencyjny.
5. BELCARZ ANNA, JANCZAREK MONIKA, KOŁACZ KAROLINA, URBANIKSYPNIEWSKA TERESA, GINALSKA GRAŻYNA: Do Ca2+-chelating polysaccharides
reduce calcium ion release from gypsum-based biomaterials? Centr. Eur. J. Biol. 8(8)
(2013) 735-746. (autor korespondencyjny)
próbek kompozytowych zawierających ceramikę wapniowo-fosforanową i polisacharydy oraz ich
przygotowaniu, wyznaczeniu stosunku L/P, czasu wiązania gipsu i wpływu czynników
modyfikujących gips na ograniczenie nadmiernego uwalniania jonów wapnia. Opracowałam
wyniki badań, przygotowałam tekst manuskryptu w języku angielskim oraz brałam udział w
korektach wydawniczych jako autor korespondencyjny.
6. BELCARZ ANNA, ZALEWSKA JUSTYNA, PAŁKA KRZYSZTOF, HAJNOS
MIECZYSŁAW, GINALSKA GRAŻYNA: Do Ca2+-adsorbing ceramics reduce the
release of calcium ions from gypsum-based biomaterials? Mater. Sci. Engn. C. 47 (2015)
256-265. (autor korespondencyjny)
Mój wkład w tej pracy obejmował wyznaczenie koncepcji doświadczeń, opracowanie formuły
próbek kompozytowych zawierających ceramikę wapniowo-fosforanową i ich przygotowanie,
wyznaczenie stosunku L/P oraz czasu wiązania cementów kompozytowych, wyznaczenie i analizę
widm FTIR oraz współudział w określeniu wpływu ceramiki modyfikującej gips na ograniczenie
nadmiernego uwalniania jonów wapnia. Opracowałam wyniki badań, przygotowałam tekst
manuskryptu w języku angielskim oraz brałam udział w korektach wydawniczych jako autor
korespondencyjny.
5
7. BORKOWSKI LESZEK, PAWŁOWSKA MARTA, RADZKI RADOSŁAW P.,
BIEŃKO MAREK, POLKOWSKA IZABELA, BELCARZ ANNA, KARPIŃSKI
MIROSŁAW, SŁOWIK TYMOTEUSZ, MATUSZEWSKI ŁUKASZ, ŚLÓSARCZYK
ANNA, GINALSKA GRAŻYNA: Effect of carbonated HAP/β-glucan composite bone
substitute on healing of drilled bone voids in the proximal tibial metaphysic of rabbits.
Mater. Sci. Engn.C. (2015) DOI:10.1016/j.msec.2015.04.009.
Mój wkład w tej pracy obejmował współudział w wyznaczeniu koncepcji doświadczeń i
opracowaniu formuły próbek kompozytowych zawierających węglanową ceramikę wapniowofosforanową. Uczestniczyłam również w przygotowaniu tekstu manuskryptu w języku angielskim
oraz brałam udział w korektach wydawniczych.
Podsumowanie: IF = 12,708
punkty KBN/MNiSW = 161
PATENTY
1. BELCARZ ANNA, GRAŻYNA GINALSKA, ŚLÓSARCZYK ANNA,
PASZKIEWICZ ZOFIA. Kompozyt bioaktywny oraz sposób wytwarzania kompozytu
bioaktywnego. Patent Polski nr 206394, Medical Inventi Spółka z Ograniczoną
Odpowiedzialnością (pierwotnie uprawniony do patentu: Uniwersytet Medyczny w
Lublinie), Lublin, Polska. Zgłoszono: 2009; udzielono: 2010. Udział własny: 45%.
Mój wkład w tej pracy polegał na opracowaniu formuły kompozytu kościozastępczego w
oparciu o granularną mikroporowatą ceramikę hydroksyapatytową. Opracowałam wyniki
badań, przygotowałam tekst zgłoszenia patentowego wraz zastrzeżeniami w języku polskim.
Mój udział procentowy wkładu pracy ustalony został we wniosku patentowym na 45%.
2. BELCARZ ANNA, GRAŻYNA GINALSKA, ŚLÓSARCZYK ANNA,
PASZKIEWICZ ZOFIA. Bioactive composite and process for the production of the
bioactive composite. International Patent, nr 2421570 B2, Medical Inventi Spółka z
Ograniczoną Odpowiedzialnością (pierwotnie uprawniony do patentu: Uniwersytet
Medyczny w Lublinie), Lublin, Polska. Zgłoszono: 26.10.2010; udzielono: 25.02.2015
(European Patent Bulletin). Udział własny: 45%.
Mój wkład w tej pracy polegał na opracowaniu formuły kompozytu kościozastępczego w
oparciu o granularną mikroporowatą ceramikę hydroksyapatytową. Opracowałam wyniki
badań, przygotowałam tekst zgłoszenia patentowego wraz zastrzeżeniami w języku angielskim.
Mój udział procentowy wkładu pracy ustalony został we wniosku patentowym na 45%.
6
CEL NAUKOWY WYMIENIONYCH PRAC, WYNIKI OSIĄGNIĘTE W
TRAKCIE ICH REALIZACJI ORAZ WYKORZYSTANIE
PRAKTYCZNE
Cel naukowy
Celem podjętych badań była modyfikacja ceramiki wapniowo-fosforanowej i jej
zastosowanie w otrzymywaniu kompozytowych biomateriałów kościozastępczych nowej
generacji. Poprzez zaproponowane rozwiązania możliwe było osiągnięcie trzech celów:
1. uzyskanie zwiększonej ochrony przeciwbakteryjnej ceramiki wapniowo-fosforanowej,
zmniejszającej prawdopodobieństwo pooperacyjnego wytworzenia na jej powierzchni
biofilmu bakteryjnego, wysoce opornego na standardową systemową terapię
antybiotykową;
2. zwiększenie poręczności chirurgicznej materiałów implantacyjnych opartych na
ceramice wapniowo-fosforanowej występującej w formie wysokoporowatego
granulatu (pory w skali mikro) i uzyskanie nowatorskiego elastycznego kompozytu
kościozastępczego o właściwościach korzystnych dla medycyny regeneracyjnej;
3. ograniczenie nadmiernego i cytotoksycznego wydzielania jonów wapniowych po
implantacji materiałów bazujących na łatwo rozpuszczalnym dwuwodnym siarczanie
wapnia.
Wprowadzenie
w
zagadnienie
charakterystyki
biomateriałów
kościozastępczych i problemów związanych z wszczepianiem komercyjnie
dostępnych materiałów implantacyjnych.
Społeczeństwa krajów rozwiniętych XXI wieku to społeczeństwa starzejące się i w
coraz gorszej kondycji fizycznej. Na pogarszanie się tej kondycji wpływa w znacznym
stopniu styl życia – między innymi permanentny brak ruchu, intensywne korzystanie z
używek oraz nieodpowiednia dieta. Czynniki te przekładają się na zintensyfikowanie
częstotliwości występowania wielu chorób, między innymi dotyczących układu mięśniowoszkieletowego. Choroby tego układu wpływają na stan mięśni, ścięgien, wiązadeł oraz
nerwów, wywołując trwałe inwalidztwo u osób dorosłych na całym świecie. W skali krajów
rozwiniętych, przypadki degeneracji lub stanów zapalnych kości i stawów stanowią około
połowę przypadków chronicznych chorób u ludzi powyżej 50-tego roku życia [Navarro i
współ., 2008]. Co gorsza, przewiduje się, że do końca roku 2020 liczba ludzi dotkniętych
schorzeniami układu kostnego podwoi się [Bone and Joint Decade’s Musculoskeletal Portal,
2007]. Do najczęściej przeprowadzanych obecnie zabiegów chirurgicznych służących
poprawie stanu zdrowia pacjentów cierpiących na wyżej opisane dolegliwości należą:
artroplastyka kolana (rekonstrukcja lub wymiana kolana), wszczepienie częściowej lub pełnej
endoprotezy stawu biodrowego oraz zespolenie kręgosłupa. Do innych przypadków
7
związanych z uszkodzeniami układu mięśniowo-szkieletowego należą zmiażdżenia kości w
wyniku wypadków (np. komunikacyjnych) oraz wyłuszczenie nowotworów kości lub torbieli
tkanki kostnej powstałej w wyniku wystąpienia stanów zapalnych. Przypadki te występują
coraz częściej również w wyniku nasilenia się ogólnej częstotliwości występowania
nowotworów, coraz intensywniejszego ruchu komunikacyjnego oraz popularyzacji sportów
ekstremalnych. Czynniki te sprawiają, że ilość zabiegów chirurgicznych mających na celu
leczenie i rekonstrukcję układu kostnego będzie, według istniejących prognoz, intensywnie
rosła w przeciągu najbliższych dekad.
Zabiegi chirurgiczne uzupełniające ubytki i regenerujące tkankę kostną wymagają
użycia urządzeń lub materiałów implantacyjnych wytworzonych z metali, ceramiki lub
polimerów, ogólnie określanych mianem biomateriałów. Zostały one zaproponowane jako
alternatywa dla autograftów, allograftów i ksenograftów, których pozyskiwanie jest
ograniczone między innymi niedoborem miejsc, z których można pobierać tkankę, ryzykiem
transferu chorób, odrzutu wszczepu, kosztami pozyskiwania oraz śmiertelnością pooperacyjną
[Goulet i współ., 1997]. Stanowią one zbiór produktów o ogromnej różnorodności, pod
względem cech reologicznych, kształtu, cech fizykochemicznych i biologicznych, zastosowań
czy lokalizacji implantacyjnych. Można je zaliczyć do materiałów trzech generacji: materiały
bioinertne (I generacja), materiały bioaktywne i biodegradowalne (II generacja) oraz
materiały zaprojektowane w celu stymulacji specyficznych odpowiedzi komórkowych na
poziomie molekularnym (III generacja) [Hench & Polak, 2002]. Podział ten jest podyktowany
nie tyle chronologią wytwarzania, ile dopasowaniem do ewolucji wymagań stawianych
materiałom implantacyjnym. Pierwsza generacja obejmuje materiały, które mają jedynie
odpowiadać swoimi właściwościami fizycznymi właściwościom uzupełnianej tkanki i
jednocześnie wywoływać minimalną odpowiedź toksyczną gospodarza, czyli generować
minimalną odpowiedź immunologiczną wobec wprowadzonego ciała obcego [Hench, 1980].
Materiały ceramiczne tej generacji miały zatem za zadanie zapewniać wrastanie tkanki
kostnej do struktury porowatego implantu oraz indukować stabilizację protezy. Jednak ze
względu na słabe parametry mechaniczne takiej porowatej ceramiki, jej zastosowanie musiało
się ograniczać do uzupełniania tkanki kostnej w miejscach, gdzie nie było wymagane
znoszenie wysokich obciążeń mechanicznych [Navarro i współ., 2008]. Do drugiej generacji
biomateriałów zalicza się te, które zdolne są do wzmocnionej interakcji ze środowiskiem
biologicznym i indukowania wiązania z tkanką. Do grupy tej zaliczono również materiały
bioabsorbowalne, zdolne do podlegania stopniowej degradacji powiązanej w czasie z
regeneracją i gojeniem się tkanki. Mineralizacja i wiązanie na poziomie tkanka kostnaimplant jest obecnie procesem najszerzej uznawanym jako wyznacznik bioaktywności
materiału implantacyjnego. Z tego względu do bioaktywnej ceramiki zaliczono między
innymi hydroksyapatyt (HAp), fosforan trójwapniowy (Ca3(PO4)2), ich pochodne i
kombinacje [Navarro i współ., 2008]. Należy zaznaczyć, że hydroksyapatyt, ze względu na
swą wysoką stabilność chemiczną i powiązaną z nią słabą rozpuszczalność, w dużym stopniu
pozostaje po implantacji w zregenerowanej tkance kostnej, podczas gdy fosforany
trójwapniowe ulegają z czasem całkowitej resorpcji [Takahashi i współ., 2005; Ginebra i
współ., 2006]. Materiałami drugiej generacji są również dwufazowe kompozyty określane
8
jako „analogi kostne”, w których polimer pełni rolę matrycy, zaś hydroksyapatyt zapewnia
bioaktywność [Bonfield, 1988].
Materiałom trzeciej generacji stawia się najwyższe wymagania. Warto jednak
wspomnieć, że implanty dostępne na rynku zaliczają się właściwie do pierwszej i drugiej
generacji materiałów, co w niczym nie umniejsza ich roli w medycynie regeneracyjnej.
Materiały implantacyjne dopasowuje się bowiem do wymaganej aplikacji, co sprawia, że
materiały pierwszej generacji są w ciągłym użyciu z wysokim współczynnikiem sukcesu.
Natomiast materiały trzeciej generacji projektowane są tak, aby rozwiązywać bardziej
zaawansowane problemy: być jednocześnie bioaktywne i biodegradowalne, stymulować
specyficzną aktywność i zachowanie komórek (migrację, przyleganie i proliferację), stanowić
systemy nośników leków i substancji wzrostowych [Temenoff i Mikos, 2000; Agraval i Ray,
2001]. Zaplanowano dla nich możliwość wykorzystywania naturalnych szlaków
sygnałowych, komórek macierzystych, czynników wzrostu i sekwencji peptydowych w celu
regeneracji organów i tkanek, podkreślając jednocześnie znaczenie procesu angiogenezy oraz
dostarczania składników odżywczych [Navarro i współ., 2008]. Określono też, że idealne
rusztowania dla regeneracji tkankowej, w rozumieniu trójwymiarowych struktur o optymalnej
porowatości, powinny być biokompatybilne i biodegradowalne, nie powinny dostarczać
toksycznych produktów rozpadu i resorbować się z tempie tożsamym z tempem regeneracji
tkanki. Korzystne jest też, gdy stanowią ściśle powiązaną porowatą strukturę (zarówno mikrojak i makroporowatą) zapewniającą dostarczanie substancji odżywczych poprzez cyrkulację
płynów tkankowych oraz neowaskularyzację, odpowiadają wymaganiom obciążeniowym
implantowanego fragmentu tkanki oraz zachowują integralność w trakcie pierwszego etapu
poimplantacyjnego [Spaans i współ., 2000; Boccaccini i współ., 2002].
Pomimo znacznego zaawansowania w technologii syntezy biomateriałów
kościozastępczych, nie udało się dotychczas uzyskać idealnego, a jednocześnie relatywnie
taniego rusztowania dla regeneracji tkanki kostnej. Jednym z istotnych problemów
dotyczących materiałów implantacyjnych jest ryzyko zakażenia bakteryjnego wszczepów. W
przypadku ceramiki wapniowo-fosforanowej wiąże się ono między innymi z właściwościami
samej ceramiki, która ze względu na swoją budowę chemiczną stanowi możliwy cel dla
adhezji komórek bakteryjnych lub grzybowych [Aronov i współ., 2007; Clark i współ., 1985],
stanowiąc centrum infekcji i zwiększając prawdopodobieństwo wytworzenia
antybiotykoopornego biofilmu bakteryjnego. Źródłem zakażenia w przypadkach implantacji
biomateriałów mogą być nawet te organizmy, które w warunkach naturalnych bytują na
ludzkiej skórze, takie jak Staphylococcus epidermidis. Paciorkowiec ten w momencie
zasiedlenia na powierzchni implantowanego ciała obcego może nabrać cech czynnika
zakaźnego [Hicks i Greenhalgh, 1997]. W istocie, do szczepów bakteryjnych najpowszechniej
kolonizujących implanty ortopedyczne należą Staphylococcus aureus i Staphylococcus
epidermidis (organizmy Gram-dodatnie) oraz Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa
(organizmy Gram-ujemne) [Sanderson, 1991; Goel, 2006]. Dzięki zaawansowanym
technikom okołooperacyjnej prewencji przeciwbakteryjnej, szpitalne zakażenia implantów
zdarzają się z niską częstotliwością: w około 2,2 % przypadków artroplastyki stawu
biodrowego i 3-4% przypadków całkowitej wymiany stawów [Pedersen i współ., 2010;
9
Pichavant i współ., 2012; Goel, 2006]. Częstotliwość ta nie jest wysoka, jednak wiąże się ze
znaczną śmiertelnością w tej grupie przypadków, ze względu na kolonizację materiału i
wykształcanie się na jego powierzchni biofilmu bakteryjnego. Podstawową bronią stosowaną
dziś przeciw tej strategii bakteryjnej jest okołooperacyjna systemowa profilaktyka
antybiotykowa, trwająca zwykle co najmniej 6 tygodni [Darouiche, 2004]. Mimo to nie
należy zapominać, że tkanka kostna jest słabo ukrwiona. Z tego powodu, aby zabezpieczyć ją
w pełni przed zakażeniem bakteryjnym, należy stosować wysokie systemowe stężenia
antybiotyków, co z kolei może generować efekt toksyczności (znany np. dla antybiotyków
aminoglikozydowych). Logicznym rozwiązaniem tego problemu wydaje się zatem strategia
lokalnego dostarczania czynnika bakteriobójczego bezpośrednio w implantowanym materiale.
Może ona zminimalizować ryzyko wykształcenia się biofilmu bakteryjnego i wystąpienia
cytotoksyczności polekowej. Przykłady zastosowania tej właśnie strategii, gdzie
hydroksyapatyt posłużył jako nośnik leku przeciwbakteryjnego, opisano dość szeroko w
literaturze fachowej [Krisanapiboon i Buranapanitkit, 2006; Ginebra i współ., 2006; Chai i
współ., 2007; Laurent i współ., 2008]. Mimo jednak wielu publikacji związanych z tą
tematyką, panuje zgodność opinii, że problem opanowania zakażeń implantów nie został w
pełni rozwiązany. Zagrożenie wykształcenia się biofilmu bakteryjnego na powierzchni
implantu istnieje bowiem nie tylko w ciągu pierwszych kilku tygodni od operacji (infekcja
typu I), ale też w okresie kilku miesięcy, a nawet lat od zabiegu (infekcje typu II i III).
Zjawisko to związane jest z faktem, iż obecność ciała obcego (implantu) w organizmie
gospodarza osłabia jego system odpornościowy [Goel, 2006]. Powagi sytuacji w przypadku
zapobiegania zakażeń implantów kościozastępczych dopełnia fakt, że długotrwała obecność
antybiotyku w organizmie indukuje zjawisko oporności bakterii przeciw tej substancji. Zatem
idealny, hipotetyczny system uwalniania leku w postaci implantu będącego jego nośnikiem
powinien wydzielać terapeutyczne dawki medykamentu dość szybko i na wysokim poziomie,
ale nie na tyle, aby osiągnąć stężenie toksyczne dla ludzkich komórek kostnych. Nie powinien
on również uwalniać leku w stężeniach wywołujących antybiotykooporność bakterii.
Wytworzenie takiego idealnego systemu miejscowego dostarczania leków pozostaje wciąż w
centrum zainteresowania wielu jednostek badawczych i – w razie sukcesu – może zdobyć
uznanie zarówno w świecie badaczy, jak i u producentów implantów kościozastępczych.
Kolejnym problemem związanym z implantacjami materiałów kościozastępczych jest
niedostateczna poręczność chirurgiczna, dotycząca w szczególności ceramiki wapniowofosforanowej ze względu na jej kruchość oraz wysokie wartości modułu Younga i
wytrzymałości na ściskanie. Świadczą o tym dane literaturowe: wartości modułu Younga i
wytrzymałości na ściskanie dla ceramiki HAp zawierają się odpowiednio w zakresach 35-120
GPa i 120-900 MPa [Ślósarczyk A., 2003]. Tymczasem wartości tych samych parametrów dla
kości zbitej wynoszą odpowiednio 17-19 GPa i 170-193 MPa [Suchanek i Yoshimura, 1998],
zaś dla kości gąbczastej – 0,18-0,33 GPa i 1,9-7 MPa [Aoki, 1994]. Tak znaczące obniżenie
wartości obu wspomnianych parametrów tkanka kostna zbita i gąbczasta uzyskuje dzięki
zawartości włókien kolagenowych, które stanowią rusztowanie dla odkładającej się macierzy
mineralnej oraz zapewniają zwiększoną elastyczność w stosunku do czystej ceramiki
wapniowo-fosforanowej. Ceramika HAp dostępna dla zastosowań medycznych jest
scharakteryzowana jako nietoksyczna, bioaktywna, osteokonduktywna oraz nie wywołująca
10
reakcji alergicznych [Jarcho i współ., 1977; Kokubo i współ., 2003; Sopyan i współ., 2007].
Komercyjnie jest ona dostępna w postaci proszków, granul i kształtek, często o
wygenerowanej porowatości mającej imitować porowatość naturalnej tkanki kostnej. Proszki
i granule, jako struktury niespoiste, są jednak niewygodne w użyciu dla chirurgów
implantujących je w ubytki kostne. Ponadto, oprócz tego czysto praktycznego aspektu,
wszczepione granule mogą się przemieszczać w obrębie obszaru implantacji pod wpływem
nacisku otaczających tkanek. Zjawisko to może doprowadzać do mechanicznego zniszczenia
nowo tworzących się naczyń krwionośnych i spowalniać proces regeneracji tkanki kostnej.
Natomiast kształtki ceramiczne, jako struktury sztywne i kruche, są kłopotliwe podczas
zabiegu, gdyż trudno jest je dopasować do rozmiarów ubytku. Z tych względów prowadzone
są badania mające na celu wytworzenie materiałów, które łączyłyby pozytywne cechy
ceramiki wapniowo-fosforanowej, a jednocześnie niwelowałyby lub zmniejszały problem
niedostatecznej elastyczności i nieporęczności chirurgicznej popularnych proszków i granul.
Przykładami prób rozwiązania tego problemu jest zastosowanie polimerów zwiększających
elastyczność, takich jak już wspomniany nie biodegradowalny dwufazowy analog kostny z
polimerem HEPEX pełniącym rolę lepiszcza dla cząsteczek hydroksyapatytu [Bonfield, 1988]
czy podlegający bioabsorpcji kompozyt hydroksyapatytowo-polilaktydowy (PLLA) [Todo i
współ., 2006]. Jako polimery naturalne, w roli lepiszcza dla ceramiki wapniowo-fosforanowej
mogą występować: chitosan [Kong i współ, 2006], zwierzęcy kolagen [Lawson &
Czernuszka, 1998] lub żel fibrynowy [Le Nihouannen i współ., 2006]. Należy jednak
wspomnieć, że użycie polimerów pochodzenia odzwierzęcego, mimo niewątpliwych zalet,
niesie ze sobą ryzyko przenoszenia chorób lub wywołania odpowiedzi immunologicznej. Stąd
też konieczność uzyskania wysokiego stopnia oczyszczenia tych substratów, co generuje
wysoki koszt produktu finalnego. Kilka kompozytowych materiałów kościozastępczych, które
łączą korzystne cechy HAp i uelastyczniającą plastyczność polimerów, pojawiło się już w
sprzedaży. Należą do nich: EasyGraftTM produkowany przez Degradable Solutions SA
(Szwajcaria), Plexur M i P wytworzone w laboratoriach firmy Osteotech (USA) i CerapatiteCollagen stworzony przez francuską firmę Ceraver Osteal. Jednakże wciąż prowadzone są
intensywne badania w dziedzinie syntezy kompozytowych, poręcznych chirurgicznie
materiałów kościozastępczych, mające na celu poprawę ich jakości i być może również
obniżenie ceny.
Jeszcze innym kłopotliwym efektem ubocznym związanym z implantacją materiałów
kościozastępczych jest ich oddziaływanie na środowisko implantacyjne, mianowicie na
tkankę kostną gospodarza. Oddziaływanie to może przebiegać rozmaicie – od generowania
wysokich temperatur w przypadku polimeryzacji niektórych polimerów, poprzez zjawisko
korozji implantów metalicznych w płynach biologicznych, aż do wydzielania szkodliwych
jonów, jak to zaobserwowano np. dla stopów niklowo-tytanowych. To ostatnie zjawisko
występuje również w przypadku gipsu – szeroko znanego materiału implantacyjnego opartego
na półwodnym siarczanie wapnia (CSH), który po uwodnieniu zamienia się z dwuwodny
siarczan wapnia (CSD), tężejący w cementopodobną masę. Jest on materiałem uznanym za
bezpieczny i bioaktywny, sprzedawanym jako preparaty kościozastępcze takie jak Stimulan®
(Biocomposites LTD, Wielka Brytania) lub OsteosetTM (Wright Medical Technology, Inc.,
USA), Jednakże wykazuje też kilka wad, do których należy dość szybkie tempo resorpcji in
11
vivo. W niektórych przypadkach wytwarzanie nowej tkanki kostnej zostaje zaburzone
wskutek zbyt szybkiego rozpuszczania się gipsu. Konsekwencją zbyt szybkiego tempa
resorpcji gipsu jest też lokalne uwalnianie jonów wapniowych na bardzo wysokim poziomie,
co może działać toksycznie na komórki gospodarza. Stwierdzono w badaniach in vitro, że
osteoblasty ludzkie wykazują osłabioną zdolność do proliferacji w środowisku o
niefizjologicznie wysokim poziomie jonów wapnia [Rauschmann i współ., 2005; Przekora i
współ., 2014], również w przypadku podłoża hodowlanego inkubowanego z preparatem
handlowym OsteosetTM [Winn i Hollinger, 2000]. Badania te potwierdzają doniesienia o
występowaniu stanów zapalnych związanych z implantacją gipsu [Coetzee, 1980; Robinson i
współ., 1999; Lee i współ., 2002]. Jedno z nich podaje, że ciężki stan zapalny pojawiał się aż
w 20% przypadków wszczepienia preparatu OsteosetTM, co tłumaczono akumulacją jonów
wapniowych w okolicy implantu [Robinson i współ., 1999]. Odpowiedź zapalna wywołana
obecnością wszczepionego gipsu może trwać aż do 2 miesięcy od zabiegu implantacji
[Coetzee, 1980; Robinson i współ., 1999; Robinson i współ., 1999; Lee i współ., 2002].
Ciekawe jest, że wydzielanie jonów wapnia wskutek resorpcji gipsu może być tak
intensywne, że powoduje podwyższenie poziomu tych jonów w surowicy krwi (co
zaobserwowano u psów w modelu in vivo) [Peltier i współ., 1957]. Mimo tych wyraźnych
sugestii, że implantacja gipsu może wywołać niekorzystny przejściowy stan zapalny w
okolicach uzupełnianego ubytku kostnego, inne cechy gipsu są niezwykle korzystne dla
implantologii. Z tego powodu materiały oparte na CSH są ogólnie dostępne w chirurgii
ortopedycznej i urazowej, a niekorzystny efekt uboczny w postaci nadmiernego uwalniania
jonów wapnia jest zwykle pomijany w literaturze. Z całą jednak pewnością udoskonalenie
materiałów bazujących na CSH w taki sposób, aby zmniejszyć tempo poimplantacyjnego
uwalniania jonów Ca2+ mogłoby wpłynąć na minimalizację szkodliwych efektów ubocznych
związanych z tym zjawiskiem. W obecnej chwili strategie prowadzące do ulepszenia CSH
jako materiału implantacyjnego bazują raczej na działaniach ograniczających zbyt szybkie
tempo jego resorpcji jedynie po to, by dopasować je do wolnego tempa formowania się
zastępującej gips tkanki kostnej (na przykład przez wprowadzenie wolno resorbowalnej
ceramiki wapniowo-fosforanowej) [Hu i współ., 2010; Greish, 2011]. Natomiast strategie
dążące do zmniejszenia cytotoksyczności gipsu wywołanej intensywnym uwalnianiem jonów
wapniowych nie są notowane w literaturze.
Działania zmierzające do zniwelowania wyżej wymienionych efektów ubocznych
obserwowanych w przypadku stosowanych obecnie kościozastępczych materiałów
implantacyjnych mogłyby doprowadzić do ich udoskonalenia, z korzyścią dla lekarzy,
systemu opieki zdrowotnej, a przede wszystkim dla pacjentów.
12
Wyniki badań związanych z osiągnięciem w postępowaniu habilitacyjnym:
1. rozwiązywanie problemów związanych z zakażeniami materiałów
implantacyjnych
Moje zainteresowanie tematyką zabezpieczania materiałów wszczepiennych przed
zakażeniem bakteryjnym wynikało z kilku czynników. Pierwszym z nich było zdobycie
istotnego doświadczenia w dziedzinie modyfikacji chemicznej matryc stałych w celu
wykorzystania unieruchamianych enzymów w procesach biotechnologicznych (techniki
immobilizacyjne stanowiły podstawę moich badań przed uzyskaniem stopnia doktora).
Drugim czynnikiem było nawiązanie w 2004 roku współpracy z Katedrą Ceramiki i
Materiałów Ogniotrwałych Akademii Górniczo-Hutniczej w Krakowie, która specjalizuje
się w syntezie materiałów ceramicznych dla zastosowań biomedycznych. Trzecim
czynnikiem były badania nad modyfikacją protez naczyniowych za pomocą
antybiotyków, którymi kierowała prof. dr hab. Grażyna Ginalska, pracująca wtedy w
Zakładzie Biochemii Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie. Badania te, w
części których brałam udział, wprowadziły mnie w teorię zagadnienia zakażeń
biomateriałów wszczepiennych. Czwarty czynnik natomiast to zmiana miejsca pracy. W
wyniku przeniesienia się na Uniwersytet Medyczny w Lublinie i objęcia etatu adiunkta w
Katedrze Biochemii i Biotechnologii mogłam pracować w dalszym ciągu w zespole prof.
dr hab. Grażyny Ginalskiej, co było dla mnie bodźcem do skupienia się nad
zagadnieniami możliwymi do zastosowania w praktyce medycznej. Aplikacyjność
testowanych przeze mnie rozwiązań zaczęła bowiem być czynnikiem decydującym o
kierunku moich badań.
Pierwsza próba przeciwbakteryjnego zmodyfikowania porowatej granularnej ceramiki
hydroksyapatytowej zsyntetyzowanej na AGH dotyczyła immobilizacji gentamycyny –
antybiotyku aminoglikozydowego o szerokim spektrum działania. Przed immobilizacją
antybiotyku, granule zostały zaktywowane γ-aminopropyltrietoksysilanem (APTES) i
aldehydem glutarowym, a w niektórych wariantach również keratyną izolowaną z włosów
ludzkich. Ponieważ białko to należy do trudno degradowalnych, należało się zatem
spodziewać, że nie będzie ono ulegało szybkiej hydrolizie w warunkach ludzkiego
organizmu i zapewni długotrwałą immobilizację antybiotyku. Pierwsze uzyskane wyniki
pozwoliły stwierdzić, że ilość immobilizowanej keratyny (co potwierdziło obrazowanie
techniką SEM) w wysokim stopniu zależy od temperatury wypalania i porowatości
granul: im wyższa była temperatura wypalania ceramiki, tym niższa była jej porowatość
oraz ilość wiązanej keratyny. Zarówno silanizacja granul, jak i pokrywanie keratyną
zwiększała też ilość immobilizowanego antybiotyku w stosunku do kontrolnych granul
(nasączanych antybiotykiem bez wcześniejszej modyfikacji). Zauważyłam, że w
przypadku wiązania antybiotyku, porowatość matrycy również ma decydujące znaczenie
(im wyższa, tym więcej leku ulega przyłączeniu). Ustaliłam, że w immobilizacji leku
brały udział wiązania fizyczne (absorpcyjne) oraz kowalencyjne (ponad 50% całej puli
związanego antybiotyku). W przypadku nośnika keratynowanego odnotowałam również
znaczący udział połączeń typu jonowego, praktycznie nieobserwowanych w przypadku
13
granul poddanych wyłącznie silanizacji. Aktywność przeciwbakteryjna badanych
nośników leków dla granul silanizowanych oraz keratynowanych była wyższa niż dla
granul kontrolnych (niemodyfikowanych) i również zależała w sposób odwrotnie
proporcjonalny od temperatury ich wypalania. Z praktycznego punktu widzenia istotne
jest, że badane modyfikowane nośniki utrzymywały swoją wysoką aktywność
przeciwbakteryjną przez okres minimum 4 miesięcy przechowywania w temperaturze
pokojowej.
Uzyskane wyniki są istotne z punktu widzenia moich późniejszych badań, gdyż
pozwoliły mi zwrócić uwagę na wysokoporowatą ceramikę wapniowo-fosforanową o
dużej zawartości mikroporów. Ten typ ceramiki nie cieszy się szczególnym uznaniem
jako handlowy materiał implantacyjny ze względu na znaczną ścieralność
powierzchniową (co jest konsekwencją wysokiej mikroporowatości) i związaną z tym
niską wytrzymałością mechaniczną. Jednakże, mimo tej niewątpliwej wady, stanowi ona
znacznie bardziej obiecujący materiał wyjściowy dla modyfikacji chemicznej niż
ceramika nieporowata, dostępna komercyjnie (np. preparat HA Biocer, ChemaElektromet, Rzeszów). Ponadto, problem jej niskiej wytrzymałości mechanicznej mógłby
być rozwiązany po inkorporacji do fazy łącznikowej typu cement lub polimer.
Uzyskane wyniki badań zostały opublikowane w formie 1 pracy oryginalnej jako artykuł w
czasopiśmie:
Belcarz Anna, Zalewska Justyna, Ginalska Grażyna, Ślósarczyk Anna: Immobilizacja gentamycyny
na nośnikach hydroksyapatytowych w celu nadania im własności antybakteryjnych/Gentamicin
immobilization on hydroxyapatite carriers for increasing their antibacterial properties. Inż.
Biomater./Engineering of Biomater. 47-53 (2005) 34-36.
Przeprowadzone badania, związane z optymalizacją warunków modyfikacji ceramiki
hydroksyapatytowej za pomocą białek, postanowiłam rozszerzyć i uzupełnić o testy
przeprowadzone na najbardziej obiecujących materiałach. W tym celu wybrałam
wysokoporowate granule HAp wypalane w 800oC (67% porowatości otwartej) o porach w
skali mikro, które wiązały najwięcej antybiotyku spośród wszystkich badanych typów
ceramiki i przeprowadziłam dla nich immobilizację białka keratyny i żelatyny, a w drugim
etapie gentamycyny. Uzyskane wyniki dotyczące ilości unieruchomionego antybiotyku i
wydajności immobilizacji były bardzo podobne do wcześniej uzyskiwanych rezultatów,
świadcząc o wysokiej powtarzalności zastosowanej metody. Stwierdziłam, że znacząca
część antybiotyku jest połączona z matrycą za pomocą wiązań kowalencyjnych oraz
niestabilnych oddziaływań adsorpcyjnych. Z kolei wiązania jonowe były odpowiedzialne
za pojawianie się połączeń pomiędzy antybiotykiem a matrycą białkowaną lub
niemodyfikowaną na poziomie 5-10% całej puli leku, dzięki interakcjom ujemnie
naładowanych grup hydroksylowych HAp (granule niemodyfikowane) lub ujemnie
naładowanych reszt w łańcuchach bocznych aminokwasów (granule modyfikowane
białkami) a dodatnio naładowanymi grupami aminowymi antybiotyku. Z kalkulacji
wynikało też, że 34% puli leku przyłączonego do granul niemodyfikowanych musiało
wniknąć głęboko w mikropory ceramiki, gdyż dla tego typu nośnika niemożliwe było
14
pojawienie się wiązań kowalencyjnych. Następnie przeprowadziłam badanie uwalniania
leku ze wszystkich typów granul w dwóch modelach imitujących powolną cyrkulację
płynów tkankowych w tkance kostnej (obszary lepiej i gorzej ukrwione). Stwierdziłam, że
niezależnie od wybranego modelu wymiany płynów, w początkowym okresie największa
ilość leku uwalnia się z matrycy niemodyfikowanej – około dwukrotnie więcej niż z
matryc modyfikowanych. Natomiast w końcowym okresie testu, ilość leku uwalnianego z
matrycy kontrolnej obniżała się do zera, podczas gdy nośniki białkowane wciąż uwalniały
antybiotyk na poziomie wystarczającym do powstrzymania wzrostu szczepów wrażliwych
na gentamycynę (Staphylococcus aureus MR3; MIC 1,22 µg/ml). Mikrobiologiczna ocena
aktywności przeciwbakteryjnej zdezintegrowanych niemodyfikowanych granul po
uwolnieniu leku potwierdziła obecność pewnej puli leku uwięzionej głęboko w
mikroporach. Badanie aktywności przeciwbakteryjnej testowanych granul w obu
modelach wymiany płynów wykazało, że modyfikacja keratyną znacząco przedłuża okres
ochrony przeciwbakteryjnej w porównaniu z innymi badanymi granulami,
prawdopodobnie wskutek słabej biodegradowalności keratyny, przez co tworzy ona
bardziej stabilny łącznik między granulami a cząsteczkami antybiotyku. Co interesujące,
keratynowane granule zapewniły ochronę antybakteryjną podłożu hodowlanemu (co
prawda jedynie przez 2-3 dni) przed wysoce opornym na gentamycynę szczepem S.
epidermidis (MIC 2500 µg/ml). Badania podsumowały testy toksyczności
modyfikowanych granul wobec linii ludzkich osteoblastów hFOB (w celu oceny wpływu
wysokich dawek immobilizowanego antybiotyku lub też możliwych śladowych
pozostałości aldehydu glutarowego). Test na aktywność dehydrogenazy mleczanowej
(detekcja poziomu destrukcji komórkowej), wykonany w momencie uwalniania leku na
najwyższym poziomie wykazał, że granule z immobilizowaną gentamycyną przejawiają
jedynie niewielką, kilkuprocentową cytotoksyczność w porównaniu z granulami bez leku.
Stwierdziłam również, że w trakcie 17-dniowego eksperymentu komórki osteoblastów
ulegały proliferacji na badanych granulach w sposób ciągły, chociaż w odniesieniu do
granul modyfikowanych keratyną tempo ich namnażania było nieznacznie niższe niż w
przypadku pozostałych rodzajów ceramiki.
Wyniki omówionych badań zostały opublikowane w formie 1 pracy oryginalnej jako artykuł w
czasopiśmie:
Belcarz Anna, Ginalska Grażyna, Zalewska Justyna, Rzeski Wojciech, Ślósarczyk Ąnna, Kowalczuk
Dorota, Godlewski Piotr, Niedźwiadek Justyna: Covalent coating of hydroxyapatite by keratin stabilizes
gentamicin release. J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 89B (2009) 102-113.
Podsumowując powyższe badania należy stwierdzić, że zastosowany przeze mnie
sposób modyfikacji mikroporowatej ceramiki hydroksyapatytowej przy pomocy białek
(keratyny i żelatyny) pozwolił na immobilizację znacznych ilości antybiotyków
aminoglikozydowych poprzez wiązania o różnej sile, co zapewnia przedłużenie
uwalniania leku i ochrony przeciwbakteryjnej w stosunku do ceramiki niemodyfikowanej.
Zaproponowana modyfikacja nie wpływa negatywnie na metabolizm i proliferację
osteoblastów ludzkich (z wyjątkiem modyfikacji z użyciem keratyny – nieznaczne
15
spowolnienie tempa proliferacji). Można zatem stwierdzić, że opisany sposób modyfikacji
granul HAp jest efektywnym i obiecującym sposobem na zabezpieczenie implantacyjnej
ceramiki kościozastępczej przed zakażeniem organizmami patogennymi. Wyniki
wykazują również zdecydowaną przewagę ceramiki wysokoporowatej nad nieporowatą w
tym aspekcie aplikacyjnym.
Ostatnie osiągnięcie w omawianej grupie problemowej dotyczy zastosowania, jako
nośnika leku antybakteryjnego, elastycznego kompozytu kościozastępczego złożonego z
wysokoporowatej ceramiki wapniowo-fosforanowej (o porach w skali mikro) oraz
polimeru glukanowego. Kompozyt ten stanowi wynik badań prowadzonych przeze mnie
w celu rozwiązania problemów związanych z niedostateczną poręcznością chirurgiczną
materiałów implantacyjnych. Ze względu na powiązanie tematyczne i chronologiczne,
wyniki badań związanych z opracowaniem wyżej wymienionego kompozytu jako nośnika
leków przeciwbakteryjnych zostaną omówione w kolejnym punkcie tej części
Autoreferatu.
2. rozwiązywanie problemów związanych z niedostateczną poręcznością
chirurgiczną materiałów implantacyjnych
Potrzeba ulepszenia nieporęcznych chirurgicznie ceramicznych materiałów
implantacyjnych pojawiała się w trakcie moich badań stopniowo, podczas prowadzenia
eksperymentów związanych z zabezpieczaniem ceramiki przed zakażeniami bakteryjnymi
i wykształceniem się na ich powierzchni opornego na antybiotykoterapię biofilmu
bakteryjnego. Zwróciłam wówczas uwagę na niewygodę w posługiwaniu się tym sypkim
materiałem. Ponadto zauważyłam, że wysokoporowate (pory w skali mikro) granule, które
okazały się najkorzystniejsze jako obiekt modyfikacji przeciwbakteryjnej, są stosunkowo
podatne na ścieranie powierzchniowe w trakcie obróbki. Dr n. med. Piotr Godlewski
(Klinika Ortopedii i Traumatologii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie), który był w
moich badaniach konsultantem i zwracał uwagę na problemy związane z materiałami
wszczepiennym z punktu widzenia chirurga ortopedy, potwierdził te spostrzeżenia. Z tego
też powodu zaczęłam, wraz z innymi członkami zespołu, poszukiwać rozwiązania, które
umożliwiłoby pokonanie problemów związanych ze ścieralnością wysokoporowatych
granul ceramicznych i jednocześnie sprawiło, aby materiał ten był wygodny dla
chirurgów, łatwiej poddawał się obróbce śródoperacyjnej i dopasowywał się do kształtu i
rozmiarów ubytków kostnych.
W wyniku konsultacji z lubelskimi ortopedami uznaliśmy, że najbardziej obiecującą
strategią wytworzenia takiego materiału jest koncepcja dwufazowego analogu kostnego:
ceramiczno-polimerowego. Chciałam jednak uniknąć zastosowania polimerów
pochodzenia odzwierzęcego, które są już stosowane w implantacji, ale wymagają
kosztownych procedur oczyszczania w celu minimalizacji ryzyka transferu chorób
wirusowych i bakteryjnych. Wśród możliwych materiałów polimerowych pochodzenia
innego niż zwierzęce, najkorzystniejsze parametry okazał się wykazywać β-1,3-glukan
(kurdlan), nietoksyczny polisacharyd produkowany przez bakterie Alcaligenes faecalis,
16
stosowany dość szeroko jako suplement diety. Znalazłam ponadto doniesienia, że
kompozyty kurdlanowo-chitozanowe wykazują aktywność przeciwbakteryjną [Sun i
współ., 2011], zaś kurdlanowo-kolagenowe zostały z pozytywnymi rezultatami
przetestowane w leczeniu oparzeń skórnych u dzieci [Delatte i współ., 2001]. W wyniku
licznych eksperymentów ustaliliśmy, że kurdlan może być łączony z wysokoporowatym
(pory w skali mikro) granulatem ceramicznym w dość szeroko zróżnicowanych
proporcjach, które dla maksymalnej wartości upakowania fazą ceramiczną wynoszą: 9,156,7% kurdlanu i 90,9-43,3% granulatu w suchej masie składników kompozytu.
Minimalna wartość upakowania ceramiki w kompozycie jest uzależniona od osiągnięcia
równomiernego rozłożenia granul w końcowym produkcie i wynosi około 2%. Możliwość
wyprodukowania kompozytu w wielu kombinacjach, zawierających większą lub mniejszą
ilość kurdlanu oraz fazy ceramicznej pozwala na uzyskanie szerokiej gamy produktów, o
cechach dopasowanych do konkretnych wymagań. Granule mogą mieć różną średnicę, od
0,1 mm do 1 mm; dobre parametry osiąga się też stosując mieszankę granul o różnej
średnicy, z uzyskaniem wysokiej jednorodności rozłożenia granul w kompozycie (jak
wykazano techniką mikrotomografii komputerowej). Jedną z najkorzystniejszych i
najbardziej nowatorskich cech kompozytu jest jego elastyczność w stanie mokrym (po
nasączeniu wodą, roztworem soli fizjologicznej, symulowanym płynem tkankowym,
roztworem leku lub krwią). Pozwala ona na dopasowanie kompozytu do rozmiarów i
kształtu wypełnianego ubytku kostnego poprzez ściskanie, zginanie lub przycinanie, co
jest wielkim udogodnieniem dla chirurgów. Badanie kompozytu techniką SEM-EDS
wykazało, że granule są ściśle spojone z powierzchnią warstwy polimerowej, a po
rozdzieleniu tych dwóch warstw na granicy fazy polimerowej wykryto pierwiastki wapń i
fosfor. Świadczy to o tak silnym spojeniu obu faz, że po ich rozdzieleniu część fazy
ceramicznej odrywa się od granul i przyłącza do warstwy polimeru. Używając techniki
spektroskopii FTIR stwierdziłam, że w łączeniu się składników kompozytu decydującą
rolę odgrywa proces okluzji granul przez polimeryzujący kurdlan. Badanie to nie
wykazało bowiem żadnych pasm odpowiadających pojawianiu się nowych wiązań i
potwierdziło rozważania hipotetyczne dotyczące sposobu wiązania tych dwóch faz, gdyż
zarówno w ceramice, jak i w kurdlanie brak aktywnych grup mogących uczestniczyć w
tworzeniu wiązań kowalencyjnych.
Istotną cechą kompozytów jest zdolność pochłaniania wody i związana z tym zmiana
parametrów objętościowych. Zdolność ta jest cenną zaletą biomateriałów, gdyż wysoki
stopień uwodnienia zezwala na szybkie tempo wymiany tlenu i składników odżywczych z
tkanką otaczającą wszczep i jest niezbędny do szybkiej regeneracji ubytków tkanki
chrzęstnej i kostno-chrzęstnej. Zwiększenie objętości kompozytu HAp-kurdlan po
nasączeniu wodą zostało udokumentowane, między innymi, na poziomie strukturalnym
techniką mikroskopii w kontraście Nomarskiego (DIC). Stwierdziłam też, że zdolność do
chłonięcia wody i zwiększania objętości kompozytu zależy w dużym stopniu od
zawartości glukanu: im mniej jest polimeru w składzie kompozytu, tym mniej wody on
absorbuje i w tym mniejszym stopniu zwiększa swoją objętość. Jednakże wymieniona
zależność występuje pod warunkiem maksymalnego upakowania kompozytu granulatem
frakcji ceramicznej (jak podano w procedurze patentowej; Patent 206394).
17
Badanie parametrów mechanicznych kompozytów (w stanie suchym i nasączonym)
dostarczyło interesujących informacji. Okazało się, że wartości wytrzymałości na
ściskanie i modułu Younga odpowiadają wartościom wykazywanym przez tkankę kostną
gąbczastą (zwłaszcza dla kompozytów w stanie suchym). Wartości tych dwóch
parametrów różniły się między sobą dla próbek kompozytu o różnej zawartości kurdlanu.
Wynosiły one odpowiednio: 3,27-5,92 MPa oraz 0,417-0,777 GPa dla próbek suchych
oraz 0,18-0,26 MPa oraz 0,18-0,271 GPa dla próbek nasączonych. Obniżenie wartości
badanych parametrów po nasączeniu materiału płynami nie było niespodzianką, gdyż
właśnie dzięki temu kompozyt stawał się elastyczny i poręczny chirurgicznie. Nie
zauważono znaczącego wpływu procentowego udziału poszczególnych składników
kompozytu na jego parametry mechaniczne w badanym przedziale ich stosunków
ilościowych (9,1-16,7% kurdlanu i 90,9-83,3% ceramiki).
Ze względu na przydatność aplikacyjną kompozytu jako potencjalnego materiału
implantacyjnego, określiłam wpływ sposobu sterylizacji na zachowanie jałowości oraz
wartości parametrów mechanicznych w trakcie przechowywania próbek. W tym celu
wyselekcjonowałam dwa sposoby sterylizacji zasadne w przypadku dwufazowego
kompozytu ceramiczno-polimerowego: autoklawowanie oraz jałowienie tlenkiem etylenu.
Stwierdziłam, że próbki sterylizowane obiema zastosowanymi metodami po 1 roku
przechowywania zachowały pełną jałowość oraz wyjściowe wartości parametrów
mechanicznych, co czyni badany kompozyt dobrym kandydatem do pełnienia funkcji
biomateriału implantacyjnego. Należy wspomnieć, że do chwili obecnej zbadałam
kompozyty po 5 latach od przeprowadzenia procesu sterylizacji: również i te próbki
zachowały pełną jałowość, jednakże dane te nie zostały opublikowane. Kompozyt
wykazał bioaktywność (zdolność do stymulacji odkładania się biologicznego apatytu na
powierzchni materiału inkubowanego w symulowanym płynie tkankowym – SBF). Po 1
miesiącu inkubacji w SBF masa próbki zwiększyła się o około 2,5 %, a technika SEMEDS wykazała obecność odkładających się fosforanów wapnia na dużym obszarze
powierzchni fazy polimerowej. Wysoka mikroporowatość granul HAp użytych do
produkcji kompozytu, dzięki dużej powierzchni właściwej, działa prawdopodobnie
stymulująco na ten proces.
Uzyskane pozytywne rezultaty dotyczące wytworzenia nowego materiału
kompozytowego o właściwościach zbliżonych do kości ludzkiej zdecydowały o
czynnościach związanych z ochroną patentową wynalazku, w pierwszej kolejności w
Urzędzie Patentowym Rzeczpospolitej Polskiej, a następnie w Europejskim Urzędzie
Patentowym. Obie procedury zostały zakończone pozytywnie, co w przypadku EPO
należy uznać za sukces, gdyż polskie wynalazki bardzo trudno opatentować za granicą.
Jednocześnie warto podkreślić, że w ramach interdyscyplinarnego zespołu wynalazczego
(UM w Lublinie, AGH w Krakowie) udało nam się doskonale ze sobą współpracować i
osiągnąć założony cel.
Wyniki omówionych badań zostały opublikowane w formie 1 pracy oryginalnej jako artykuł w
czasopiśmie oraz 2 patentów (jeden polski i jeden międzynarodowy):
18
Belcarz Anna, Ginalska Grażyna, Pycka Teodozja, Zima Aneta, Ślósarczyk Anna, Polkowska Izabella,
Paszkiewicz Zofia, Piekarczyk Wojciech: Application of β-1,3-glucan in production of ceramics-based
elastic composite for bone repair. Centr. Eur. J. Biol. 8(6) (2013) 534-548.
Belcarz Anna, Grażyna Ginalska, Ślósarczyk Anna, Paszkiewicz Zofia. Kompozyt bioaktywny oraz
sposób wytwarzania kompozytu bioaktywnego. Patent Polski nr 206394, Medical Inventi Spółka z
Ograniczoną Odpowiedzialnością (pierwotnie uprawniony do patentu: Uniwersytet Medyczny w Lublinie),
Lublin, Polska. Zgłoszono: 2009; udzielono: 2010.
Belcarz Anna, Grażyna Ginalska, Ślósarczyk Anna, Paszkiewicz Zofia. Bioactive composite and process
for the production of the bioactive composite. International Patent, nr 2421570 B2. Medical Inventi
Spółka z o.o. (pierwotnie uprawniony do patentu: Uniwersytet Medyczny w Lublinie), Lublin, Polska.
Zgłoszono: 2010; udzielono: 25.02.2015 (European Patent Bulletin).
Kompozytowe biomateriały trzeciej generacji są często modyfikowane w taki sposób,
aby stały się nośnikami leków przeciwbakteryjnych, substancji przeciwzapalnych czy też
czynników wzrostu. W oparciu o swoje wcześniejsze badania związane z
zabezpieczaniem granul HAp przed zakażeniem bakteryjnym, wybrałam 2 antybiotyki
aminoglikozydowe (amikacynę i gentamycynę) do modyfikacji elastycznego glukanowoceramicznego kompozytu kościozastępczego. Ze względu na wysoką zdolność kompozytu
do chłonięcia wody, wykluczyłam testowaną wcześniej możliwość aktywacji toksycznym
aldehydem glutarowym i zdecydowałam się na prosty sposób modyfikacji poprzez
nasączanie suchego kompozytu roztworem leku z następczym odparowaniem fazy
wodnej. Sposób ten porównałam z alternatywną metodą wsączania roztworu leku w
granule HAp z następczym odparowaniem fazy wodnej i użyciem takich granul do
produkcji kompozytu kościozastępczego. Z wcześniejszych wyników badań wynikało
bowiem, że niemodyfikowane granule wysokoporowate (o porach w skali mikro) mogą
zatrzymywać znaczną część puli leku wewnątrz swej struktury. Biorąc pod uwagę fakt, że
antybiotyk może wiązać się z kompozytem jonowo, oceniałam 2 potencjalne sposoby jego
działania. Pierwszy dotyczył ochrony przeciwbakteryjnej medium inkubowanego z
modyfikowanym kompozytem (dzięki puli uwolnionego leku). Drugi, założony jako
możliwy, dotyczył ochrony samych próbek kompozytu po całkowitym uwolnieniu
mobilnej puli leku, gdy medium otaczające próbki ulegnie już zakażeniu bakteryjnemu.
Mechanizm uwalniania leków z kompozytów zależy w dużym stopniu od porowatości
próbek. Z przeprowadzonych badań wynikało, że kompozyt charakteryzuje się wysoką
(67% porowatości otwartej) bimodalną porowatością: obecność mikroporów zapewniały
granule ceramiczne, a większych porów – struktura siatki polimerowej kurdlanu.
Zastosowanie spektroskopii FTIR potwierdziło, że zgodnie z oczekiwaniem w tworzeniu
połączeń między kompozytem a obu antybiotykami nie uczestniczyły wiązania
kowalencyjne. Badanie uwalniania leków w układzie zamkniętym pozwoliło mi określić,
że niezależnie od ilości inkorporowanego leku, jego uwalnianie następowało relatywnie
szybko (96-97% w przeciągu pierwszych 48 godzin), z osiągnięciem fazy plateau do 119tej godziny testu. Modelem uwalniania leku była dyfuzja Ficka lub anomalna, zależnie od
sposobu inkorporacji leku. Poza tym jednak stwierdziłam, że sposób ten nie ma większego
19
wpływu na długość okresu uwalniania leku, co z praktycznego punktu widzenia
przemawia za wykorzystaniem prostszego modelu inkorporacji leku bezpośrednio przez
nasączanie gotowego kompozytu. Profile elucji leku w układzie półotwartym,
symulującym model in vivo w tkance kostnej, wykazały istotne podobieństwo w
przypadku kompozytów zawierających różne ilości leków (0,5-2%). Główne różnice
polegały na różnych początkowych ilościach uwolnionych antybiotyków; jednakże pod
koniec eksperymentów dla kompozytów zawierających różne ilości leku obserwowano
podobne (0,2-2 µg/ml) stężenia uwolnionego leku. Warto zauważyć, że niskie, subinhibitorowe stężenia leków pojawiały się w medium przez krótki okres, w trakcie 1-2
końcowych dni eksperymentu, co zmniejsza prawdopodobieństwo zaindukowania
antybiotykoodporności u bakterii.
Badanie działania przeciwbakteryjnego kompozytów modyfikowanych lekiem
(przedstawionych w przytoczonej poniżej publikacji na przykładzie gentamycyny) w
układzie półotwartym wykazało działanie hamujące wzrost bakterii Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa w
podłożu, dzięki uwalnianiu leku. Okres tej ochrony wynosił 8-9 dni dla kompozytu z 1%
zawartością leku i 10-11 dni dla kompozytu z 2% zawartością leku. Wynik ten pozostaje
w zgodności z profilami uwalniania gentamycyny w układzie półotwartym i sugeruje, że
niższe (bezpieczniejsze pod względem cytotoksyczności) dawki inkorporowanego
antybiotyku mogą być wystarczające dla osiągnięcia zakładanych efektów leczniczych.
Ciekawy wynik został uzyskany, gdy kompozyty po całkowitym uwolnieniu mobilnej puli
leku były dalej inkubowane w zakażonych podłożach hodowlanych. Ustalone zostało, że
kompozyty zawierające wyjściowo 2% leku były całkowicie chronione przed adhezją
bakterii przez 2-3 dni, a dopiero po tym czasie komórki zaczynały stopniowo przylegać do
powierzchni kompozytów. Tymczasem kompozyty kontrolne (niemodyfikowane lekiem)
pozwalały na maksymalną adhezję bakterii (106-108 komórek/g suchej masy) już od
pierwszego dnia eksperymentu. Dalsze badania wykazały, że kompozyt modyfikowany
antybiotykiem zawdzięcza obserwowany efekt ochronny niewielkiej ilości leku (około
0,5% całkowitej ilości początkowej), związanej jonowo i działającej jako krótkotrwała
bariera przeciw adhezji komórek bakteryjnych do kompozytu. Literatura podaje, że dla
zabezpieczenia implantów przed wczesnym zakażeniem bakteriami kluczowe są pierwsze
dni po zabiegu i że zastosowanie krótkotrwałej lokalnej ochrony poimplantacyjnej jest
rekomendowane dla uniknięcia indukcji antybiotykooporności bakterii [Laurent i współ.,
2008]. Na podstawie uzyskanych wyników został ustalony wniosek, że kompozyt
modyfikowany lekiem przeciwbakteryjnym według opisanej procedury może z
powodzeniem służyć lokalnej po-implantacyjnej profilaktyce przeciwbakteryjnej, bez
rekomendacji dla leczenia już rozwiniętych infekcji kostnych. Ze względu na konieczność
zabezpieczenia tego rozwiązania, kompozyt z lekiem i sposób jego przygotowania został
objęty ochroną patentową.
Wyniki omówionych badan zostały opublikowane w formie 1 pracy oryginalnej jako artykuł w
czasopiśmie:
Belcarz Anna, Zima Aneta, Ginalska Grażyna: Biphasic mode of antibacterial action of aminoglycoside
antibiotics-loaded elastic hydroxyapatite-glucan composite. Int. J. Pharm. 454 (2013) 285-295.
20
Jednym z najistotniejszych aspektów badań związanych z nowo opracowywanymi
materiałami implantacyjnymi jest weryfikacja ich cech po wszczepieniu do żywego
organizmu. Etap ten pozwala ocenić rzeczywistą przydatność biomateriałów
kościozastępczych. Weryfikację tą udało się przeprowadzić w ramach projektów
prowadzonych we współpracy z Katedrą i Kliniką Chirurgii Zwierząt Uniwersytetu
Przyrodniczego w Lublinie, realizowanych w latach 2011-2014 i finansowanych z grantu
NCN (NCN-5824/B/P01/2011/40) oraz ze środków działalności statutowej Uniwersytetu
Medycznego w Lublinie (DS2/11-13). Oba projekty dotyczyły implantacji kompozytu
kościozastępczego do kości podudzia u króli nowozelandzkich. Jako wykonawca w
ramach tej współpracy zajmowałam się opracowaniem formuły materiału kompozytowego
zawierającego ceramikę wapniowo-fosforanową i polimer glukanowy. Uczestniczyłam
również w analizie uzyskanych rezultatów i przygotowaniu tekstu manuskryptu w języku
angielskim. Uzyskane wyniki potwierdziły, że opracowany kompozyt, zawierający
węglanową ceramikę hydroksyapatytową, spełnia założoną funkcję biomateriału
wspomagającego regenerację tkanki kostnej. Oznaczanie gęstości fazy mineralnej implantu
technikami densytometryczną i mikrotomografii komputerowej wykazało stopniowy zanik
granularnej fazy ceramicznej oraz wzrost gęstości tkanki kostnej w czasie półrocznego
okresu oceny regeneracji ubytku kostnego przy użyciu testowanego kompozytu. Warto
podkreślić, że ocena radiologiczna i histologiczna wykazała postępującą integrację
implantu z tkanką kostną otaczającą wszczep bez żadnych oznak jego odrzucenia.
Uzyskane wyniki badań in vivo sugerują zatem, że badany kompozyt może służyć z
powodzeniem jako materiał do regeneracji ubytków tkanki kostnej.
Wyniki omówionych badan zostały opublikowane w formie 1 pracy oryginalnej jako artykuł w
czasopiśmie:
Borkowski Leszek, Pawłowska Marta, Radzki Radosław P., Bieńko Marek, Polkowska Izabela, Belcarz
Anna, Karpiński Mirosław, Słowik Tymoteusz, Matuszewski Łukasz, Ślósarczyk Anna, Ginalska Grażyna:
Effect of carbonated HAP/β-glucan composite bone substitute on healing of drilled bone voids in the
proximal tibial metaphysic of rabbits. Mater. Sci. Engn.C. (2015) DOI:10.1016/j.msec.2015.04.009.
Pozostałe wyniki badań związanych z implantacją kompozytu są obecnie na etapie
recenzji po zgłoszeniu do procesu publikacji lub przygotowywania do publikacji.
Chciałabym podkreślić, że prawa do wyżej wymienionych patentów odnoszących się
do sposobu wytwarzania kompozytu bioaktywnego oraz kompozytu zmodyfikowanego
lekiem, będących wynikiem zespołowych badań, są od 2011 roku własnością Medical
Inventi Sp. z o.o. (obecnie S.A.), spółki typu spin-off powstałej w celu komercjalizacji
tego wynalazku. Spółka ta, założona również z moim udziałem, jest przykładem, że efekty
badań o charakterze aplikacyjnym można połączyć z działaniami biznesowymi, a
naukowcy-wynalazcy mogą czynnie w nich uczestniczyć. Działania podyktowane
korzyściami Spółki nieco ograniczyły zakres publikowanych danych dotyczących badań
nad właściwościami kompozytu, jednakże duża ich część została przedstawiona w wyżej
zacytowanych pracach.
Od 2013 roku za zgodą Komisji Bioetycznej (nr KE-0254/248/2011) trwają testy
implantacji kompozytu do pacjentów Kliniki Chirurgii Urazowej i Medycyny Ratunkowej,
21
SPSK nr 1 w Lublinie, które również nie zostały jeszcze opublikowane. Nowatorstwo i
zalety bioaktywnego kompozytu kościozastępczego zostały już jednak docenione wieloma
nagrodami w latach 2013-2014 (str. 39-40 niniejszego Załącznika). Szczególnie
podkreślam zdobycie przez kompozyt trzech nagród podczas Targów Innowacji
Technicznych Brussels Innova 2013: nagrody Światowej Organizacji Własności
Intelektualnej (WIPO) za najlepszy wynalazek opracowany przez kobietę-wynalazcę,
Grand Prix Europejskiej Izby Francuskich Wynalazców oraz złotego medalu z
wyróżnieniem.
3. rozwiązywanie problemów związanych z nadmiernym wydzielaniem
jonów wapniowych po implantacji materiałów bazujących na gipsie
Problem nadmiernej kumulacji jonów wapnia po implantacji materiałów opartych na
gipsie zainteresował mnie w wyniku kilkuletnich badań prowadzonych w naszej Katedrze.
W trakcie testowania bioaktywności kompozytu kościozastępczego opisanego powyżej w
Autoreferacie zauważyłam, że granule HAp o różnej porowatości stymulują na różnym
poziomie wychwyt jonów Ca2+, Mg2+ oraz PO43- z podłóż typu SBF lub pożywki
hodowlane. Wychwyt tych jonów był z reguły tym intensywniejszy, im większą
porowatością i całkowitą powierzchnią właściwą charakteryzowała się ceramika.
Obserwacja ta skierowała naszą uwagę na zagadnienie dynamiki wymiany jonowej w
przypadku różnych materiałów kościozastępczych. Ustalono w nich między innymi, że
materiały kompozytowe oparte na gipsie charakteryzują się intensywnym wyrzutem
jonów wapniowych do podłóż hodowlanych, co skutkuje znaczącym ograniczeniem
zdolności proliferacyjnych komórek osteoblastów ludzkich [Przekora i współ., 2014],
zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami literaturowymi cytowanymi uprzednio w
Autoreferacie (str. 12). Postanowiłam zatem zainteresować się zagadnieniem ograniczenia
toksyczności wywołanej szybką rozpuszczalnością gipsu w mediach wodnym. Mogłoby
to doprowadzić do wytworzenia ulepszonych materiałów kompozytowych opartych na
tym korzystnym materiale, nie wykazującym szkodliwego cytotoksycznego efektu.
Pierwsza próba rozwiązania tego problemu opierała się na koncepcji wykorzystania
niskoporowatej ceramiki hydroksyapatytowej (handlowy preparat HA Biocer, ChemaElektromet, Rzeszów) oraz polimerów polisacharydowych chelatujących jony wapnia:
alginian oraz egzopolisacharyd (EPS) izolowany z organizmów Rhizobium w Zakładzie
Genetyki i Mikrobiologii UMCS w Lublinie. W założeniu ceramika miała spełniać rolę
trudno rozpuszczalnego wypełniacza, generującego jednocześnie porowatość in vivo w
implantowanym materiale kompozytowym, a polimery wiązać jony wapnia uwalniane z
rozpuszczającego się gipsu. Dla obu wymienionych polimerów stwierdziłam wysoką
zdolność do chelatowania kationów dwuwartościowych, w tym Ca2+, co czyni je dobrymi
kandydatami dla realizacji założonego celu. Konieczność jednorodnego wprowadzenia
polimerów polisacharydowych do kompozytów ograniczało ich zawartość w mieszankach
do 5% (dla alginianu w postaci proszku). Zarówno dodatek HAp, jak i polimeru w
proponowanych kompozytach wydłużał czas wiązania gipsu (setting time), jednak w
22
granicach akceptowalnych z praktycznego punktu widzenia. Zauważyłam ponadto
(obserwacje techniką mikroskopii SEM), że dodatek obu substancji zmienia
charakterystykę struktury gipsu, czyniąc ją bardziej porowatą. Następnie zbadałam
zdolność czynników wzbogacających gips do ograniczania wydzielania jonów
wapniowych do środowiska wodnego. Stwierdziłam, że w modelu stacjonarnym zdolność
wprowadzonych cząsteczek polimerowych do wychwytu jonów Ca2+ jest znikoma i
ogranicza się do pierwszych godzin testu. Natomiast obecność HAp przyśpiesza adsorpcję
jonów fosforanowych przez kompozyt. Z kolei w modelu dynamicznym (wymiana płynu
inkubowanego z kompozytem) zaobserwowałam, że wychwyt jonów Ca2+ i Mg2+ był dość
wyraźny, ale ograniczał się do pierwszej doby eksperymentu, czyli pierwszej wymiany
płynu. Już w czasie drugiej wymiany efekt wychwytu jonów przez alginian zmienia się:
stężenie jonów Ca2+ rośnie nawet powyżej poziomu wykazywanego przez czysty gips, zaś
stężenie jonów Mg2+ spada. Tendencja ta utrzymuje się podczas kolejnych etapów
doświadczenia, co świadczy o ustaleniu się specyficznego stanu równowagi jonowej
pomiędzy wychwytem i uwalnianiem obu kationów przez gips. Wywnioskowałam też, że
obecność HAp w strukturze gipsu zwiększa jego porowatość i całkowitą powierzchnię
kontaktu z otaczającym płynem, co może zwiększać tempo rozpuszczania fazy gipsowej.
W oparciu o uzyskane wyniki musiałam zatem stwierdzić, że założona koncepcja
ograniczania nadmiernego wyrzutu jonów wapnia przez gips przy użyciu niskoporowatej
ceramiki HAp i polimerów polisacharydowych okazała się niewystarczająca, aby spełnić
pokładane w niej nadzieje.
W drugim etapie badań nad zmniejszeniem toksyczności gipsu postanowiłam
zaadaptować wysokoporowate granule ceramiczne jako czynnik modyfikujący gips i
wychwytujący jony wapnia. W założeniu, większa porowatość i całkowita powierzchnia
właściwa ceramiki mogła się przekładać na zwiększony wychwyt jonów służących do
wytrącenia biologicznego apatytu. Do wytworzenia kompozytów gipsowo-ceramicznych
użyłam zatem granul wypalanych w temperaturach 90oC, 400oC, 800oC i 1150oC. Dwie
pierwsze partie granul, co ustalono we współpracy z Katedrą Inżynierii Materiałowej
(Wydział Mechaniczny, Politechnika Lubelska) stanowiły czysty hydroksyapatyt z
wbudowanymi grupami karboksylowymi, co czyniło je bardziej zbliżonymi strukturalnie
do apatytu biologicznego. Dwie zaś kolejne stanowiły mieszankę HAp i TCP (fosforanu
trójwapniowego) i nie zawierały grup CO32-. Oznaczyłam dla nich zdolność do wychwytu,
z wodnego środowiska zewnętrznego, jonów kluczowych dla syntezy biologicznego
apatytu oraz porowatość (dzięki udziałowi Instytutu Agrofizyki Polskiej Akademii Nauk
w Lublinie), jako najważniejszy z punktu widzenia tego eksperymentu parametr fizyczny.
Okazało się, że granule wypalane w niższych temperaturach (90oC, 400oC i 800oC)
wykazują bardzo znaczące zdolności do wiązania jonów Ca2+ (do 99% całkowitej puli
jonów obecnych w środowisku wodnym) przy jednoczesnej wysokiej, bardzo zbliżonej
porowatości. Tymczasem granule wypalane w temperaturze 1150oC, praktycznie
nieporowate, wychwytywały nie więcej niż 50% całkowitej puli jonów wapniowych.
Granule wszystkich czterech typów użyłam zatem do wytworzenia kompozytów gipsowoceramicznych, które poddałam dalszej charakterystyce.
23
Zauważyłam, że czas wiązania mieszanek zmieniał się wraz z całkowitą powierzchnią
porów w granulach: skracał się wraz ze zmniejszeniem tego parametru. Zawartość granul
generowała porowatość kompozytu, największą dla granul wygrzewanych w 400oC i
800oC (9-13%), a najmniejszą dla tych wypalanych w 1150oC (3-3,5%). Zbadałam
zdolność wytworzonych kompozytów do zmiany profilu jonów wapniowych uwalnianych
przez rozpuszczającą się fazę gipsową kompozytów w 8-dniowym teście dynamicznym (z
zastosowaniem stale przepływającego SBF) i otrzymałam ciekawe rezultaty. W
pierwszych dniach testu, poziom jonów wapnia w SBF przepływającym przez kompozyty
z wysokoporowatymi granulami był nawet nieco wyższy niż dla kontrolnych próbek
czystego gipsu. Natomiast już po 3 dniach eksperymentu poziom Ca2+ w SBF
przepływającym przez próbki kompozytowe spadał poniżej poziomu w próbce kontrolnej.
Przeprowadzona na koniec doświadczenia analiza próbek kompozytów techniką FTIR (na
zawartość grup karboksylowych, wyznacznik obecności naturalnego apatytu) wykazała,
że kompozyty zawierające granule wysokoporowate znacząco wzbogacały się w
biologiczny apatyt w porównaniu z pozostałością czystego kontrolnego gipsu. Z kolei
kompozyty zawierające nieporowatą ceramikę nie skracały czasu, w którym w medium
otaczającym próbki obserwowano wysoki poziom jonów wapniowych ani nie generowały
znaczącego wzrostu zawartości apatytu biologicznego. W podsumowaniu
przeprowadzonych badań mogę stwierdzić, że zastosowanie wysokoporowatych granul
ceramicznych do wyprodukowania gipsowo-ceramicznych kompozytów pozwala na
skrócenie okresu potencjalnej toksyczności związanej z wydzielaniem znaczących stężeń
jonów wapnia do środowiska wodnego oraz stymuluje proces mineralizacji, przejawiający
się odkładaniem biologicznego apatytu. Uważam uzyskane wyniki za bardzo istotne z
poznawczego i aplikacyjnego punktu widzenia, gdyż zwracają one uwagę na
wysokoporowatą ceramikę apatytową o dużej zawartości mikroporów, która do tej pory
była zwykle pomijana w zastosowaniach praktycznych ze względu na swoją niską
wytrzymałość mechaniczną. Zastosowanie tego typu ceramiki w połączeniu z fazą typu
gips może doprowadzić do wytworzenia nowych, udoskonalonych kompozytów
kościozastępczych dla leczenia ubytków kostnych.
Wyniki omówionych badan zostały opublikowane w formie 2 prac oryginalnych jako artykuły w
czasopiśmie:
Belcarz Anna, Janczarek Monika, Kołacz Karolina, Urbanik-Sypniewska Teresa, Ginalska Grażyna: Do
Ca2+-chelating polysaccharides reduce calcium ion release from gypsum-based biomaterials? Centr.
Eur. J. Biol. 8(8) (2013) 735-746.
Belcarz Anna, Zalewska Justyna, Pałka Krzysztof, Hajnos Mieczysław, Ginalska Grażyna: Do Ca2+adsorbing ceramics reduce the release of calcium ions from gypsum-based biomaterials? Mater. Sci.
Engn. C. 47 (2015) 256-265.
24
Podsumowanie badań
habilitacyjnym:
związanych
z
osiągnięciem
w
postępowaniu
Uzyskane przeze mnie wyniki badań pozwoliły ustalić, że:
1. wysokoporowata (pory w skali mikro) ceramika wapniowo-fosforanowa nadaje
się z powodzeniem (w znacznie większym stopniu niż komercyjnie dostępna
ceramika niskoporowata) jako substrat do modyfikacji antybiotykami z grupy
aminoglikozydów, co zapewnia jej przedłużoną aktywność przeciwbakteryjną bez
wprowadzania cytotoksyczności wobec ludzkich komórek kostnych;
2. wysokoporowata (pory w skali mikro) ceramika wapniowo-fosforanowa może
być użyta do produkcji nowych materiałów kompozytowych do regeneracji
tkanki kostnej opartych na gipsie (CSH). Jej zastosowanie pozwala skrócić
okres, w którym gips może wykazywać cytotoksyczność zależną od uwalniania
wysokich stężeń jonów wapnia oraz zwiększyć jego bioaktywność poprzez
przyspieszenie odkładania się na powierzchni kompozytów biologicznego apatytu.
3. wysokoporowata (pory w skali mikro) ceramika wapniowo-fosforanowa w
połączeniu z polimerem kurdlanowym pozwala na otrzymanie (według
opatentowanej procedury) nowatorskiego kompozytu kościozastępczego dla
medycyny regeneracyjnej. Wynalazek ten uważam za kluczowe osiągnięcie w
badaniach zgłoszonych do postępowania habilitacyjnego. Spośród innych
kompozytów kościozastępczych dostępnych na rynku lub będących w trakcie
badań w skali laboratoryjnej wyróżnia się on: wysoką elastycznością i
poręcznością chirurgiczną, bioaktywnością, zdolnością do wiązania leków
przeciwbakteryjnych dla zapobiegania wczesnym pooperacyjnym infekcjom
bakteryjnym, podatnością na sterylizację bez zmian parametrów mechanicznych i
fizykochemicznych oraz stabilnością w przechowywaniu. Zastosowanie do jego
syntezy polimeru bakteryjnego eliminuje ryzyko transferu chorób
odzwierzęcych i pozwala na zachowanie kosztów jego produkcji na relatywnie
niskim poziomie, co wyróżnia go spośród innych produktów w wąskim segmencie
elastycznych materiałów kościozastępczych. Jeszcze jedną nietypową cechą
kompozytu jest jego wysoka zdolność do magazynowania wody oraz związane
w tym zwiększanie objętości, co pozwala na dynamiczne i szczelne wypełnianie
ubytków kostnych w trakcie zabiegu implantacji. Rozwiązania dotyczące syntezy
elastycznego kompozytu kościozastępczego zostały poddane zaawansowanej
ocenie in vivo, która wykazała, że stanowi on obiecujący materiał do wypełnień
ubytków kostnych.
O
randze
wynalazku
dotyczącego
kompozytowego
biomateriału
kościozastępczego nowej generacji świadczy w mojej opinii fakt, że uzyskał on
europejską ochronę patentową według procedury EPO, co udało się w
przypadku niewielu polskich wynalazków z dziedziny medycyny regeneracyjnej.
Wynalazek zdobył również szereg nagród na terenie kraju i poza jego granicami,
zwłaszcza prestiżowe nagrody na Targach Brussels Innova 2013: złoty medal z
wyróżnieniem, medal Światowej Organizacji Własności Intelektualnej (WIPO) za
25
najlepszy wynalazek opracowany przez kobietę-wynalazcę oraz Grand Prix
Europejskiej Izby Francuskich Wynalazców. Dowodzą one, że nowatorstwo
kompozytu zostało docenione na arenie międzynarodowej. O wysokim
potencjale kompozytu świadczy też fakt, że do celów jego komercjalizacji w
2011-tym roku została powołana spółka typu spin-off – Medical Inventi Sp. z
o.o. (obecnie S.A.), której głównym zadaniem jest obecnie wytworzenie
notyfikowanej linii produkcyjnej dla kompozytu oraz przeprowadzenie procesu
jego certyfikacji i rejestracji do zastosowań medycznych. Spółka przeprowadza
aktualnie kroki mające na celu pozyskanie kolejnej puli dofinansowania
pozwalającego na zrealizowanie zamierzonych celów.
W podsumowaniu badań przedstawionych do oceny w postępowaniu habilitacyjnym
chciałabym podkreślić, że stanowią one w większości innowacyjne rozwiązania
nakierowane na zastosowanie w medycynie regeneracyjnej ubytków kostnych. Pozwalają
one na udoskonalenie cech materiałów kościozastępczych dostępnych aktualnie na rynku i
uzyskanie materiałów bardziej opornych na post-implantacyjne zasiedlanie przez bakterie, o
zmniejszonym działaniu toksycznym oraz bardziej poręcznych chirurgicznie. Badania, ze
względu na swój interdyscyplinarny charakter, były prowadzone w konsultacji lub we
współpracy ze specjalistami z poszczególnych dziedzin badawczych, odpowiednich do
założonej tematyki. Nadzór merytoryczny lekarzy – specjalistów w dziedzinie ortopedii i
chirurgii traumatologicznej – przyczynił się do prawidłowego zaprojektowania doświadczeń i
odpowiedniej interpretacji ich wyników w zakresie przydatności do zastosowań
biomedycznych.
Łączny współczynnik wpływu (IF) moich prac, wchodzących w skład
osiągnięcia zgłoszonego do postępowania habilitacyjnego, wyniósł 12,708
(punkty KBN/MNiSW = 161).
Piśmiennictwo:
[Agraval & Ray, 2001] Agraval C.M. & Ray R.B. 2001. Biodegradable polymeric scaffolds for musculoskeletal
tissue engineering. J. Biomed. Mater. Res. 55; 141-150.
[Aoki, 1994] Aoki H. 1994. Medical applications of hydroxyapatite. Ishiyaki EuroAmerica Inc, Tokyo St. Louis.
[Aronov i współ., 2007] Aronov, D., Karlov, A., Rosenman, G. 2007. Hydroxyapatite nanoceramics: Basic
physical properties and biointerface modification. J. Eur. Cer. Soc. 27; 4181-4196.
[Boccaccini i współ., 2002] Boccaccini A.R., Roether J.A., Hench L.L., Maquet V, Jérôme R. 2002. A
composites approach to tissue engineering. Ceram. Eng. Sci. Proc. 23; 805-816.
[Bone and Joint Decade’s Musculoskeletal Portal 2007] Bone and Joint Decade’s Musculoskeletal Portal 2007;
[HYPERLINK: http://www.boneandjointdecade.org].
[Bonfield, 1988] Bonfield W. 1988. Composites for bone replacement. J. Biomed. Eng. 10; 522-526.
26
[Chai i współ., 2007] Chai, F., Hornez, J.-C., Blanchemain, N., Neut, C., Descamps, M., Hildebrand, H.F. 2007.
Antibacterial activation of hydroxyapatite (HA) with controlled porosity by different antibiotics. Biomol. Engin.
24; 510-514.
[Clark i współ., 1985] Clark, W.B., Lane, M.D., Beem, J.E., Bragg, S.L., Wheeler, T.T. 1985. Relative
hydrofobicities of Actinomyces viscosus and Actinomyces naeslundii strains and their adsorption to saliva-treated
hydroxyapatite. Infect. Immun. 47; 730-736.
[Coetzee, 1980] Coetzee A.S. 1980. Regeneration of bone in the presence of calcium sulphate. Arch.
Otolaryngol. 106; 405-409.
[Darouiche, 2004] Darouiche R.O. 2004. Treatment of infections associated with surgical implants. New
England J. Med. 350; 1422-1429.
[Delatte i współ., 2001] Delatte S.J., Evans J., Hebra A., Adamson W., Otherson H.B., Tagge E.P. 2001.
Effectiveness of beta-glucan collagen for treatment of partial-thickness burns in children. J. Pediatric Surg. 36;
113-118.
[Ginebra i współ., 2006] Ginebra M.P., Traykova T. & Planell J.A. 2006. Calcium phosphate cements as bone
drug delivery systems. J. Control. Release 113; 102-110.
[Goel, 2006] Goel, S.C. 2006. Infections following implant surgery. Indian J. Orthop. 40; 133-137.
[Goulet i współ., 1997] Goulet J.A., Senunas L.E., DeSilva G.L. & Greengield M.L.V.H. 1997. Autogenous iliac
crest bone graft. Complications and functional assessment. Clin. Orthop. 339; 76-81.
[Greish, 2011] Greish Y.E. 2011. Phase evolution during the low temperature formation of calcium-deficient
hydroxyapatite-gypsum composites. Cer. Int. 37; 1493-1500.
[Hench, 1980] Hench L.L. 1980. Biomaterials. Science 208; 826-831.
[Hench & Polak, 2002] Hench L.L. & Polak J.M. 2002. Third-generation biomedical materials. Science 259;
1014-1017.
[Hicks & Greenhalgh, 1997] Hicks R.C.J. & Greenhalgh R.M. 1997. The pathogenesis of vascular graft
infection. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 14 (Suppl. A); 5-9.
[Hu i współ., 2010] Hu G., Xiao L., Fu H., Bi D., Ma H., Tong P. 2010. Study on injectable and degradable
cement of calcium sulphate and calcium phosphate for bone repair. J. Mater. Sci: Mater. Med. 21; 627-634.
[Jarcho i współ., 1977] Jarcho M., Kay J.F., Gumar K.I., Doremus R.H., Drobeck H.P. 1977. Tissue, cellular and
subcellular events at a bone-ceramic hydroxyapatite interface. J. Biosci. Bioeng.1; 79-91.
[Kokubo i współ., 2003] Kokubo T., Kim H.-M., Kawashita M. 2003. Novel bioactive materials with different
mechanical properties. Biomaterials 24; 2161-2175.
[Kong i współ., 2006] Kong, L., Gao, Y., Lu, G., Gong, Y., Zhao, N., Zhang, X. 2006. A study of the bioactivity
of chitosan/nano-hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering. Eur. Polymer J. 42; 31713179.
[Krisanapiboon i Buranapanitkit, 2006] Krisanapiboon, A. & Buranapanitkit, B. 2006. Biocompatibility of
hydroxyapatite composite as a local drug delivery system. J. Orthop. Surg. 14; 315-318.
[Laurent i współ., 2008] Laurent, F., Bignon, A., Goldnadel, J., Chevalier, J., Fantozzi, G., Viguier, E., Roger,
T., Boivin, G., Hartmann, D. 2008. A new concept of gentamicin loaded HAP/TCP bone substitute for
prophylactic action: in vitro release validation. J. Mater. Sci.: Mater. Med. 19; 947-951.
27
[Lawson & Czernuszka, 1998] Lawson, A.C. and Czernuszka, J.T. 1998. Collagen-calcium phosphate
composite. Proc. Inst. Mech. Eng: Part H. 212; 413-425.
[Lee i współ., 2002] Lee G.H., Khoury J.G., Bell J.-E., Buckwalter J.A. 2002. Adverse reactions to Osteoset
bone graft substitute: The incidence in a consecutive series. Iowa Orthop. J. 22; 35-38.
[Le Nihouannen i współ., 2006] Le Nihouannen D., Le Guehennec L., Rouillon P., Bilban M., Layrolle P.,
Daculsi G. 2006. Micro-architecture of calcium phosphate granules and fibrin flue composites for bone tissue
engineering. Biomaterials 27; 2716-2722.
[Navarro i współ., 2008] Navarro M., Michiardi A., Castaño O., Planell J.A. 2008. Biomaterials in Orthopaedics.
J. R. Soc. Interface 5; 1137-1158.
[Pedersen i współ., 2010] Pedersen, A.B., Svendsson, J.E., Johnsen, S.P., Riis, A., Overgaard, S. 2010. Risk
factors for revision due to infection after primary total hip arthoplasty. Acta Orthop. 81; 542-547.
[Peltier i współ., 1957] Peltier L.F., Bickel E.Y., Lillo R., Thein M.S. 1957. The use of Plaster of Paris to fill
defects in bone. Ann. Surg. 146; 61-69.
[Pichavant i współ., 2012] Pichavant, L., Amador, G., Jacqueline, C., Brouillaud, B., Héroguez, V., Durrieu, M.Ch. 2012. pH-controlled delivery of gentamicin sulfate from orthopedic devices preventing nosocomial
infections. J. Contr. Release 162; 373-381.
[Przekora i współ., 2014] Przekora A., Czechowska J., Pijocha D., Ślósarczyk A., Ginalska G. 2014. Do novel
cement-type biomaterials reveal ion reactivity that affects cell viability in vitro? Centr. Eur. J. Biol. 9; 277-289.
[Rauschmann i współ., 2005] Rauschmann M.A., Wichelhaus T.A., Stirnal V., Dingeldein E., Zichner L.,
Schnettler R. et al. 2005. Nanocrystalline hydroxyapatite and calcium sulphate as biodegradable composite
carrier material for local delivery of antibiotics in bone infections. Biomaterials 26; 2677-2684.
[Robinson i współ., 1999] Robinson D., Alk D., Sandbank J., Farber R., Halperin N. 1999. Inflammatory
reactions associated with a calcium sulphate bone substitute. Annals Transplant. 4; 91-97.
[Sanderson, 1991] Sanderson, P.I. 1991. Infection of orthopaedic implants. J. Hosp. Infect. 18A; 367-375.
[Sopyan i współ., 2007] Sopyan I., Mel M., Ramesh S., Khalid K.A. 2007. Porous hydroxyapatite for artificial
bone applications. Sci. Tech. Adv. Mater. 8; 116-123.
[Spaans i współ., 2000] Spaans C.J., Belgraver V.W.,. Rienstra O., de Groot J.H., Veth R.P.H., Pennings A.J.
2000. Solvent-free fabrication of micro-porous polyurethane amide and polyurethane-urea scaffolds for repair
and replacement of the knee-joint meniscus. Biomaterials 21; 2453-2460.
[Ślósarczyk A., 2003] Ślósarczyk A. 2003. Biomateriały ceramiczne, W: Błażewicz S, Stoch L. (Eds.),
Biocybernetyka i Inżynieria Biomedyczna 2000, V.1: Biomateriały, Akademicka Oficyna Wydawnicza EXIT,
Warszawa.
[Suchanek i Yoshimura, 1998] Suchanek W., Yoshimura M. 1998. Processing and properties of hydroxyapatitebased biomaterials for use as hard tissue replacement. J. Mater. Res. 13; 94-117.
[Sun i współ., 2011] Sun Y., Liu Y., Li Y., Lv M., Li P., Xu H. I współ. 2011. Preparation and characterization
of novel curdlan/chitosan blending membranes for antibacterial applications. Carbohydrate Polymers 84; 952959.
[Takahashi i współ., 2005] Takahashi Y., Yamamoto M. & Tabata Y. 2005. Osteogenic differentiation of
mesenchymal stem cells in biodegradable sponges composed of gelatin and β-tricalcium phosphate. Biomaterials
26; 3587-3596.
28
[Temenoff & Mikos, 2000] Temenoff J.S. & Mikos A.G. 2000. Tissue engineering for regeneration of articular
cartilage. Biomaterials 21; 431-440.
[Todo i współ., 2006] Todo M., Park S.D., Arakawa K., Takenoshita Y. 2006. Relationship between
microstructure and fracture behaviour of bioresorbable HA/PLLA composites. Composites: Part A 37; 22212225.
[Winn i Hollinger, 2000] Winn S.R. i Hollinger J.O. 2000. An osteogenic cell culture system to evaluate the
cytocompatibility of Osteoset®, a calcium sulfate bone void filler. Biomaterials 21; 2413-2425.
OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWOBADAWCZYCH
Badania stanowiące mój dorobek naukowy, poza głównym nurtem badawczym
dotyczącym modyfikacji ceramiki wapniowo-fosforanowej i jej zastosowania w
otrzymywaniu kompozytowych biomateriałów kościozastępczych nowej generacji, składały
się na kilka zasadniczych kierunków:
- zastosowanie technik immobilizacyjnych do unieruchamiania na matrycach stałych
enzymów dla procesów biotechnologicznych oraz ligandów do produkcji nośników dla
chromatografii powinowactwa,
- wykrywanie, oczyszczanie i charakteryzacja enzymów izolowanych z drożdży,
- zastosowanie grzyba Bjerkandera adusta R59 w degradacji szkodliwych związków
antrachinonowych (odpadów poprodukcyjnych antybiotyków w postaci odcieku i pulpy)
oraz oczyszczania wody z zanieczyszczeń naturalnych (kwasów huminowych),
- immobilizacja antybiotyków aminoglikozydowych na protezach naczyniowych w celu
zapewnienia im stabilnej ochrony przeciwbakteryjnej,
- immobilizacja czynnika wzrostu na niciach szewnych w celu poprawy jakości gojenia
zrostów naczyniowych,
- izolacja, charakterystyka i immobilizacja peroksydazy z kapusty w celu jej użycia do
produkcji ogniw nowej generacji do ilościowych pomiarów tlenu i jego pochodnych,
- modyfikacja powierzchni metalicznych czynnikami o aktywności przeciwbakteryjnej i
ocena tej aktywności.
Praca naukowa przed obroną pracy doktorskiej
Moja praca naukowa rozpoczęła się w 1995 roku w Zakładzie Biochemii Uniwersytetu
Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie. Poszukując tematu do badań, zapoznawałam się z
wieloma różnorodnymi technikami laboratoryjnymi. Zaangażowałam się między innymi w
29
badanie wpływu wybranych jonów na zmiany aktywności peroksydaz izolowanych z chrzanu
i kapusty, stymulację hodowli stacjonarnych grzybów w celu syntezy enzymów biorących
udział w rozkładzie drewna oraz w pozyskiwanie hodowli kalusowych tkanek roślinnych.
Jednocześnie zapoznawałam się z technikami immobilizacji enzymów na nośnikach stałych
modyfikowanych poprzez ich aktywne grupy chemiczne (np. aminowe, karboksylowe). Moje
pierwsze doświadczenia z tej dziedziny dotyczyły immobilizacji inwertazy z drożdży
Saccharomyces cerevisiae na różnych matrycach: szkle porowatym, pumeksie, żelu
krzemionkowym aktywowanych na 2 sposoby: γ-aminopropyltrietoksysilanem lub
poliakrylamidem. Określiłam wydajności procesu immobilizacji inwertazy, a dla
unieruchomionego enzymu wykonałam optymalizację warunków pozyskiwania syropu
inwertowanego w zaprojektowanym do tego celu mini-reaktorze do ciągłej inwersji roztworu
tego cukru. Bardzo interesujące było to, że efektywność opracowanego mini-reaktora
utrzymywała się na poziomie do 80% aktywności początkowej nawet po 110 dniach pracy.
Zastosowanie tego reaktora podkreśliło zarówno znaczenie poznawcze, jak i aplikacyjne
wykonanych badań, gdyż jego stabilność katalityczna oraz wysoka wytrzymałość
mechaniczna sprawiają, że zasługuje on w pełni na rozpatrywanie takiego katalizatora przy
zastosowaniach w większej skali.
Efektem pracy badawczej jest 1 praca oryginalnej jako artykuł w czasopiśmie:
Ginalska Grażyna, Belcarz Anna, Łobarzewski Jerzy, Wolski Tadeusz: Zastosowanie immobilizowanej
inwertazy do ciągłej produkcji inwertowanej sacharozy. Biotechnologia 1 (44) (1999) 226 – 237.
Jednocześnie poszukiwałam innego źródła inwertazy dla celów immobilizacji i
pozyskiwania syropu glukozowego niż handlowy preparat z drożdży Saccharomyces
cerevisiae. Znalazłam je w postaci szczepu drożdżowego Candida utilis z kolekcji banku
szczepów Zakładu Biochemii UMCS w Lublinie. Szczep ten, hodowany na odpowiednich
pożywkach, pozwalał na syntezę znacznych ilości zewnątrzkomórkowej inwertazy. W
poszukiwaniach metody oczyszczania tego enzymu z podłoża pohodowlanego
przygotowywałam różne nośniki do przeprowadzania rozdziału metodą kolumnowej
chromatografii powinowactwa. Doskonaliłam tym sposobem swój warsztat metod w zakresie
technik immobilizacyjnych, testując wiele nierozpuszczalnych matryc, metod aktywacji oraz
ligandów, dostosowanych do potrzeb oczyszczania konkretnych związków. Wówczas też,
oczyszczając inwertazę otrzymywaną w trakcie hodowli drożdży Candida utilis na różnych
pożywkach, zauważyłam obecność nietypowej niskocząsteczkowej formy tego enzymu,
pojawiającej się tylko w pewnych warunkach hodowlanych obok innej formy,
wysokocząsteczkowej i dobrze scharakteryzowanej w literaturze z dziedziny enzymologii.
Wyniki omówionych badań z zakresu wytwarzania i zastosowania matryc do chromatografii powinowactwa
zostały opublikowane w formie 4 prac oryginalnych jako artykuły w czasopiśmie lub referatów zjazdowych
konferencji międzynarodowych:
30
Belcarz Anna, Ginalska Grażyna, Łobarzewski Jerzy, Greppin Hubert, Fiedurek Jerzy: The optimization of the
liquid affinity chromatography conditions of the extracellular invertase isolation from the Candida utilis
cultures. Chromatographia Supplement, vol. 51 (2000) 121 – 130.
Ginalska Grażyna, Belcarz Anna, Łobarzewski Jerzy, Cho Nam-Seok, Leonowicz Andrzej: The comparative
purification of the extracellular invertase (Candida utilis) using affinity chromatography method on two
different activated porous glass (keratin or 3-aminopropyltrietoxysilane). W: Proceedings of the 1st
International Symposium on New Horizon of Bioscience in Forest Products Field. Cheongju, 2000, s. 167-173.
Ginalska Grażyna, Belcarz Anna, Łobarzewski Jerzy, Cho Nam-Seok, Leonowicz Andrzej: Purification of the
extracellular invertase (Candida utilis) using affinity chromatography. W: Proceedings of the 3rd
International Symposium on New Horizon of Bioscience in Forest Products Field. Cheongju, April 18-19, 2001,
s. 111-117.
Ginalska Grażyna, Belcarz Anna, Łobarzewski Jerzy, Leonowicz Andrzej, Cho Nam-Seok: Purification of the
Candida utilis extracellular invertase using affinity chromatography. J. Wood. Sci. Tech. 30(3) (2002) 12-17.
Odkrycie wyżej wspomnianej nietypowej formy inwertazy zaintrygowało mnie,
postanowiłam więc zgłębić ten temat. W trakcie mojego dwuletniego stażu w Katedrze
Fizjologii Roślin na Uniwersytecie Genewskim w Szwajcarii przeprowadzałam
doświadczenia związane z wyizolowaniem i scharakteryzowaniem tej formy enzymu.
Stwierdziłam, że nietypowa forma inwertazy występuje zarówno wewnątrzkomórkowo, jak i
w płynach hodowlanych, jednakże tylko przy użyciu niektórych pożywek hodowlanych.
Opracowałam własną, trójetapową metodę oczyszczania obu form enzymu (etap
chromatografii jonowymiennej, chromatografii powinowactwa na samodzielnie
opracowanych nośnikach oraz etap elektroforezy preparatywnej), która pozwoliła oczyścić
obie formy niemal do stanu homogennego. Określiłam dla obu form (forma S i forma F)
parametry biochemiczne takie jak masa cząsteczkowa, punkt izoelektryczny, stała Km,
specyficzność substratowa, optima temperatury i pH. Stwierdziłam ponadto przy pomocy
testów deglikozylacji chemicznej i enzymatycznej, że nietypowa forma F jest formą
pozbawioną domeny węglowodanowej, chroniącej enzymy zewnątrzkomórkowe przed
szkodliwym wpływem środowiska. Test hodowli drożdży w pożywce zawierającej
tunikamycynę (antybiotyk hamujący proces glikozylacji) wykazał, że domena białkowa obu
form (S i F) jest prawdopodobnie identyczna, a różnice polegają na potranslacyjnej
modyfikacji poprzez glikozylację. Immobilizacja obu form na nośnikach stałych i badanie ich
właściwości wykazały, ku mojemu zaskoczeniu, że nietypowa nieglikozylowana forma F jest
ekstremalnie odporna na działanie wysokich temperatur i wykazuje dużą efektywność
katalizowanej przez siebie reakcji rozkładu sacharozy nawet w temperaturach 90-100oC. W
moim odczuciu nietypowa nieglikozylowana forma F inwertazy z Candida utilis może
stanowić ciekawy materiał enzymatyczny o interesujących, także z praktycznego punktu
widzenia, cechach katalitycznych.
Otrzymane wyniki stały się przedmiotem 2 publikacji oraz mojej rozprawy doktorskiej:
Belcarz Anna, Ginalska Grażyna, Łobarzewski Jerzy, Penel Claude: The novel non-glycosylated invertase
from Candida utilis (the properties and the conditions of production and purification). Biochim. Biophys.
Acta 1594 (2002) 40 - 53.
31
Belcarz Anna, Ginalska Grażyna, Łobarzewski Jerzy: Immobilized, thermostable S- and F-forms of the
extracellular invertase from Candida utilis can hydrolyse sucrose up to 100oC. Biotechnol. Letters 24 (23)
(2002) 1993-1998.
Rozprawa doktorska: „Wykrycie, izolacja i określenie właściwości 2 form zewnątrzkomórkowej inwertazy z
Candida utilis”, 2003.
Łączny współczynnik wpływu (IF) moich prac, opublikowanych przed
uzyskaniem stopnia doktora nauk biologicznych, wyniósł 5,219 (punkty
KBN/MNiSW = 44).
Praca naukowa po obronie pracy doktorskiej
Zaraz po obronie mojej pracy doktorskiej zainteresowałam się zastosowaniem grzyba
Bjerkandera adusta R59 do biologicznej degradacji odpadów poprodukcyjnych antybiotyku
daunomycyny. Temat ten, prowadzony w ścisłej współpracy z prof. dr hab. Teresą
Korniłłowicz-Kowalską z Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie, okazał się bardzo
obiecujący ze względu na bardzo wysoki potencjał wymienionego grzyba do degradacji
szkodliwych związków antrachinonowych (odpadów poprodukcyjnych antybiotyków w
postaci odcieku i pulpy) oraz oczyszczania wody z zanieczyszczeń naturalnych (kwasów
huminowych). Do prac nad tym zagadnieniem zachęciło mnie również potencjalne praktyczne
zastosowanie tego szczepu w ochronie środowiska. Mój udział w wymienionych badaniach
obejmował hodowlę szczepu B. adusta R59 na podłożach wzbogaconych w substancje
poddawane biodegradacji bądź stymulatory syntezy enzymów kluczowych w tych szlakach,
ocenę poziomu aktywności enzymów (peroksydazy, lakazy, MnP, endopoligalakturonazy,
celulazy, lipazy, oksydazy glukozowej, mannanazy i ksylanazy), ilości związków
fenolowych, wolnych rodników oraz stopnia dekoloryzacji i degradacji odpadów
poprodukcyjnych daunomycyny i kwasów huminowych. Badania te potwierdziły wysokie
prawdopodobieństwo praktycznego wykorzystania grzyba B. adusta R59 do oczyszczania
wody oraz odpadów poprodukcyjnych daunomycyny oraz złożyły się na cykl 5 prac
oryginalnych opublikowanych w czasopismach lub referatach zjazdowych konferencji
międzynarodowych.
Belcarz Anna, Ginalska Grażyna, Korniłłowicz-Kowalska Teresa: Enzymatic potential of Bjerkandera adusta
R59 strain, capable of decolorization and degradation of daunomycin post-production wastes. Proc.5th
Internat’l Sym. Prod. Biosci., Chungbuk Na. Univ. Cheongju, Korea. 2004, 274 – 286.
Belcarz Anna, Ginalska Grażyna, Korniłłowicz-Kowalska Teresa: Extracellular enzyme activities of
Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Appl. Microb.
Biotechnol. 68 (5) (2005) 686 – 694.
32
Korniłłowicz-Kowalska Teresa, Ginalska Grażyna, Belcarz Anna, Iglik Helena: Microbial conversion of
daunomycin wastes in unsteril soil inoculated with Bjerkandera adusta R59. Appl. Microb. Biotechnol. 70
(4) (2006) 497-504.
Korniłłowicz-Kowalska Teresa, Ginalska Grażyna, Belcarz Anna, Iglik Helena: Decolorization of humic acids
and alkaline lignin derivative by an anamorphic Bjerkandera adusta R59 strain isolated from soil. Polish
Journal of Environmental Studies 17 (2008) 903-909.
Cho Nam-Seok, Belcarz Anna, Ginalska Grażyna, Korniłłowicz-Kowalska Teresa, Cho Hee-Yeon, Ohga Shoji:.
Decolorization and degradation of daunomycin by Bjerkandera adusta R59 strain.. J. Fac. Agric. Kyushu
Univ. 54 (1) (2009) 65-71.
Równolegle postępowało doskonalenie mojego warsztatu technik immobilizacyjnych.
Od roku 2004 współuczestniczyłam w pracach związanych z immobilizacją antybiotyków
aminoglikozydowych na białkowanych protezach naczyniowych prowadzonych w ramach
grantu KBN 3 T09B 052 29 (2006-2008) pt. „Kowalencyjna immobilizacja antybiotyków w
celu uzyskania antybakteryjności protez naczyniowych” kierowanego przez prof. dr hab.
Grażynę Ginalską.
Zainteresowałam się tą tematyką ze względu na potencjalne zastosowanie aplikacyjne
oraz jego związek z ochroną zdrowia pacjentów poddawanych operacji implantacji protez
naczyniowych. Przeprowadzone badania pozwoliły ustalić, że sposób immobilizacji
antybiotyków na protezach naczyniowych (według opatentowanej procedury: PL.201383)
pozwala na trwałe unieruchomienie leku na matrycy za pomocą wiązań głównie
kowalencyjnych, zabezpiecza protezy przed zasiedlaniem przez komórki bakterii
referencyjnych oraz izolowanych klinicznie, zezwala na adhezję i proliferację komórek
endotelialnych, co dobrze rokuje w kontekście zasiedlania tych protez przez komórki
śródbłonka naczyniowego w układzie in vivo. Modyfikowane protezy okazały się również
kompatybilne z ludzkimi fibroblastami. Stwierdzono też, że modyfikowane antybiotykami
protezy naczyniowe nie tylko były zabezpieczone przed adhezją komórek bakterii i
formowaniem się biofilmu bakteryjnego, lecz chroniły swoje otoczenie (medium hodowlane)
przed proliferacją wolnych komórek przez okres minimum 28 dni. Co istotne, testy sugerują
wyraźnie, że protezy modyfikowane antybiotykami w patentowany sposób wykazują znacznie
silniejsze działanie przeciwbakteryjne niż komercyjne protezy naczyniowe InterGardTM Silver
Graft, pokrywane srebrem jako czynnikiem ochronnym. Wykazują one również, w oparciu o
porównawcze dane literaturowe, że badane modyfikowane protezy utrzymują w swojej
strukturze antybiotyk w znacznie stabilniejszy sposób niż handlowe protezy naczyniowe
(Hemashield (USA), DeBakey/Vasculour (USA) i Cardial (UK)) z unieruchomioną
rifampicyną. Wszystkie te wyniki wskazują na znaczny potencjał aplikacyjny osiągniętych
dokonań.
Opisana koncepcja badawcza zyskała dofinansowanie w postaci projektu grantowego
3 T09B 052 29, w którym byłam wykonawcą. W toku badań powstały również 3 artykuły w
postaci oryginalnych prac, których jestem współautorem.
33
Osińska Monika, Ginalska Grażyna, Belcarz Anna: (2004). Antyinfekcyjne właściwości żelatynowanych
protez naczyniowych modyfikowanych gentamycyną/Anti-infection properties of gelatinated vascular
prostheses modified by covalent gentamicin immobilization. Engineering of Biomaterials 38-43 (2004) 97 –
99.
Ginalska Grażyna, Osińska Monika, Uryniak Adam, Urbanik-Sypniewska Teresa, Belcarz Anna, Rzeski
Wojciech, Wolski Andrzej: Antibacterial activity of gentamicin-bonded gelatine-sealed polyterephthalate
ethylene vascular prostheses. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 29 (2005) 419 - 424.
Osińska-Jaroszuk Monika, Ginalska Grażyna, Belcarz Anna, Uryniak Adam: Vascular prostheses with
covalently bound gentamicin and amikacin reveal superior antibacterial properties than silverimpregnated ones - in vitro study. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 38 (2009) 697-706.
Moje zainteresowanie tematyką modyfikacji materiałów wszczepiennych zaowocowało
również współpracą z Katedrą i Kliniką Chirurgii Naczyń i Angiologii Uniwersytetu
Medycznego w Lublinie. We współpracy z m.in. dr Stanisławem Przywarą
przeprowadziliśmy próbę modyfikacji nici szewnych przy pomocy endotelialnego czynnika
wzrostu (VEGF), w celu przyspieszenia regeneracji ściany naczyń uszkadzanych podczas
zabiegu przy użyciu tych nici. Moje zadanie polegało na zmodyfikowaniu nici szewnej
wymienionym czynnikiem wzrostu. Wpływ tych nici został następnie oceniony in vivo w
modelu króliczym z użyciem techniki histopatologicznych i immunohistochemicznych, a
także z użyciem elektronowego mikroskopu transmisyjnego. Stwierdziliśmy, że
modyfikowane VEGF nici szewne wpłynęły korzystnie na przebieg procesu gojenia
uszkodzonej ściany naczyń krwionośnych, nie wykazując przy tym toksyczności biologicznej
ani nietypowych zachowań tkanek w okolicy wszczepu. Badania te zdobyły pierwsze miejsce
w etapie krajowym Konkursu „The Future of Sutures” BBraun Melsungen AG i
zakwalifikowały się do etapu międzynarodowego (grudzień, 2008).
Belcarz Anna, Przywara Stanisław, Wroński Jacek, Ginalska Grażyna, Szumiło Justyna, Korobowicz Elżbieta:
Nanobiomodification of vascular suture with vascular endothelial growth factor (VEGF) - in vivo
preliminary study. Annales UMCS, 22 (4) (2009) 131-138.
Doświadczenia własne związane z pozyskiwaniem enzymów ze źródeł
mikrobiologicznych bądź roślinnych oraz z immobilizacją enzymów zaowocowały
współpracą badawczą w ramach grantu zamawianego PBZ-KBN-098/T09/2003, (2005–2007)
p.t. „Nowa generacja molekularnych warstw przewodzących do zastosowań w analitycznej
diagnostyce medycznej oraz bioelektronice” funkcjonującego jako konsorcjum kilku
zespołów krajowych (Uniwersytet Warszawski, Politechnika Warszawska, PAN w
Warszawie, Lublinie i Olsztynie, Politechnika Wrocławska, Akademia Medyczna w
Katowicach, UMCS w Lublinie) koordynowanego przez Wydział Chemii UW.
Multidyscyplinarny zespół badawczy pracował nad zastosowaniem enzymów do produkcji
sensorów i układów diagnostycznych nowej generacji. Mój udział w tych badaniach dotyczył
wyizolowania peroksydazy z kapusty przy pomocy własnej procedury rozdzielania i
oczyszczania. W wyniku oczyszczenia surowego ekstraktu wyizolowałam postaci tego
enzymu: kationową i anionową, ponadto scharakteryzowałam ich cechy: optymalne substraty,
34
stałą Michaelisa (Km), pH, temperaturę, stabilność względem czasu przechowywania i
temperatury. Ustaliłam, że peroksydaza kationowa wykazuje zdolność do wiązania się z
komponentami ściany komórkowej (takich jak poligalakturonian). Cecha ta pozwoliła
przypuszczać, że osadzenia enzymu na elektrodzie można dokonać za pośrednictwem wiązań
jonowych. Określiłam również widma absorpcyjne frakcji kationowej peroksydazy, uzyskując
charakterystyczne przesunięcie widma w paśmie Soreta pod wpływem H2O2, a następnie
substratu fenolowego, co sugeruje cechy enzymu charakterystyczne dla układów
porfirynowych. Peroksydaza kationowa została następnie immobilizowana na powierzchni
elektrod z nanorurek węglowych za pośrednictwem pochodnej kwasu benzoesowego (dzięki
powstaniu wiązań typu jonowego). Elektroda ta odpowiadała w linearny i powtarzalny sposób
na powtarzające się dawki różnych stężeń nadtlenku wodoru przez minimum 1-tygodniowy
okres pomiaru, w warunkach buforowanych i niebuforowanych. Stwierdziliśmy też, że
jednoczesna immobilizacja peroksydazy (z kapusty lub chrzanu) oraz porfiryn kobaltowych
skutkuje wzmocnieniem sygnału generowanego przez otrzymywane w zakresie własnym
elektrody tlenowe. Wyniki naszych badań jednoznacznie sugerowały, że peroksydaza z
kapusty jest enzymem o ogromnym potencjale aplikacyjnym dla produkcji bioogniw.
Badania te, wykonane w ramach grantu MNiSW PBZ-KBN-098/T09/2003, zostały
opublikowane w poniższych pracach:
Belcarz Anna, Ginalska Grażyna, Kowalewska Barbara, Kulesza Paweł: Peroksydaza z kapusty i jej
zastosowanie w multifunkcjonalnych biosensorach. W: XV Krajowa Konferencja Naukowa : Biocybernetyka
i inżynieria biomedyczna. Wrocław, [12 - 15] września 2007, Wrocław 2007, Kom. Biocybern. Inż. Biomed.
PAN, s. 1-4.
Belcarz Anna, Ginalska Grażyna, Kowalewska Barbara, Kulesza Paweł: Spring cabbage peroxidases –
potential tool in biocatalysis and bioelectrocatalysis. Phytochemistry 69 (2008) 627-636.
Kowalewska Barbara, Skunik Magdalena, Karnicka Katarzyna, Miecznikowski Krzysztof, Chojak Małgorzata,
Ginalska Grażyna, Belcarz Anna, Kulesza Paweł: Enhancement of bio-electrocatalytic oxygen reduction at
the composite film of cobalt porphyrin immobilized within the carbon nanotube-supported peroxidase
enzyme. Electrochimica Acta 53 (2008) 2408-2415.
Kolejne prowadzone przeze mnie badania nawiązywały do wcześniejszych prac
służących ochronie przeciwbakteryjnej powierzchni materiałów implantacyjnych. Tym razem
jednak skupiły się one na modyfikacji 2 typów materiałów kościozastępczych
wykształconych na substratach tytanowych. Pierwszym z nich był stop tytanowy pokryty
warstwą SiO2-TiO2 oraz hydroksyapatytem (współpraca z prof. dr hab. Barbarą Surowską
oraz dr Jarosławem Bieniasiem z Wydziału Inżynierii Materiałowej Politechniki Lubelskiej),
a drugim tytan pokryty warstwą nanorurek z TiO2 oraz nanocząsteczkami srebra i cynku
(współpraca z prof. dr hab. Małgorzatą Lewandowską z Wydziału Inżynierii Materiałowej
Politechniki Warszawskiej oraz dr Agatą Roguska z Instytutu Chemii Fizycznej PAN w
Warszawie). Moje zadanie w obu przypadkach skupiało się na wieloaspektowej ocenie
aktywności przeciwbakteryjnej wykazywanej przez tak zmodyfikowane powierzchnie oraz
zdolności do zapobiegania adhezji i tworzeniu biofilmu przez bakterie mające kontakt z
badanymi powierzchniami. Wyniki, wskazujące na wysoką efektywność przeciwbakteryjną
35
uzyskanych zmodyfikowanych próbek, zostały opublikowane w zacytowanych poniżej
artykułach. Chciałabym jednocześnie zaznaczyć, że moja współpraca z prof. dr hab.
Małgorzatą Lewandowską z Wydziału Inżynierii Materiałowej Politechniki Warszawskiej
oraz dr Agatą Roguską z Instytutu Chemii Fizycznej PAN w Warszawie trwa w dalszym
ciągu i zaowocowała dwiema kolejnymi oryginalnymi pracami, które w chwili obecnej
podlegają recenzji w czasopismach z tzw. Listy Filadelfijskiej. Tematyka tych prac dotyczy
oceny aktywności przeciwbakteryjnej warstw nanorurek TiO2 osadzonych na tytanie i
aktywowanych nanocząsteczkami Ag i ZnO oraz biologicznych właściwości powierzchni
Ti/TiO2 aktywowanych nanocząsteczkami srebra oraz jonami wapniowymi i fosforanowymi.
Ponadto efektem tej współpracy jest złożenie wniosku o dofinansowanie współpracy w
ramach konsorcjum do grudniowej edycji konkursu OPUS 8 w NCN.
Rezultaty badawcze zostały opublikowane w poniższych pracach:
Belcarz Anna, Bieniaś Jarosław, Surowska Barbara, Ginalska Grażyna: Wpływ modyfikacji powierzchni
tytanowych warstwami SiO2-TiO2 na adhezję komórek bakteryjnych. Inżynieria Materiałowa 5 (171)
(2009) 452-454.
Belcarz Anna, Bieniaś Jarosław, Surowska Barbara, Ginalska Grażyna: Adhezja komórek Staphylococcus
epidermidis na powierzchni stopu Ti6Al4V modyfikowanych warstwami bioceramicznymi. Inżynieria
Biomateriałowa 89-91 (2009) 243-245.
Belcarz Anna, Bieniaś Jarosław, Surowska Barbara, Ginalska Grażyna: Studies of bacterial adhesion on TiN,
SiO2-TiO2 and hydroxyapatite thin layers deposited on titanium and Ti6Al4V alloy for medical
applications. Thin Solid Films 519 (2010) 797-803.
Roguska Agata, Belcarz Anna, Piersiak Tomasz, Pisarek Marcin, Ginalska Grażyna, Lewandowska Małgorzata:
Evaluation of the antibacterial activity of Ag-loaded TiO2 nanotubes. European Journal of Inorganic
Chemistry (32) (2012) 5199-5206.
Roguska Agata, Belcarz Anna, Pisarek Marcin, Ginalska Grażyna, Lewandowska Małgorzata: TiO2 nanotube
composite layers as delivery system for ZnO and Ag nanoparticles – An unexpected overdose effect
decreasing their antibacterial efficacy. Materials Science and Engineering C 51 (2015) 158-166.
Łączny współczynnik wpływu (IF) moich prac, opublikowanych po uzyskaniu
stopnia doktora nauk biologicznych (bez uwzględnienia tych złożonych do
oceny w postępowaniu habilitacyjnym), wyniósł 25,102 (punkty KBN/MNiSW
= 309).
Podsumowanie całego dorobku (bez uwzględnienia prac złożonych do oceny w
postępowaniu habilitacyjnym): IF = 30,321 (punkty KBN/MNiSW = 353)
(Pełny wykaz wszystkich prac składających się na mój dorobek naukowy przedstawiono w
Załączniku 6)
36
Podsumowanie
Większość przedstawionych powyżej kierunków badań nawiązuje do głównego nurtu
moich zainteresowań – szeroko rozumianych badań dotyczących cech biologicznych
biomateriałów wszczepiennych oraz ich modyfikacji przy pomocy technik
immobilizacyjnych. Mam nadzieję, że uzyskane wyniki mogą – zwłaszcza w świetle
planowanych badań w interdyscyplinarnych zespołach badawczych – rozszerzyć wiedzę
dotyczącą otrzymywania udoskonalonych materiałów implantacyjnych.
Prowadzone przeze mnie aktualnie badania skupiają głównie się na:
- wieloaspektowej kontynuacji prac związanych z oceną biologiczną bioaktywnego
kompozytu kościozastępczego i jego dalszą modyfikacją;
- kontynuacji badań nad sposobami ograniczenia efektów ubocznych wywieranych przez
materiały kompozytowe oparte na gipsie;
- badaniach nad właściwościami przeciwbakteryjnymi powłok na substratach metalicznych
(we współpracy z Wydziałem Inżynierii Materiałowej Politechniki Warszawskiej oraz
Instytutem Chemii Fizycznej PAN w Warszawie)
- badaniach nad bioaktywnością i właściwościami biologicznymi materiałów
nanoceramicznych dotowanych jonami metali (we współpracy z Instytutem Niskich
Temperatur i Badań Strukturalnych, PAN we Wrocławiu).
37
INFORMACJE O INNYCH FORMACH DZIAŁALNOŚCI NAUKOWOBADAWCZEJ ZWIĄZANEJ Z OSIĄGNIĘCIEM ZGŁOSZONYM DO
POSTĘPOWANIA HABILITACYJNEGO
Współpraca z jednostkami naukowymi, otoczeniem społecznym i
gospodarczym:
W ramach realizacji osiągnięcia zgłaszanego do oceny w postępowaniu habilitacyjnym
współpracowałam z następującymi jednostkami badawczymi (pełny wykaz jednostek
naukowych i gospodarczych, z którymi współpracowałam, zawarto w Załączniku 7 II h, str.
11-13):
1. Katedra Technologii Ceramiki i Materiałów Ogniotrwałych, Wydział Inżynierii
Materiałowej i Ceramiki, AGH Kraków. Okres współpracy: od 2004 do chwili obecnej.
Tematyka współpracy: ocena fizyko-chemiczna ceramicznych materiałów kościozastępczych;
wytwarzanie nowatorskich materiałów kościozastępczych.
2. Katedra i Klinika Chirurgii Zwierząt, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet
Przyrodniczy w Lublinie. Okres współpracy: od 2004 do chwili obecnej. Tematyka
współpracy: ocena biologiczna materiałów kościozastępczych w systemach in vivo: pacjenci
Kliniki i zwierzęta laboratoryjne.
3. Katedra Inżynierii Materiałowej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Lubelska. Okres
współpracy: od 2006 do chwili obecnej. Tematyka współpracy: ocena aktywności
przeciwbakteryjnej metalicznych materiałów implantacyjnych, charakterystyka parametrów
strukturalnych i mechanicznych nowatorskich materiałów kościozastępczych.
4. Katedra i Zakład Chemii Leków, Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w
Lublinie. Okres współpracy: od 2008 do 2009. Tematyka współpracy: oznaczanie ilościowe
metodą HPLC roztworów antybiotyków uwalnianych z modyfikowanych matryc.
5. Zakład Biologii Medycznej, Instytut Medycyny Wsi w Lublinie. Okres współpracy: od
2008 do 2009. Tematyka współpracy: oznaczanie cytotoksyczności biomateriałów.
6. Klinika Ortopedii i Traumatologii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie. Okres współpracy:
od 2008 do 2009. Tematyka współpracy: projektowanie nowoczesnych materiałów
kościozastępczych.
7. Zakład Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie.
Okres współpracy: od 2012 do 2013. Tematyka współpracy: zastosowanie
egzopolisacharydów chelatujących jony wapnia do produkcji nowych kompozytowych
materiałów kościozastępczych.
8. Wydział Fizjologii Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie. Okres współpracy: 0d
2012 do 2014. Tematyka współpracy: ocena densytometryczna, mikroCT i histologiczna
kości króliczych po implantacji kompozytu kościozastępczego.
9. Zakład Hodowli Zwierząt Towarzyszących i Dzikich, Uniwersytet Przyrodniczy w
Lublinie. Okres współpracy: 2014. Tematyka współpracy: ocena RTG kości króliczych po
implantacji kompozytu kościozastępczego.
10. Lubelskie Centrum Małych Zwierząt. Okres współpracy: 2014. Tematyka współpracy:
analiza RTG kości króliczych po implantacji kompozytu kościozastępczego.
38
11. Klinika Ortopedii i Rehabilitacji Dziecięcej Katedry Ortopedii Dziecięcej, Uniwersytet
Medyczny w Lublinie. Okres współpracy: 2014. Tematyka współpracy: implantacja
kompozytu kościozastępczego do kości króli.
12. Instytut Agrofizyki Polskiej Akademii Nauk, Lublin. Okres współpracy: 2014. Tematyka
współpracy: ocena porowatości ceramiki wapniowo-fosforanowej.
Udział w projektach naukowo-badawczych:
uczestniczyłam w poniższych projektach badawczych (pełny wykaz projektów naukowobadawczych z jednostkami naukowymi i gospodarczymi (zagranicznymi i krajowymi), w
których uczestniczyłam, zawarto w Załączniku 7 II a, str. 4-6):
1. Projekt Operacyjny Innowacyjna Gospodarka, Nr wniosku WIND-POIG 01.03.0100-005/09 Projekt badawczy "Nowe wielofunkcyjne substytuty kostne o wysokiej
poręczności chirurgicznej". Konkurs 1/2009 Działanie 1.3. Poddziałanie 1.3.1.
Wykonawca jako członek zespołu konsorcjum. Okres 2010-2013.
2. Grant NCN-5824/B/P01/2011/40 Projekt badawczy „Dwufazowy, sprężysty biomateriał
kościozastępczy „FlexiOss” w badaniach in vivo”. Wykonawca. Okres: 2011-2014.
3. Projekt badawczy DS2/05-07 „Antybakteryjne zabezpieczenie biomateriałów
ortopedycznych poprzez kowalencyjną modyfikację antybiotykami”. Okres: 2005-2007,
wykonawca.
4. Projekt badawczy DS2/11-13 „Badania biokompatybilności nowych biomateriałów
stosowanych w chirurgii implantacyjnej na poziomie genomu i proteomu oraz in vivo”.
Okres: 2011-2013, wykonawca.
5. Projekt badawczy DS2/14-16 „Badania bioaktywności związków chemicznych w
aspekcie działania przeciwdrobnoustrojowego oraz hamowania i kolonizacji
biomateriałów”. Okres: 2014-2016, wykonawca.
6. Projekt badawczy PW1/08-10 „Badania nad mechanizmem adhezji bakteryjnej na
biomateriałach wszczepialnych i sposobami jej zapobiegania”. Okres: 2008-2010,
wykonawca.
7. Projekt badawczy PW1/11-13 „Badania nad mechanizmami tworzenia biofilmu przez
bakterie na biomateriałach wszczepialnych”. Okres: 2011-2013, wykonawca.
Odznaczenia, nagrody i wyróżnienia:
otrzymałam następujące nagrody za działalność naukową (pełny wykaz nagród za
działalność naukową, które otrzymałam, zawarto w Załączniku 7 II n, str.16-17):
Odznaczenia
10 czerwca 2014 - Brązowy Krzyż Zasługi Prezydenta RP numer 245-2014-10 - za
osiągnięcia naukowe.
39
Nagrody i wyróżnienia
8 marzec 2013 - Medal Prezydenta Miasta Lublin Krzysztofa Żuka za zaangażowanie i pracę
na rzecz ochrony zdrowia.
21 listopad 2013 - Złoty medal z wyróżnieniem na Targach Brussels Innova 2013 (Belgian
and International Trade Fair for Technological Innovation) za kompozyt bioaktywny.
21 listopad 2013 - Nagroda Światowej Organizacji Własności Intelektualnej (WIPO) za
najlepszy wynalazek (kompozyt bioaktywny) opracowany przez kobietę-wynalazcę na
Targach Brussels Innova 2013 (Belgian and International Trade Fair for Technological
Innovation).
21 listopad 2013 - Puchar Europejskiej Izby Francuskich Wynalazców, Grand Prix na
Targach Brussels Innova 2013 (Belgian and International Trade Fair for Technological
Innovation) za kompozyt bioaktywny.
11 luty 2014 - Nagroda Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego za projekt pod nazwą
„Kompozyt bioaktywny oraz sposób wytwarzania kompozytu bioaktywnego”.
12 marzec 2014 - Nagroda Renoma Roku 2013, w kategorii Wynalazca, dla członka zespołu
pod kierownictwem prof. Grażyny Ginalskiej za nowatorski kompozyt.
21 października 2014 - Nagroda Naukowa Marii Curie dla zespołu badawczego: prof. dr hab.
Grażyna Ginalska, prof. dr hab. Anna Ślósarczyk, dr Anna Belcarz, mgr inż. Zofia
Paszkiewicz za badania w zakresie: „Hydroksyapatytowo-polimerowy biomateriał
implantacyjny nowej generacji opracowany dla medycyny regeneracyjnej”.
Podsumowanie wszystkich osiągnięć naukowo-badawczych
Autorstwo lub współautorstwo prac naukowych:
Efektem prowadzonych badań są opublikowane prace naukowe w liczbie 41, w tym:
− 19 oryginalnych pełnotekstowych prac w czasopismach z IF
− 1 oryginalna pełnotekstowa praca w suplementach czasopismach z IF
− 1 oryginalna pełnotekstowa praca w czasopiśmie międzynarodowym bez IF
− 9 oryginalnych pełnotekstowych prac w czasopismach krajowych bez IF
− 1 praca przeglądowa
− 1 praca popularno-naukowa
− 6 prac innych
− 2 patenty polskie
− 1 patent międzynarodowy
40
Udział w międzynarodowych i krajowych konferencjach naukowych:
Zaprezentowałam wyniki moich badań w postaci:
−
−
−
12 streszczeń (posterowych i głoszonych) na konferencjach międzynarodowych
17 streszczeń (posterowych i głoszonych) na konferencjach krajowych
8 wystąpień ustnych bez streszczeń na konferencjach międzynarodowych (7) i
krajowych (1)
Pełny wykaz wystąpień konferencyjnych zawarto w Załączniku 7 II d, str. 6-11.
Ocena bibliometryczna:
115
Całkowita liczba cytowań bez autocytowań wg Web of Science:
Całkowita liczba cytowań bez autocytowań wg Scopus:
Indeks Hirscha (wg Web of Science i Scopus)
141
7
i
Sumaryczny impact factor publikacji naukowych wg listy JCR,
zgodnie z rokiem opublikowania:
43,029
Sumaryczna liczba punktów KBN/MNiSW:
514
41
7

Autoreferat - Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Transkrypt

Podobne dokumenty

przewodnik