Badania translacyjne w medycynie regeneracyjnej na przykładzie

Badania translacyjne w medycynie regeneracyjnej
na przykładzie przeszczepiania szpiku
Wiesław Wiktor Jędrzejczak*
Katedra i Klinika Hematologii, Onkologii i
Chorób Wewnętrznych Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w Warszawie
Katedra i Klinika Hematologii, Onkologii
i Chorób Wewnętrznych Warszawskiego
Uniwersytetu Medycznego w Warszawie, ul.
Banacha 1a, 02-097 Warszawa; tel.: (22) 59 92
818, e-mail: [email protected]
*
Artykuł otrzymano 26 marca 2013 r.
Artykuł zaakceptowano 15 kwietnia 2013 r.
Słowa kluczowe: komórki macierzyste, modele zwierzęce, choroba popromienna
Wykaz skrótów: CFU-S (ang. colony forming
unit-spleen) — jednostka tworząca kolonie śledzionowe: jeden z rodzajów krwiotwórczych
komórek macierzystych; GMP (ang. good manufacturing practice) — dobra praktyka wytwarzania; HLA (ang. human leucocyte antigens)
— antygeny zgodności tkankowej; MD (ang.
medical doctor) — lekarz; PhD (ang. philosophy
doctor) — stopień doktora nadawany w Stanach Zjednoczonych w różnych dziedzinach,
w tym w medycynie
Streszczenie
N
auka służy wypracowaniu metod diagnostycznych i leczniczych, które następnie muszą
być w zorganizowany sposób wprowadzone do praktyki. Badania translacyjne służą
właśnie zaadoptowaniu metod opracowanych na różnych modelach zwierzęcych do kliniki
człowieka. Wymaga to z jednej strony uwzględnienia różnic biologicznych między organizmami modelowymi (w przypadku przeszczepiania komórek krwiotwórczych głównie mysz
i pies) a człowiekiem oraz uwzględnienia różnic wielkości (zwykle zwiększenie skali działania). Sposoby, jakie wykorzystano we wdrażaniu metod wypracowanych na zwierzętach metod przeszczepiania komórek krwiotwórczych można z powodzeniem wykorzystać podczas
wprowadzania do praktyki klinicznej innych rodzajów terapii komórkowych.
Wprowadzenie
Badania translacyjne można zdefiniować jako badania naukowe polegające
na przeniesieniu osiągnięć uzyskanych w trakcie badań osobników jednego gatunku na osobniki innych gatunków. Zwykle chodzi tu o przeniesienie wyników
badań doświadczalnych na zwierzętach do człowieka; zaadoptowanie metody
diagnostycznej lub leczniczej wypracowanej na takim modelu do kliniki, ale
oczywiście to odnosi się także do medycyny weterynaryjnej [1,2]. W zależności
od tego, jaka jest pierwotna inspiracja, badania te są wykonywane wahadłowo:
raz zaczyna się od zwierzęcia modelowego do człowieka i usiłuje wdrożyć metodę leczniczą wypracowaną na tym modelu do kliniki, innym razem odwrotnie:
wraca się od człowieka do zwierzęcia modelowego, aby spróbować rozwiązać
problem kliniczny na modelu, który łatwiej badać. Celem w badaniu translacyjnym jest wdrożenie, poprawienie lub zrozumienie metody diagnostycznej lub
leczniczej o praktycznym zastosowaniu. Nie wyklucza to dokonania po drodze
odkrycia, ale nie jest ono celem. Inaczej mówiąc cel jest utylitarny, a nie poznawczy. Inne rozumienie badań translacyjnych to przeniesienie wyników badań naukowych do codziennej praktyki i ono nie jest tematem obecnego artykułu [1]
Podjęcie się wykonywania badań translacyjnych wymaga z jednej strony
szczególnych kwalifikacji od osób w to zaangażowanych, a z drugiej strony
spełnienia całego szeregu warunków prawnych i instytucjonalnych. Niezbędne
kwalifikacje to bardzo dobra znajomość biologii obydwu gatunków: modelowego i docelowego, przy czym oprócz kwalifikacji faktycznych niezbędne są tu
również kwalifikacje formalne, tj. certyfikowane (zgodnie ze stanem prawnym
w danym kraju) uprawnienia takie, jak stopnie naukowe i specjalizacje lekarskie.
W niektórych krajach istnieją specjalne systemy kształcenia takich specjalistów.
Na przykład w Stanach Zjednoczonych jest to tak zwany system MD, PhD (ang.
medical doctor, philosophy doctor), przy czym MD odpowiada w Polsce tytułowi
lekarza, a PhD stopniowi doktora. Kandydaci przyjęci do tego programu są już
absolwentami czteroletnich studiów (tj. college). Pierwotnie zaczynają oni studia lekarskie, ale po pierwszych dwóch latach (studia lekarskie po college trwają
cztery lata) je przerywają i w zakładzie naukowym robią doktorat, a następnie
wracają na następne dwa lata na studia lekarskie i zostają MD. Dla odróżnienia
ich koledzy, którzy zostają „tylko” PhD po college robią bezpośrednio doktorat (PhD) jako tzw. graduate students, czego w Polsce odpowiednikiem są studia
doktoranckie. Z kolei kształcenie MD ogranicza się do czteroletnich studiów
lekarskich po college. Polscy lekarze podejmujący się badań translacyjnych na
ogół nabywają kwalifikacji dotyczących wykorzystywania modeli doświadczalnych już po studiach, często na zagranicznych stażach podoktoralnych.
Na początku kariery „badacza translacyjnego” kluczowy jest wybór organizmu modelowego, a w zależności od zainteresowań i możliwości w grę jako
model człowieka wchodzą tu zwłaszcza: wirusy (zwłaszcza retrowirusy), bakterie (zwłaszcza Escherichia coli), drożdże (Sacchoromyces cerevisiae), pierwotniaki,
198www.postepybiochemii.pl
robaki (zwłaszcza Caenorhabditis elegans), owady (zwłaszcza Drosophila melanogaster), rośliny (zwłaszcza Arabidopsis), ryby (Zebrafish), płazy (zwłaszcza Xenopus levis), ptaki
(zwłaszcza przepiórka), myszy i inne gryzonie, psy i małpy.
Skojarzenia niektórych z tych organizmów z człowiekiem
mogą się wydać zaskakujące, ale np. onkogen SRC odpowiedzialny za powstanie wielu różnych nowotworów u
człowieka został pierwotnie odkryty u retrowirusa (Harald
Varmus, Michael Bishop, Nagroda Nobla w 1989 roku), a
sam retrowirus jako przyczyna białaczki został z kolei odkryty u ptaków (Payton Rous, Nagroda Nobla w 1966 roku).
Z kolei zjawisko apoptozy zostało rozpracowane na modelu
nicienia Caenorhabditis elegans (Sydney Brenner i inni, Nagroda Nobla w 2002 roku). Badania, które legły u podstaw
opracowania indukowanych komórek macierzystych (John
B. Gurdon i Shinya Yamanaka, Nagroda Nobla w 2012
roku) zostały wykonane na żabach Xenopus levis. Przeszczepianie szpiku zostało zaś opracowane dzięki wykorzystaniu dwóch głównych modeli zwierzęcych: myszy (a także w
mniejszym zakresie innych gryzoni) i psa (E. Donnall Thomas, Nagroda Nobla 1990).
Zaletą myszy była (i jest): tania hodowla, najlepiej znana genetyka, modele niemal wszystkich ludzkich chorób.
Wady tego modelu sprowadzały się do tego, że w odróżnieniu od człowieka jest to (w wersji dostępnej do doświadczeń) zwierzę wsobne oraz bardzo duża różnica wielkości.
Dla odmiany nieposiadanie tych właśnie wad to główne
zalety psa, dla którego utrzymania niezbędna jest jednak
bardzo kosztowna infrastruktura, a także hodowla. Istotą
wykorzystania modeli doświadczalnych jest przede wszystkim to, że można je zabić na zakończenie doświadczenia,
aby móc lepiej ocenić wynik ale… tu już też pojawia się
etyka, której znaczenie jest tym większe z im bardziej zbliżonym do człowieka organizmem mamy do czynienia. Doświadczenia na zwierzętach mogą robić tylko ludzie, którzy
lubią zwierzęta. I tylko za zgodą odpowiednich Komisji
Etycznych ds. Badań na Zwierzętach. Najważniejsze to nie
zadawać im cierpień niepotrzebnie (to znaczy wtedy, kiedy inaczej wykonując daną czynność można ich uniknąć)
oraz nie zadawać cierpień niepotrzebnych (to jest takich,
które niczemu nie służą). Kolejną zaletą zwierząt doświadczalnych jest tu krótszy naturalny czas życia, co oznacza,
że wszystkie badane zjawiska biologiczne trwają krócej niż
u człowieka, a więc badający je człowiek w ciągu swojego
życia może obserwować kilka, a nawet kilkadziesiąt „żyć”
zwierząt doświadczalnych.
Dwa główne problemy związane z wykorzystaniem organizmów modelowych to różnice biologiczne pomiędzy
organizmem modelowym a człowiekiem oraz różnice wielkości pomiędzy organizmem modelowym a człowiekiem.
Dla powodzenia działalności w zakresie badań translacyjnych niezbędna jest znajomość tych różnic i wykorzystanie
tej wiedzy podczas planowania doświadczeń zarówno u
ludzi, jak i zwierząt. Wbrew pozorom różnice biologiczne
pomiędzy układami krwiotwórczymi myszy i człowieka
są zastanawiająco małe. Przede wszystkim śledziona przez
całe życie jest nie tylko narządem odpornościowym, ale
także krwiotwórczym. Nie ma także szpiku żółtego. Myszy
mają ponadto np. dwukrotnie większą liczbę odpowiednio
mniejszych krwinek czerwonych i płytkowych w mikroliPostępy Biochemii 59 (2) 2013
trze. Różnice są na tyle małe, że ludzki szpik przeszczepiony myszy będzie u niej wytwarzał krwinki, jeśli nie zostanie
odrzucony przez układ odpornościowy [3].
Co decyduje o powodzeniu
przeszczepienia szpiku?
Badania zmierzające do odpowiedzi na to pytanie
doprowadziły do sformułowania koncepcji komórek
macierzystych, określenia ich definicji, praktycznego
wykorzystania w hematologii oraz w innych dziedzinach medycyny. Historycznie punktem zwrotnym były
wybuchy bomb jądrowych w Hiroshimie i Nagasaki i
skonfrontowanie medycyny z nową jednostką chorobową: ostrą chorobą popromienną. Analiza ofiar tych bomb
i ofiar wypadków radiacyjnych doprowadziła do ustalenia, że zależnie od otrzymanej dawki promieniowania
jonizującego występują u nich trzy główne zespoły objawów: tzw. hematologiczny, w którym dominują objawy
uszkodzenia układu krwiotwórczego (dawka do około
1000 cGy), jelitowy, w którym dominują objawy uszkodzenia przewodu pokarmowego (dawka do około 5000
cGy) oraz neurologiczny, w którym dominują objawy
uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego (dawka
powyżej 5000 cGy) [4]. Dwa ostatnie zespoły chorobowe
były bezwarunkowo śmiertelne i w związku z tym uwaga została skoncentrowana na zespole hematologicznym.
Dwa amerykańskie zespoły: jeden w Chicago kierowany
przez Leona Jacobsona [5], a drugi w Betesda pod Waszyngtonem kierowany przez Egona Lorenza we właśnie
utworzonych Narodowych Instytutach Zdrowia [6] odkryły, że śmiertelnie napromienionym zwierzętom, które
otrzymały dawkę około 1000 cGy można uratować życie
albo osłaniając w trakcie napromieniania śledzionę albo
przeszczepiając szpik. Na tym etapie nie było wiadomo,
czy efekt ten ma charakter komórkowy, tzn. że odbywa
się to dzięki dostarczeniu lub ochronieniu komórek odpowiedzialnych za regenerację, czy też humoralny polegający na dostarczeniu lub ochronieniu źródeł substancji
(hormonów) przyspieszających taką regenerację. Odkrycie anomalii chromosomowej T6 u myszy [7] dostarczyło
znacznika genetycznego, dzięki któremu udowodniono,
że za obserwowane zjawisko odpowiadają komórki.
Z kolei również pracujący w Stanach Zjednoczonych
George Brecher zauważył, że podczas regeneracji myszy
napromienionych dawką około połowę mniejszą na powierzchni śledzion tworzą się białawe guzki złożone z
komórek krwiotwórczych: erytroblastów, mieloblastów
i megakarioblastów [8]. Rozpracowanie tego zjawiska
przez Jamesa Tilla i Ernesta McCullocha [9-11] stworzyło podstawy wiedzy o komórkach macierzystych. Badacze ci najpierw wprowadzili nazwę kolonii śledzionowej
(ang. spleen colony) dla takiego pojedynczego guzka, a dla
komórek wyjściowych dla niego wprowadzili nazwę jednostki tworzącej kolonie śledzionowe (CFU-S, ang. spleen
colony forming unit) i stwierdzili, że liczba CFU-S przeżywających napromienienie jest odwrotnie proporcjonalna
do dawki promieniowania, a przy dawce 1000 cGy jest
zerowa i dawka ta jest śmiertelna. Jednakże, jeśli zwierzętom napromienionym tą dawką wstrzyknąć dożylnie
szpik myszy napromienionych to najpierw na powierzch-
199
ni ich śledzion pojawią się kolonie śledzionowe, a następnie dojdzie do pełnej regeneracji krwiotworzenia i myszy
przeżyją.
Następnie zadano kluczowe pytania: ile komórek wyjściowych potrzeba, aby wytworzyć pojedynczą kolonię śledzionową, czyli ile komórek tworzy jedną CFU-S? Okazało
się, że jedna, czyli, że każda kolonia śledzionowa jest klonem komórkowym powstałym z jednej komórki wyjściowej. Kolejne kluczowe pytanie brzmiało: czy wśród potomstwa pojedynczej CFU-S znajdują się kolejne CFU-S? W tym
celu wycinano ze śledzion pojedyncze kolonie śledzionowe
i ich zawartość podawano dożylnie śmiertelnie napromienionym myszom. Okazało się, że rzeczywiście takie zjawisko ma miejsce. Odpowiedzi na te pytania pozwoliły po raz
pierwszy zdefiniować komórkę macierzystą jako komórkę
posiadającą następujące cechy [12]:
— zdolność do samoodnawiania, czyli zdolność do wytwarzania następnych komórek macierzystych (CFU-S była
zdolna wytworzyć następne CFU-S);
— zdolność różnicowania się w te wszystkie rodzaje komórek, dla których jest ona macierzysta (CFU-S była zdolna
wytworzyć erytroblasty, mieloblasty i megakarioblasty);
— zdolność do wytworzenia wystarczającej liczby komórek, aby pokryć straty związane z ich zużywaniem oraz
umożliwić regenerację po urazie (pojedyncza kolonia śledzionowa była złożona z około miliona komórek, ale zakładano, że wtórne kolonie powstałe z komórek powstałych w
koloniach pierwotnych przekształcają tę liczbę w setki milionów niezbędne dla regeneracji układu krwiotwórczego
myszy).
Odpowiedzi te następnie zostały zuniwersalizowane,
tzn. rozszerzone na wszystkie rodzaje komórek macierzystych, w tym na komórki rozrodcze, gdzie zygota jest swoistą komórką macierzystą organizmu.
Co ciekawe, jak się później okazało CFU-S nie były
krwiotwórczymi komórkami macierzystymi. Tutaj kluczowe było opracowanie przez Elizabeth Russell modelu
myszy [13], którym można z powodzeniem przeszczepiać
szpik bez żadnego napromienienia. Były to myszy W/Wv,
o których dzisiaj wiemy, że mają defekt genu receptora c-kit [14]. McCulloch i Till udowodnili, że u tych myszy po
podaniu szpiku od ich zdrowego rodzeństwa bez napromienienia tworzą się kolonie śledzionowe [15]. Z kolei
Abramson i wsp [16] stwierdzili, że układ krwiotwórczy
tych myszy może zostać zastąpiony przez potomstwo
jednej komórki macierzystej. To stworzyło możliwość
uzyskania odpowiedzi na fundamentalne pytania: (1):
czy rzeczywiście komórki tworzące kolonie śledzionowe
są tymi komórkami, które ostatecznie odtwarzają układ
krwiotwórczy? i (2) z jaką częstością występują w szpiku
te komórki, które ten układ mogą odtworzyć? Pomysł jak
na nie odpowiedzieć polegał na przeszczepianiu grupom
myszy W/Wv coraz mniejszych liczb komórek szpiku po
to, aby określić granicę, poniżej której nie u wszystkich
myszy dojdzie do ustanowienia krwiotworzenia. Tam,
gdzie do tego dojdzie, wśród różnych komórek musiała
być chociaż jedna komórka macierzysta, a tam, gdzie do
tego nie dojdzie, jej po prostu nie było. Było to więc po-
dejście do badania krwiotwórczych komórek macierzystych metodą rozcieńczeń granicznych.
Okazało się [17,18], że komórki zdolne pojedynczo odtworzyć układ krwiotwórczy występują w szpiku z częstością 1 na około 25000 komórek szpiku i około 10 razy rzadziej niż komórki tworzące kolonie śledzionowe.
O ile wykorzystanie myszy pozwoliło poznać biologię
krwiotwórczych komórek macierzystych, w tym określić
niektóre mechanizmy regulacyjne [19], to przez pewien
czas nie było pomocne w zrozumieniu podstawowego
problemu przeszczepiania szpiku u człowieka, czyli tzw.
choroby wtórnej [20], obecnie określanej nazwą choroby
przeszczep przeciwko gospodarzowi [21]. Okazało się, że
u człowieka przy wykorzystaniu przypadkowego dawcy
po pierwotnym powodzeniu przeszczepu rozwija się ciężki zespół objawów złożony ze zmian skórnych, biegunki i
żółtaczki, który prowadzi do śmierci. Szybko stwierdzono,
że jest to spowodowane reakcją odpornościową komórek
dawcy przeszczepu na antygeny tkankowe biorcy. Reakcja ta nie występowała przy przeszczepach u myszy z tego
samego szczepu wsobnego, ale człowiek (poza bliźniętami
jednojajowymi) nie dysponuje innym wsobnym dawcą. Tu
pomocny okazał się pies kundel, który do badań był wykorzystywany przez E. Donnell Thomasa (Nagroda Nobla za
opracowanie metod przeszczepiania szpiku w roku 1990).
Okazało się, że jeśli jako dawcę wykorzystywać psa potomka tej samej pary rodziców, to w co czwartym przypadku
choroba wtórna nie występuje lub ma łagodny przebieg.
Zbiegło to się z odkryciem antygenów HLA (Jean Dausset,
Nagroda Nobla w roku 1980), co umożliwiło potwierdzenie,
że podobne zjawisko ma miejsce u ludzi, a co więcej, że badając antygeny HLA można wytypować, kto z rodzeństwa
odziedziczył te same cechy HLA od obojga rodziców i tym
samym może być dawcą szpiku.
Podobnie, mysz nie była przydatna do opracowania metody napromieniania człowieka na całe ciało. Jednakże, to
u myszy po raz pierwszy Barnes i Loutit [22] stwierdzili, że
możliwe jest wyleczenie białaczki po napromienieniu całego ciała i przeszczepieniu szpiku. Ze względu na rozmiary
mysz jest bardzo łatwo napromienić — wystarczy wstawić
ją w pudełku na kilka minut w pobliże źródła promieniowania. Napromienienie na całe ciało człowieka (poza oczywiście sytuacją wybuchu jądrowego) przy użyciu klinicznie
wykorzystywanych urządzeń do napromieniania jest dużym wyzwaniem fizycznym, które rodzi nieprzewidziane
problemy wynikające np. z wielkości bunkra, w którym
znajduje się aparat do napromienienia. Jeśli bunkier jest
zbyt mały to osoby napromienianej nie można odsunąć od
źródła napromienienia na wystarczającą odległość, aby całe
ciało było objęte wiązką promieniowania. Ponadto jest problem jednorodności rozkładu dawki w polu. Te problemy
również rozwiązał Thomas wykorzystując psa [23, 24].
Jak wdrażano na świecie
przeszczepianie szpiku?
W rzeczywistości rozwój metody przeszczepiania szpiku w klinice odbywał się równolegle, a nie sekwencyjnie
do rozwoju wiedzy o biologii komórek macierzystych —
200www.postepybiochemii.pl
właśnie dokładnie wahadłowo. Zanim odpowiem na postawione pytanie przypomnę, że milowe kroki sprowadzały
się tu do opracowania na początku lat 50-tych XX wieku
przez Thomasa metody napromieniania ludzi na całe ciało
[23,24], metody pobierania szpiku i jego przechowywania
w zamrożeniu [25]. W latach 1956–1959 Thomas wykonał
pierwsze przeszczepienia po napromienieniu całego ciała u
dzieci z ostrą białaczką od dawców bliźniaków jednojajowych, które po pierwotnym przyjęciu przeszczepu zakończyły się nawrotem białaczki i zgonem chorych [23,26]. W
tym samym czasie we Francji podobne próby podjął Georges Mathe, który wykonał przeszczepienie szpiku od innej
osoby, które chory przeżył [27]. Metoda pobierania szpiku
została udoskonalona w 1970 roku przez Thomasa i Storba [28], ale nie ten zespół wykonał pierwsze udane przeszczepienia alogeniczne u ludzi. Jak wspomniano, najpierw
w 1962 roku Jean Dausset we Francji i niezależnie Jon Van
Rood w Holandii [30] odkryli antygeny HLA [29], a później
wypracowano metody doboru dawców i biorców w tym
układzie. W 1968 roku trzy zespoły: Roberta A. Gooda [31],
Fritza Bacha [32] i Dirka Van Bekkuma [33] wykonały takie
zabiegi u dzieci z niedoborami odporności. Szpik pochodził
w każdym przypadku od rodzeństwa, które było zgodne w
HLA. Pierwsze przeszczepienie od dawcy częściowo zgodnego w HLA wykonał Thomas w 1969 roku, ale chory zmarł
w 52 dniu po zabiegu z powodu albo infekcji albo choroby przeszczep przeciw gospodarzowi [34]. Był to chory w
kryzie blastycznej przewlekłej białaczki szpikowej. Spośród
kolejnych 7 chorych dłuższe przeżycie uzyskano u jednego
chorego [35,36]. W tym czasie George W. Santos najpierw w
badaniach na myszach dowodzi korzystnej roli cyklofosfamidu dla wszczepienia szpiku, a następnie wprowadza to
do kliniki człowieka [37,38]. Okazuje się, że aby wyleczyć
białaczkę u człowieka trzeba do napromienienia na całe ciało dodać cytostatyk — cyklofosfamid w megadawkach.
W1977 roku Thomas i współpracownicy opublikowali w
czasopiśmie Blood wyniki leczenia pierwszych 100 chorych
na ostre białaczki, którzy otrzymali przeszczep szpiku po
napromienieniu całego ciała i podaniu cyklofosfamidu [39].
Ponad rok przeżyło 13 chorych. Stopniowo przeszczepienie szpiku jest wprowadzane do leczenia nowych chorób,
a nadto dopracowywana jest technika zmniejszając śmiertelność. Przeszczepianie szpiku staje się metodą z wyboru
w leczeniu licznych nowotworowych i nienowotworowych
chorób krwi wprowadzając w nich nową wcześniej nieosiągalną kategorię skutku leczenia: wyleczenie [40]. W 1982
roku George W. Santos skutecznie zastępuje napromienienie całego ciała podaniem innego cytostatyku busulfanu w
megadawkach [41]. Ta ostatnia metoda do dzisiaj pozostaje
podstawową, ale napromienienie całego ciała nadal pozostaje w użyciu, zwłaszcza w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej.
Jak przystąpić do podejmowania prób
klinicznych metody leczniczej wcześniej
opracowanej na zwierzętach?
Po pierwsze, trzeba mieć dowody „słuszności zasady”
(ang. proof of principle), czyli dowody z doświadczeń na
zwierzętach, że dane zjawisko rzeczywiście zachodzi. Po
drugie, musi istnieć dokładnie opisany plan doświadczePostępy Biochemii 59 (2) 2013
nia i sposób wybierania ludzi do tego doświadczenia. Po
trzecie, lekarze wykonujący doświadczenie muszą mieć
odpowiednie kwalifikacje. Po czwarte, musi być spełniona
zasada, że potencjalne korzyści dla osoby uczestniczącej w
doświadczeniu przewyższają ryzyko z nim związane. Po
piąte, musi to wszystko pozytywnie zaopiniować niezależne gremium (Komisja Bioetyczna). Po szóste, osoba poddawana doświadczeniu musi wyrazić na to zgodę po pełnym
poinformowaniu jej zarówno o ryzyku, jak i ewentualnych
korzyściach wynikających z doświadczenia i znajdując się
w sytuacji zdolności do wyrażenia wolnej i nieskrępowanej
zgody (np. nie może być więźniem).
Dla zobrazowania sposobu rozwiązania tych problemów
krótko opiszę, jak doprowadzono do wykonania pierwszego przeszczepiania szpiku w Polsce. Pierwsze przygotowania zaczęły się w latach 1974–1977 od opracowania metod
prowadzenia chorych z uszkodzonym układem krwiotwórczym, w tym opanowywania powikłań związanych z takim
uszkodzeniem [42-44]. Badania te wykonywano wykorzystując uszkodzenie układu krwiotwórczego powstałe w
trakcie leczenia nowotworów złośliwych dużymi dawkami
cytostatyków [45]. Największym problemem było jednak
zorganizowanie od podstaw zaplecza laboratoryjnego z
własną hodowlą myszy, co udało się zrobić w roku 1980.
Następnie, kontynuując badania kliniczne rozpoczęto testowanie poszczególnych elementów przeszczepiania na myszach i wreszcie adaptację opracowanych metod z myszy
na człowieka. Tutaj podstawowym problemem była różnica
skali: przeszczepienie szpiku u myszy to 1-10 mln komórek
w 0,5 ml, a przeszczepienie szpiku u człowieka to 100-400
mln komórek na kg (czyli dla dorosłego 8-32 mld komórek)
w 500–1000 ml.
Warto zaznaczyć, że nikt z zespołu wdrażającego tę metodę nigdy zabiegu przeszczepienia szpiku u człowieka nie
widział, ani (ze względu na stan wojenny) nie mógł wyjechać go zobaczyć. Posługiwano się dostępnymi publikacjami, z tym, że np. konieczne było opracowanie własnej metody pobierania szpiku (tzw. zamkniętej [46], w odróżnieniu
od metody otwartej Thomasa i Storba), w tym konstrukcja
własnych igieł do pobierania szpiku itp. Wreszcie na początku 1984 roku uzyskano zgodę Komisji ds. Eksperymentów na Ludziach Rady Naukowej Centralnego Szpitala Klinicznego Wojskowej Akademii Medycznej w Warszawie.
Ostatecznie pierwszy zabieg został wykonany w 1984 roku
u chorej z rzadką, genetycznie uwarunkowaną chorobą
anemią Diamonda-Blackfana po uzyskaniu zgody obojga
rodziców (chora miała wtedy 6 lat). Był to drugi zabieg w
tej chorobie na świecie i pierwszy udany [47]. W przygotowaniu do przeszczepienia podano polski busulfan (nigdy
wcześniej niewykorzystywany do tego celu) w megadawkach oraz cyklofosfamid [48].
Najnowsze wykorzystanie badań
translacyjnych do zastosowania
przeszczepiania komórek
krwiotwórczych w nowym wskazaniu
Najnowszym przykładem zastosowania strategii badań
translacyjnych jest podjęcie prób leczenia cukrzycy typu 1
za pomocą zresetowania układu odpornościowego. Kon-
201
cepcja tego leczenia bierze się stąd, że u myszy NOD (non-obese, diabetic), u których rozwija się choroba zbliżona do
cukrzycy typu 1 możliwe jest wyleczenie (a ściślej zapobieżenie rozwojowi cukrzycy) za pomocą immunoablacji i
przeszczepienia szpiku [49].
U człowieka nie wiemy z wyprzedzeniem u kogo rozwinie się cukrzyca typu 1, ale w chwili rozpoznania nie
wszystkie komórki beta są zniszczone. Gdyby udało się w
tym momencie zablokować dalsze ich niszczenie, to być
może pozostałe komórki beta wytwarzałyby wystarczającą
ilość insuliny, aby chorego uniezależnić od insuliny egzogennej. U człowieka w większości przypadków nie dysponujemy zdrowym bliźniakiem jednojajowym, którego komórki mogłyby zostać wykorzystane do przeszczepienia,
ale wiemy, że ta sama choroba z autoagresji rozwija się tylko u około 20% bliźniąt jednojajowych [50], co oznacza, że
taki jest wpływ czynników genetycznych na jej powstanie.
To oznacza, że wystąpienie chorób tego typu (w tym cukrzycy typu 1) w 80 % jest zależne od bliżej nieokreślonego
zewnętrznego zdarzenia, które wystąpiło już po urodzeniu.
Gdyby w tej sytuacji zniszczyć dotychczasowy układ odpornościowy chorego to zniszczyłoby się jednocześnie klon
(klony) autoreaktywny, który powoduje chorobę. Ponieważ
chory nie może żyć bez układu odpornościowego, to przeszczepienie jego własnych, wcześniej pobranych komórek
macierzystych powinno umożliwić jego ponowne wytworzenie, przy czym istnieje około 80% szansa, że w tak wytworzonym układzie odpornościowym nie zostanie odtworzony klon chorobotwórczy.
W oparciu o tak sformułowaną hipotezę Voltarelli i wsp.
rozpoczęli w 2003 roku pierwsze próby wykorzystania
przeszczepiania własnych komórek krwiotwórczych po
kondycjonowaniu immunoablacyjnym w leczeniu cukrzycy typu I. Pierwsza publikacja [51] obejmowała wyniki leczenia 15 pacjentów, z których 14 uzyskało przynajmniej
przejściową niezależność od insuliny. Nowsze dane tej
grupy (informacja własna) obejmują 19 pacjentów, spośród
których 14 pozostaje niezależnych od insuliny przez od 0,5
do 44 miesięcy, 4 było przejściowo niezależnych od insuliny
(przez 7 do 12 miesięcy) a losy jednego są nieznane. Ta publikacja zwróciła naszą uwagę i został przygotowany protokół badawczy, w oparciu o który wystąpiliśmy o zgodę
do Komisji Bioetycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego na rozpoczęcie wykonywania tych zabiegów u
polskich pacjentów z cukrzycą typu I. Zgodę otrzymaliśmy
w styczniu 2008 roku i zwróciliśmy się do kilku ośrodków
diabetologicznych z propozycją współpracy polegającej z
jednej strony na zidentyfikowaniu odpowiednich pacjentów, a z drugiej na fachowym monitorowaniu ich choroby
po przeszczepieniu. Pierwszy pacjent spełniający kryteria
włączenia został zidentyfikowany w kwietniu 2008 i został
poddany przeszczepieniu 6 maja 2008 według protokołu
wzbogaconego (w stosunku do protokołu Voltarellego) o
zabiegi plazmaferezy zmierzające do ochronienia jak największej liczby komórek β przed zniszczeniem, zanim zostanie wykonany zabieg przeszczepienia [52].
W końcu czerwca 2008 (osiem tygodni po zabiegu) u pacjenta odstawiono zewnątrzpochodną insulinę, przy czym
zapotrzebowanie na nią zmniejszało się począwszy od procedury mobilizacji i w miarę kolejnych plazmaferez. Pacjent
nadal (marzec 2013) nie wymaga insuliny, ma normalne stężenie peptydu C oraz glikozylowanej hemoglobiny. Wyniki
leczenia pierwszych ośmiu chorych zostały opublikowane
[53]. Czternastu dalszych pacjentów zostało poddanych podobnym zabiegom. Jedenastu uzyskało niezależność od egzogennej insuliny. Pozostali wymagają niewielkich dawek
w czasie posiłku. Jedenastu innym chorym zaproponowano
to leczenie, ale nie wyrazili zgody. Wszyscy wymagają podawania insuliny, żaden nie uzyskał samoistnej remisji.
Prawne uwarunkowania badań
translacyjnych w dziedzinie medycyny
regeneracyjnej w Polsce
Pod względem prawnym w Polsce zgodnie z zapisami
Dyrektywy Unii Europejskiej nr EC 23/2004 [54] wprowadzonych do Ustawy o pobieraniu, przechowywaniu i
przeszczepianiu komórek, tkanek i narządów dla rozpoczęcia praktycznych działań polegających na przeszczepianiu komórek dowolnego rodzaju u człowieka niezbędne jest spełnienie warunków dotyczących zarówno
kwalifikacji personelu, jak i instytucji [55]. Lekarze bezpośrednio wykonujący zabiegi powinni posiadać specjalizację z transplantologii klinicznej oprócz swojej podstawowej specjalności, którą w przypadku przeszczepiania
komórek krwiotwórczych u osób dorosłych jest specjalizacja z hematologii, a w przypadku dzieci specjalizacja z
onkologii i hematologii dziecięcej. Personel laboratoryjny
powinien legitymować się stażem pracy w odpowiednim laboratorium, ale wskazane jest również posiadanie specjalizacji z laboratoryjnej hematologii medycznej.
Niezbędne jest dysponowanie akredytowanym bankiem
komórek posiadającym pozwolenie Ministra Zdrowia
na działalność w odniesieniu do określonego rodzaju
komórek i podobnie akredytowanym ośrodkiem transplantacyjnym również posiadającym pozwolenie Ministra Zdrowia. Wyjątkiem od tego są zabiegi, w których
w trakcie jednej procedury komórki są pobierane i podawane tej samej osobie. Natomiast wtedy, kiedy przedmiotem transplantacji mają być komórki przetworzone, a
więc np. hodowane, wtedy niezbędne jest dysponowanie
warunkami dobrej praktyki wytwórczej, czyli GMP. W
Polsce za akredytację banków komórek odpowiada Krajowe Centrum Bankowania Tkanek i Komórek, a za akredytację ośrodków transplantacyjnych Krajowe Centrum
ds. Transplantacji „Poltransplant”, odpowiedni konsultanci krajowi oraz Krajowa Rada Transplantacyjna.
Piśmiennictwo
1. Rubio DM, Schoenbaum EE, Lee LS, Schteingart DE, Marantz PR, Anderson KE, Platt LD, Baez A, Esposito K (2010) Defining translational
research: implications for training. Acad Med 85: 470-475
2. Wu J (2013) Insights into complex diseases through translational research. J Mol Cell Biol 5: 71-72
3. Dick JE (1996) Human stem cell assays in immune-deficient mice. Curr
Opin Hematol 3: 405-409
4. Wald N, Thoma GE Jr (1961) Radiation accidents: medical aspects of
neutron and gamma-ray exposures. ORNL PtB: 1-177
5. Jacobson LO, Simmons EL, Bethard WF (1950) Studies on hematopoietic recovery from radiation injury. J Clin Invest 29: 825
202www.postepybiochemii.pl
6. Lorenz E, Uphoff D, Reid TR, Shelton E (1951) Modification of irradiation injury in mice and guinea pigs by bone marrow injections. J Natl
Cancer Inst 1: 197-201
29.Dausset J (1958) Iso-leuco-anticorps. Acta Haematol 20: 156-166
7. Ford CE, Hamerton JL, Barnes DW, Loutit JF (1956) Cytological identification of radiation-chimaeras. Nature 177: 452-454
31.Gatti RA, Meuwissen HJ, Allen HD, Hong R, Good RA (1968) Immunological reconstitution of sex-linked lymphopenic immunological
deficiency. Lancet 2: 1366-1369
8. Brecher G, Endicott KM, et al. (1948) Effects of X-ray on lymphoid and
hemopoietic tissues of albino mice. Blood 3: 1259-1274
9. Till JE, McCulloch EA (1961) A direct measurement of the radiation
sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res 14: 213-222
10.McCulloch EA, Till JE (1960) The radiation sensitivity of normal mouse
bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat Res 13: 115-125
11.Wu AM, Till JE, Siminovitch L, McCulloch EA (1967) A cytological
study of the capacity for differentiation of normal hemopoietic colonyforming cells. J Cell Physiol 69: 177-184
12.Till JE, McCulloch EA, Siminovitch L (1964) A stochastic model of
stem cell proliferation, based on the growth of spleen colony-forming
cells. Proc Natl Acad Sci USA 51: 29-36
13.Russell ES (1949) Analysis of pleiotropism at the W-locus in the mouse;
relationship between the effects of W and Wv substitution on hair pigmentation and on erythrocytes. Genetics 34: 708-723
14.Chabot B, Stephenson DA, Chapman VM, Besmer P, Bernstein A
(1988) The proto-oncogene c-kit encoding a transmembrane tyrosine
kinase receptor maps to the mouse W locus. Nature 335: 88-89
15.McCulloch EA, Siminovitch L, Till JE (1964) Spleen colony formation
in anemic mice of genotype W/W. Science. 144: 844-846
16.Abramson S, Miller RG, Phillips RA (1977) The identification in adult
bone marrow of pluripotent and restricted stem cells of the myeloid
and lymphoid systems. J Exp Med 145: 1567-1579
17.Wiktor-Jedrzejczak W, Szczylik C, Górnaś P, Sharkis SJ, Ahmed A
(1979) Different marrow cell number requirements for the haemopoietic colony formation and the cure of the W/Wv anemia. Experientia
35: 546-547
18.Boggs DR, Boggs SS, Saxe DF, Gress LA, Canfield DR (1982) Hematopoietic stem cells with high proliferative potential. Assay of their concentration in marrow by the frequency and duration of cure of W/Wv
mice. J Clin Invest 70: 242-253
19.Wiktor-Jedrzejczak W, Sharkis S, Ahmed A, Sell KW, Santos GW
(1977) Theta-sensitive cell and erythropoiesis: identification of a defect
in W/Wv anemic mice. Science 196: 313-315
20.Chomette G, Mathe G, Auriol M, Brocheriou C, Pinaudeau Y (1970)
Secondary disease in man. Anatomical study on six cases of leukemia
treated with allogenic bone marrow grafts following total-body irradiation. Virchows Arch A Pathol Pathol Anat 349: 98-114
21.Sung AD, Chao NJ (2013) Concise review: acute graft-versus-host disease: immunobiology, prevention, and treatment. Stem Cells Transl
Med 2: 25-32
22.Barnes DW, Loutit JF (1957) Treatment of murine leukaemia with xrays and homologous bone marrow. II. Br J Haematol 3: 241-252
23.Thomas ED, Lochte HL Jr, Cannon JH, Sahler OD, Ferrebee JW (1959)
Supralethal whole body irradiation and isologous marrow transplantation in man. J Clin Invest 38: 1709-1716
24.Thomas ED (1964) Observations on supralethal whole-body irradiation and marrow transplantation in man and dog. Ann N Y Acad Sci
114: 393-402
25.Thomas ED, Ferrebee JW (1962) Prolonged storage of marrow and its
use in the treatment of radiation injury. Transfusion 2: 115-117
26.Thomas ED, Lochte HL Jr, Lu WC, Ferrebee JW (1957) Intravenous
infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med 257: 491-496
27.Mathe G, Amiel JL, Schwarzenberg G L, Cattan A, Schneider M (1963)
Haematopoietic chimera after allogeneic (homologous) bone-marrow
transplantation. (Control of the secondary syndrome. Specific tolerance due to chimerism). Br Med J 2: 1633-1635
28.Thomas ED, Storb R (1970) Technique for human marrow grafting.
Blood. 36: 507-15
Postępy Biochemii 59 (2) 2013
30.VanRood JJ, Eernisse JG, VanLeeuwen A (1958) Leucocyte antibodies
in sera of pregnant women. Nature 181: 1735-1736
32.Bach FH, Albertini RJ, Joo P, Anderson JL, Bortin MM (1968) Bonemarrow transplantation in a patient with the Wiskott-Aldrich syndrome. Lancet 2: 1364-1366
33.De Koning J, Van Bekkum DW, Dicke KA, Dooren LJ, Rádl J, Van
Rood JJ (1969) Transplantation of bone-marrow cells and fetal thymus
in an infant with lymphopenic immunological deficiency. Lancet 1:
1223-1227
34.Buckner CD, Epstein RB, Rudolph RH, Clift RA, Storb R, Thomas ED
(1970) Allogeneic marrow engraftment following whole body irradiation in a patient with leukemia. Blood 35: 741-750
35.Storb R, Rudolph RH, Thomas ED (1971) Marrow grafts between canine siblings matched by serotyping and mixed leukocyte culture. J
Clin Invest 50: 1272-1275
36.Thomas ED, Buckner CD, Rudolph RH, Fefer A, Storb R, Neiman
PE, Bryant JI, Chard RL, Clift RA, Epstein RB, Fialkow PJ, Funk DD,
Giblett ER, Lerner KG, Reynolds FA, Slichter S. (1971) Allogeneic marrow grafting for hematologic malignancy using HL-A matched donorrecipient sibling pairs. Blood 38: 267-287
37.Santos GW, Owens AH Jr (1969) Allogeneic marrow transplants in cyclophosphamide treated mice. Transplant Proc 1: 44-46
38.Santos GW, Sensenbrenner LL, Burke PJ, Colvin M, Owens AH Jr, Bias
WB, Slavin RE (1971) Marrow transplantation in man following cyclophosphamide. Transplant Proc 3: 400-404
39.Thomas ED, Buckner CD, Banaji M, Clift RA, Fefer A, Flournoy N,
Goodell BW, Hickman RO, Lerner KG, Neiman PE, Sale GE, Sanders JE, Singer J, Stevens M, Storb R, Weiden PL (1977) One hundred
patients with acute leukemia treated by chemotherapy, total body irradiation, and allogeneic marrow transplantation. Blood 49: 511-533
40.Thomas ED, Storb R, Clift RA, Fefer A, Johnson L, Neiman PE, Lerner
KG, Glucksberg H, Buckner CD (1975) Bone-marrow transplantation
(second of two parts). N Engl J Med 292: 895-902
41.Santos GW, Tutschka PJ, Brookmeyer R, Saral R, Beschorner WE, Bias
WB, Braine HG, Burns WH, Elfenbein GJ, Kaizer H, et al. (1983) Marrow transplantation for acute nonlymphocytic leukemia after treatment with busulfan and cyclophosphamide. N Engl J Med 309: 13471353
42.Jedrzejczak WW, Siekierzyński M, Czarnecki C, Dziuk E (1976) Patterns of changes in peripheral blood composition in the course of combination chemotherapy of cancer. Strahlentherapie 152: 469-476
43.Wiktor-Jedrzejczak W, Czarnecki C (1974) Management of infections
in neutropenia. Wiad Lek 27: 1865-1868
44.Jedrzejczak WW (1977) Skutki uboczne chemioterapii nowotworów
jako kliniczny modle ostrej choroby popromiennej. Rozprawa habilitacyjna, CKP WAM, Warszawa
45.Jędrzejczak WW, Siekierzynski M, Dziuk E, Czarnecki Cz (1977) Ostra
choroba popromienna — wybór modelu do badan klinicznych. Lek
Wojsk 53: 37-42
46.Wiktor-Jedrzejczak W, Pojda Z (1987) Bone marrow transplantation in
Polish conditions. A modified method of marrow collection and preparation for transplantation. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 35: 79-86
47.Wiktor-Jedrzejczak W, Szczylik C, Pojda Z, Siekierzynski M, Kansy J,
Klos M, Ratajczak MZ, Pejcz J, Jaskulski D, Gornas P (1987) Success of
bone marrow transplantation in congenital Diamond-Blackfan anaemia: a case report. Eur J Haematol 38: 204-206
48.Wiktor-Jedrzejczak W, Szczylik C, Matej H, Pojda Z, Ratajczak MZ,
Myc A, Siekierzyński M, Kansy J, Kłos M, Rybicki Z (1989) Allogeneic
bone marrow transplantation from HLA-identical siblings following
conditioning with busulfan and cyclophosphamide. First results. Folia
Haematol Int Mag Klin Morphol Blutforsch 116: 403-408
49.Ikehara S, Ohtsuki H, Good RA, Asamoto H, Nakamura T, Sekita K,
Muso E, Tochino Y, Ida T, Kuzuya H, et al. (1985) Prevention of type
203
I diabetes in nonobese diabetic mice by allogenic bone marrow transplantation. Proc Natl Acad Sci USA 82: 7743-7747
50.Dang MN, Buzzetti R, Pozzilli P (2013) Epigenetics in autoimmune
diseases with focus on type 1 diabetes. Diabetes Metab Res Rev 29:
8-18
51.Voltarelli JC, Couri CE, Stracieri AB, Oliveira MC, Moraes DA, Pieroni
F, Coutinho M, Malmegrim KC, Foss-Freitas MC, Simões BP, Foss MC,
Squiers E, Burt RK (2007) Autologous nonmyeloablative hematopoietic stem cell transplantation in newly diagnosed type 1 diabetes mellitus. JAMA 297: 1568-1576
52.Snarski E, Milczarczyk A, Torosian T, Paluszewska M, Urbanowska E,
Król M, Boguradzki P, Jedynasty K, Franek E, Jedrzejczak WW (2011)
Independence of exogenous insulin following immunoablation and
stem cell reconstitution in newly diagnosed diabetes type I. Bone Marrow. Transplant 46: 562-566
exogenous insulin requirement in type 1 diabetes mellitus after immunoablation and transplantation of autologous hematopoietic stem
cells. Pol Arch Med Wewn 119: 422-426
54.Directive 2004/23/EC of the European parliament and of the Council
of 31 March 2004 on setting standards of quality and safety for the
donation, procurement, testing, processing, preservation, storage and
distribution of human tissues and cells
55.Ustawa z dnia 1 lipca 2005 r. o pobieraniu, przechowywaniu i przeszczepianiu komórek, tkanek i narządów Dz. U. z 2005 r. Nr 169, poz.
1411, (Ustawa z dnia 1 lipca 2005 r. o pobieraniu, przechowywaniu i
przeszczepianiu komórek, tkanek i narządów) Dz. U. z 2009 r. Nr 141,
poz. 1149, (Ustawa z dnia 17 lipca 2009 r. o zmianie ustawy o pobieraniu, przechowywaniu i przeszczepianiu komórek, tkanek i narządów
oraz o zmianie ustawy - Przepisy wprowadzające Kodeks karny)
53.Snarski E, Torosian T, Paluszewska M, Urbanowska E, Milczarczyk
A, Jedynasty K, Franek E, Wiktor-Jedrzejczak W (2009) Alleviation of
Translational research in regenerative medicine:
an example of bone marrow transplantation
Wiesław Wiktor Jędrzejczak*
Department of Hematology, Oncology and Internal Diseases, Medical University of Warsaw, 1a Banacha St., 02-097 Warsaw, Poland
*
e-mail: [email protected]
Key words: stem cells, animal models, postirradiation sickness
ABSTRACT
Science provides diagnostic and therapeutic methods that subsequently need to be introduced to routine clinical practice in ordered way.
Translational research allows for adaptation of methods developed on experimental animals to the requirements of man. This process requires
on one hand consideration of biological differences between model organisms (in case of bone marrow transplantation mainly mouse and
dog) and man and consideration of differences in size (usually upscaling of procedures). Procedures that have been elaborated during translation of methods of transplantation of hematopoietic cells elaborated on experimental animals to clinical situations could be successfully used
during introduction to the clinic of other types of cellular therapies.
204www.postepybiochemii.pl