72556-72558 hcv ultra (883607) polonais - Bio-Rad

Monolisa™ HCV Ag–Ab ULTRA
1 płytka – 96 testów
5 płytek – 480 testów
72556
72558
PRZESIEWOWY TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA ZAKAŻENIA
(WIRUSA ZAPALENIA WĄTROBY TYPU C) W LUDZKIEJ SUROWICY / OSOCZU
HCV
Wyrób do diagnostyki in vitro
Kontrola jakości producenta
Wszystkie produkty są wytwarzane i wprowadzane do obrotu przez Bio-Rad podlegają naszemu
systemowi jakości poczynając od momentu otrzymania surowców aż do chwili wprowadzenia do
obrotu ostatecznego produktu komercyjnego.
Każda seria odczynników jest poddana kontroli jakości i jest dopuszczona do sprzedaży po spełnieniu
określonych kryteriów jakości.
Dane dotyczące procesu produkcji oraz kontroli jakości każdej serii produkcyjnej są archiwizowane u
producenta.
SPIS TREŚCI
1 - ZASTOSOWANIE TESTU
2 - ZASADA TESTU
3 - SKŁAD ZESTAWU
4 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY
5 - HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY
6 - ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
7 - PRÓBKI
8 - REKONSTYTUCJA - PRZECHOWYWANIE - TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW
9 - PROCEDURA
10 - ADAPTACJA SYSTEMU
11 - OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW
12 - SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA
13 - CHARAKTERYSTYKA TESTU
14 - OGRANICZENIA TESTU
15 - LITERATURA
2
1 - ZASTOSOWANIE TESTU
Monolisa™ HCV Ag – Ab ULTRA jest testem jakościowym immunoenzymatycznym, przeznaczonym do
wykrywania zakażenia wirusem HCV, polegającym na wykrywaniu antygenu kapsydowego i przeciwciał
powstających w odpowiedzi na zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C w ludzkiej surowicy lub osoczu.
2 - ZASADA TESTU
W teście Monolisa™ HCV Ag – Ab ULTRA mikropłytka - faza stała została opłaszczona:
•
Przeciwciałem monoklonalnym przeciwko białkowemu antygenowi kapsydu wirusa hepatitis C.
•
Dwoma rekombinowanymi białkami, wytwarzanymi przez komórki E.coli, pochodzącymi z regionu NS3:
genotyp 1 i 3a.
•
Jednym rekombinowanym antygenem z regionu niestrukturalnego NS4.
•
Zmutowanym peptydem ze strukturalnego rejonu kapsydu, kodowanego przez genom wirusowy.
Jako koniugaty zastosowano:
•
Koniugat 1 (R6): Biotynylowane mysie przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko kapsydowi
wirusa hepatitis C. Przeciwciało to nie reaguje ze zmutowanym peptydem kapsydowym wirusa,
opłaszczonym na mikropłytce.
•
Koniugat 2 (R7): Mysie przeciwciała przeciwko ludzkim IgG, znakowane peroksydazą i streptawidyną.
Wykonanie testu składa się z następujących etapów:
1) Naniesienie do studzienek koniugatu 1 oraz próbek i surowic kontrolnych. Gdy w próbce występują
przeciwciała anty HCV, zwiążą się one z antygenami na fazie stałej oraz, gdy w próbce jest obecny
antygen kapsydu wirusa hepatitis C, zostanie on związany z fazą stałą przez opłaszczone na niej
przeciwciała monoklonalne i przez biotynylowane przeciwciała monoklonalne przeciwko kapsydowi
wirusa (koniugat 1).
2) Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 90 minut i etapie płukania następuje dodanie znakowanych
peroksydazą przeciwciał przeciwko ludzkim IgG i streptawidyny z peroksydazą (koniugat 2). Koniugat
streptawidyna/peroksydaza reaguje z biotynylowanymi monoklonalnymi przeciwciałami przeciwko
antygenowi kapsydu wirusa hepatitis C, związanymi z fazą stałą w poprzednim etapie. Koniugat
przeciwciał przeciwko ludzkim IgG z peroksydazą zwiąże się z przeciwciałami anty-HCV, które związały
się z fazą stałą w poprzednim etapie.
3) Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 30 minut, nie związany koniugat zostaje usunięty podczas
płukania, a kompleks antygenu z przeciwciałem, zostaje wykryty po dodaniu substratu.
4) Po 30 minutach następuje zahamowanie reakcji i spektrofotometryczny odczyt absorbancji przy długości
fali 450/620-700 nm. Pomiar absorbancji próbki mówi o obecności lub braku przeciwciał anty-HCV lub/i
antygenu kapsydowego HCV. Intensywność barwy jest proporcjonalna do ilości przeciwciał lub
antygenu, związanego z fazą stałą.
3
3 - SKŁAD ZESTAWU
Oznaczenie
Charakterystyka odczynnika
R1
MIKROPŁYTKA
12 pasków po 8 studzienek opłaszczonych przeciwciałami
monoklonalnymi przeciwko kapsydowi wirusa hepatitis C oraz
oczyszczonymi rekombinowanymi antygenami i zmutowanym
peptydem kapsydu wirusa HCV
BUFOR PŁUCZĄCY (20x)
Bufor Tris NaCl, pH 7.4
Konserwant: Proclin 300 (0.04%)
KONTROLA UJEMNA
Bufor Tris HCl, zawierający BSA
Konserwant: Proclin™ 300 (0.1%)
KONTROLA DODATNIA
Ludzka surowica zawierająca przeciwciała anty-HCV, ujemna pod
względem antygenu HBs oraz przeciwciał anty-HIV1 i anty-HIV2
rozcieńczona w buforze Tris HCl zawierającym BSA, inaktywowana
fotochemicznie
Konserwant: Proclin™ 300 (0.1%)
DODATNIA KONTROLA ANTYGENU
Dodatnia kontrola antygenu (syntetyczny peptyd kapsydu)
ROZCIEŃCZALNIK ANTYGENU
Rozcieńczalnik antygenu dla R5a.
Woda z Proclin™ 300 (0.5%)
KONIUGAT 1
Mysie biotynylowane przeciwciała monoklonalne przeciwko
antygenowi kapsydowemu HCV. Barwa purpurowa.
Konserwant: Azydek sodu (< 0.1%), Cosmocil 0.025%
KONIUGAT 2
Znakowane peroksydazą mysie przeciwciała przeciwko ludzkim IgG
i streptawidyna/peroksydaza. Barwa zielona.
Konserwant: Proclin™ 300 (0.5%)
BUFOR DO SUBSTRATU PEROKSYDAZY
Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu,
pH 4.0, zawierający H2O2 (0.015%) i DMSO (4%)
CHROMOGEN
Roztwór zawierający czterometylobenzydynę (TMB)
ROZTWÓR ZATRZYMUJĄCY
1 N kwas siarkowy
R2
R3
R4
R5a
R5b
R6
R7
R8
R9
R10
Opakowanie
1 płytka
5 płytek
1
5
1 fiolka
70 ml
1 fiolka
235 ml
1 fiolka
1 ml
1 fiolka
1 ml
1 fiolka
1.5 ml
1 fiolka
3 ml
1 fiolka
sqf 1 ml
1 fiolka
1 ml
1 fiolka
sqf 1 ml
1 fiolka
1 ml
1 fiolka
15 ml
2 fiolki
2 x 30 ml
1 fiolka
15 ml
2 fiolki
2 x 30 ml
1 fiolka
60 ml
2 fiolki
2 x 60 ml
1 fiolka
5 ml
1 fiolka
28 ml
2 fiolki
2 x 5 ml
3 fiolki
3 x 28 ml
4 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY
Woda destylowana lub dejonizowana
Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu
Bibuła
Rękawiczki jednorazowe
Okulary ochronne
Próbówki jednorazowe
Pipety automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub o stałej pojemności, pobierające 50 µl, 80 µl,
100 µl, 200 µl i 1 ml.
•
Cylindry miarowe na 10 ml, 200 ml i 1000 ml
•
Worteks
•
Płuczka mikropłytek: manualna, półautomatyczna* lub automatyczna *
•
Łaźnia wodna z termostatem lub inkubator mikropłytek* o temperaturze 37° ± 1°C
•
Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady
•
Czytnik mikropłytek* z filtrami 490,620,450/ 620 do 700 nm
* Informacji w sprawie wyposażenia w sprzęt udzieli serwis techniczny BioRad
•
•
•
•
•
•
•
5 - HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY
•
Wszystkie odczynniki zestawu służą do diagnostyki „in vitro” oraz do stosowania przez specjalistów.
•
Test ten powinien być stosowany przez odpowiednio przeszkolony personel laboratorium, który zna
procedury i potencjalne zagrożenia. Należy nosić odpowiednią odzież ochronną, włącznie z fartuchem,
4
okularami, jednorazowymi rękawiczkami (zalecane są syntetyczne rękawiczki nielateksowe). Należy
stosować zasady Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Należy dokładnie umyć ręce po wykonaniu testu.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Nie pipetować ustami.
Kontrolna surowica dodatnia R4 została inaktywowana fotochemicznie.
Materiał pochodzenia ludzkiego, używany do przygotowania kontroli dodatniej (R4), był ujemny pod
względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs Ag) i przeciwciał przeciwko ludzkim
wirusom niedoboru odporności (anty-HIV1 i anty-HIV2). Ponieważ nie ma metod absolutnie
wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego oraz
badane próbki powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny.
Wszystkie materiały mające kontakt z próbkami i odczynnikami pochodzenia ludzkiego oraz roztwór
płuczący, należy traktować jako potencjalnie zakaźne.
Unikać rozlania próbek i zawierających próbki odczynników.
Zanieczyszczone powierzchnie zmyć 10% roztworem podchlorynu. Jeśli nastąpiło zanieczyszczenie
kwasem, należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu, następnie zmyć powierzchnię
wybielaczem i wysuszyć bibułą. Materiał używany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na odpady.
Próbki, odczynniki pochodzenia ludzkiego i materiały zanieczyszczone biologicznie dekontaminować
przed wyrzuceniem:
- przez moczenie w 5% podchlorynie sodu (1 objętość podchlorynu na 10 objętości
zanieczyszczonego płynu lub wody) przez 30 minut,
- lub przez autoklawowanie w temperaturze 121°C, przez co najmniej 2
godziny.
UWAGA: Nie autoklawować roztworów zawierających podchloryn sodu.
Należy unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z buforem do substratu, chromogenem i roztworem
zatrzymującym. Karta charakterystyki substancji jest dostępna na życzenie.
Zawsze neutralizować i/lub autoklawować roztwory i inne płyny zawierające materiał biologiczny przed
wylaniem do zlewu.
Niektóre odczynniki są konserwowane azydkiem sodu. Związek ten może reagować z miedzią i ołowiem,
tworząc azydki metali o właściwościach wybuchowych. Aby zapobiec akumulacji azydku w zlewie i
rurach, po wylaniu zinaktywowanych odczynników zawierających azydek spłukać zlew dużą ilością
wody.
Niektóre odczynniki zawierają: ProClin™ 300 (0.04%, 0.1% i/lub 0.5%)
Xi - PRODUKT DRAŻNIĄCY
R43: Może wywołać uczulenie w kontakcie ze skórą.
S28-37: W razie kontaktu ze skórą, szybko przemyć dużą ilością wody z mydłem. Nakładać
odpowiednie rękawice
Karta charakterystyki substancji (MSDS) jest dostępna na życzenie
.
6 - ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej:
•
Nazwa testu, oraz specjalny numer identyfikacyjny danego testu są podane na obramowaniu każdej
mikropłytki. Ten sam numer identyfikacyjny znajduje się też na każdym pasku
Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA : Specific ID number = 55.
•
•
•
•
•
•
•
Sprawdź specjalny numer identyfikacyjny przed każdym użyciem testu, jeżeli numeru identyfikacyjnego
brak lub różni się od podanego powyżej, paska nie należy używać
Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności.
Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. UWAGA:
Podczas danego oznaczenia można używać odczynników z innej ale identycznej serii w przypadku:
roztworu płuczącego (R2, oznaczonego: 20x na zielono), buforu do peroksydazy (R8, oznaczonego:
TMB buf na niebiesko), chromogenu (R9, oznaczonego: TMB 11x na purpurowo) oraz roztworu
zatrzymującego reakcję (R10, oznaczonego: 1N na czerwono) Odczynników tych można używać w
niektórych innych testach Bio-Rad. Ponadto, prawidłowo rekonstytuowany roztwór płuczący (R2,
oznaczony: 20x na zielono) może być używany wymiennie z dwoma innymi roztworami płuczącymi
obecnymi w zestawach testowych firmy Bio-Rad (R2, oznaczony: 10x na niebiesko lub 10x na
pomarańczowo); pod warunkiem stosowania jednego rodzaju buforu w serii oznaczeń. Szczegółowych
informacji udzieli serwis techniczny.
Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji na 30 minut do temp. pokojowej.
Unikać zanieczyszczenia podczas rekonstytucji odczynników.
Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (zasadowych, kwasów i aldehydów) oraz
kurzu, mogących wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu.
Używać dobrze umytego i wypłukanego wodą destylowaną szkła, lub, co jest preferowane, materiałów
jednorazowych.
Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodawaniem kolejnego
odczynnika.
5
•
•
•
•
•
Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na działanie jonów metali. Unikać kontaktu elementów
metalowych z roztworami substratu i koniugatu.
Roztwór wykrywający reakcję (bufor do substratu + chromogen) powinien mieć barwę różową. Zmiana
tej barwy wkrótce po rekonstytucji świadczy o nie przydatności roztworu do użycia. Roztwór należy
przygotowywać w czystym jednorazowym plastikowym lub w szklanym pojemniku, przepłukanym 1N
kwasem solnym, a następnie wodą destylowaną i wysuszonym. Roztwór należy przechowywać w
ciemności.
Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety automatycznej.
Płukanie studzienek jest istotnym etapem procedury; należy przestrzegać przewidzianych cykli płukania,
oraz zwracać uwagę, czy studzienki są prawidłowo napełniane i całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe
płukanie jest przyczyną błędnych wyników.
Nigdy nie używać tego samego pojemnika do nanoszenia koniugatu i roztworu substratu.
7 - PRÓBKI
Próbki krwi należy pobierać zgodnie z rutynową procedurą. Oznaczenie powinno być wykonywane z
nierozcieńczonej surowicy lub osocza, pobranego na antykoagulant (EDTA, cytrynian, ACD). Jak najszybciej
oddzielić surowicę lub osocze od czerwonych krwinek lub skrzepu, aby zapobiec hemolizie. Próbki z
widocznymi cząstkami organicznymi należy odwirować przed oznaczeniem. Cząstki lub agregaty fibryny w
próbce mogą być przyczyną fałszywie dodatnich wyników.
Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temperaturze +2-8°C. Jeśli test będzie
wykonany później, należy je zamrozić w temp. -20°C. Unikać rozmrażania i ponownego zamrażania próbek.
Do transportu próbki (najlepiej zamrożone) należy zapakować zgodnie z przepisami określającymi zasady
przewożenia materiałów zakaźnych.
NIE
UŻYWAĆ
PRÓBEK
ZANIECZYSZCZONYCH,
HIPERLIPEMICZNYCH
ANI
SILNIE
ZHEMOLIZOWANYCH
UWAGA: Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy do 90 g/l albuminy, 50 µg/ml biotyny, 100
mg/l bilirubiny, poziom lipemii odpowiadający 36 g/l trioleiny, ani hemoliza wynosząca do 87 g/l hemoglobiny.
Próbki ujemne, próbki dodatnie pod względem przeciwciał anty-HCV i antygenu HCV były oznaczane przed i
po ogrzaniu do temperatury 56°C przez 30 minut i po 3 cyklach zamrażania / rozmrażania.
W żadnym przypadku nie wpłynęło to na wykrycie przeciwciał przeciwko wirusowi HCV. Ogrzanie próbki
spowodowało znaczne obniżenie wartości absorbancji przy wykrywaniu antygenu w teście Monolisa™ HCV
Ag- Ab ULTRA.
8 - REKONSTYTUCJA ODCZYNNIKÓW – TRWAŁOŚĆ - PRZECHOWYWANIE
Przed użyciem odczynniki zestawu Monolisa™ HCV Ag – Ab ULTRA przenieść w celu stabilizacji na 30
minut do temperatury pokojowej.
1. Odczynniki gotowe do użycia:
Mikropłytka (R1)
Każda ramka zawierająca 12 pasków zapakowana jest w torebkę z zamknięciem strunowym. Torebkę należy
przeciąć nożyczkami lub skalpelem 0.5-1 cm powyżej zamknięcia. Otworzyć opakowanie, wyjąć potrzebną
liczbę pasków. Pozostałe paski umieścić w torebce. Torebkę należy szczelnie zamknąć i przechowywać w
temperaturze +2-8°C.
Koniugat 1: gotowy do użycia (R6)
Przed użyciem wymieszać przez odwracanie.
Koniugat 2: gotowy do użycia (R7)
Przed użyciem wymieszać przez odwracanie.
2. Odczynniki do rekonstytucji
Bufor płuczący (R2)
Rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 1:20. Wymieszać. Przygotować 800 ml na jedną płytkę
zawierającą 12 pasków.
Roboczy roztwór substratu (R8 + R9)
Rozcieńczyć stężony roztwór chromogenu (R9) w stosunku 1:11 w buforze do substratu (R8) (np. 1 ml
odczynnika R9 + 10 ml odczynnika R8). 10 ml roztworu potrzeba i wystarcza dla 1 do 12 pasków.
Wymieszać.
Roboczy roztwór dodatniej kontroli antygenu (R5a + R5b)
Zawartość fiolki z rozcieńczalnikiem R5b przelać do fiolki z liofilizowanym R5a. Zamknąć fiolkę i pozostawić
na 10 minut, od czasu do czasu mieszając przez odwracanie.
3. Trwałość
Zestaw przechowywać w temperaturze +2-8°C. Każdy z odczynników, przechowywany w tej temperaturze,
może być wykorzystywany do daty ważności podanej na opakowaniu (z wyjątkiem specjalnych zaleceń).
R1: Po otwarciu torby, paski mikropłytki przechowywane w szczelnie zamkniętej torbie, w temperaturze +28°C, mogą być wykorzystywane przez miesiąc.
6
R2: Rozcieńczony bufor płuczący może być przechowywany w temperaturze +2-30°C przez dwa tygodnie.
Stężony bufor płuczący (R2) może być przechowywany w temperaturze +2-30°C.
R5a+R5b: Roboczy preparat dodatniej kontroli antygenu może być przechowywany w temperaturze +2-8°C
przez miesiąc, a w temperaturze -20°C przez dwa miesiące (rozmrażany do 5 razy po zamrożeniu w
temperaturze - 20°C).
R8+R9: Po rekonstytucji, odczynnik przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej (+18-30°C)
może być używany przez 6 godzin.
9 - PROCEDURA
•
•
•
Oznaczenie należy wykonać ściśle wg opisanej procedury.
Aby zapewnić walidację wyników, do każdej serii oznaczeń należy włączać kontrolę ujemną i dodatnią.
Należy przestrzegać zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej.
Wykonanie
1. Należy ustalić rozkład używanych studzienek.
2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący (rozcieńczony R2) i roboczy roztwór dodatniej kontroli
antygenu (R5a + R5b).
3. Wyjąć z torebki ramkę i potrzebną liczbę pasków (R1).
4. Nanieść kolejno, bez uprzedniego płukania mikropłytki:
4.1
100 µl koniugatu (R6) do każdej studzienki
4.2
50 µl kontroli ujemnej (R3) do studzienki A1
50 µl dodatniej kontroli przeciwciał (R4) do studzienek B1, C1, D1
50 µl dodatniej kontroli antygenu (R5a + R5b) do studzienki E1
50 µl próbki 1 do studzienki F1,
50 µl próbki 2 do studzienki G1, etc....
Wymieszać zawartość studzienek przez co najmniej 3 aspiracje pipetą lub wytrząsanie mikropłytki przez
5 sekund.
Jeśli czas nanoszenia próbek przekracza 10 minut, zaleca się naniesienie kontroli ujemnej i dodatniej po
dodaniu próbek.
Zależnie od wykorzystywanego systemu, możliwe jest modyfikowanie pozycji kontroli i rozkładu
nanoszonych odczynników.
N.B.: Po dodaniu próbek, studzienki zawierające próbki (lub kontrole) zmieniają barwę z purpurowej na
niebieską. Można zweryfikować obecność w studzienkach próbek i koniugatu przez odczyt
spektrofotometryczny przy 620 nm (patrz rozdział 12: WERYFIKACJA SPEKTROFOTOMETRYCZNA
PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA).
5. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną.
6. Inkubować mikropłytkę w łaźni wodnej z termostatem lub w inkubatorze mikropłytek:
przez 90 ± 5 minut w temp. 37 °C ± 1°C.
7. Zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość studzienek do pojemnika na płynne odpady. Do każdej
studzienki dodać minimum 0.370 ml roztworu płuczącego. Zaaspirować ponownie. Powtórzyć etap
płukania 4 razy (wykonać co najmniej 5 cykli płukania)
Pozostała objętość płynu nie powinna przekraczać 10 µl. (W razie potrzeby osuszyć
odwróconą
mikropłytkę na bibule.)
8. Szybko nanieść do wszystkich studzienek po 100 µl roztworu koniugatu 2 (R7). Roztwór delikatnie
wstrząsnąć przed użyciem. Zakryć mikropłytkę nową folią i inkubować: przez 30 ± 5 minut w temp. 37 °C
± 1°C.
N.B.: Koniugat ma barwę zieloną. Można zweryfikować jego obecność w studzienkach przez odczyt
spektrofotometryczny przy 620 nm (patrz rozdział 12: WERYFIKACJA SPEKTROFOTOMETRYCZNA
PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA).
9. Zdjąć folię. Zaaspirować zawartość studzienek i wykonać 5 cykli płukania jak powyżej.
10. Przygotować roztwór substratu (patrz rozdział 8, odczynnik (R8 + R9).
11. Szybko nanieść do wszystkich studzienek po 80 µl roztworu substratu (R8+R9), przygotowanego
bezpośrednio przed użyciem. Pozostawić reakcję w ciemności na 30 ± 5 minut w temperaturze
pokojowej (18-30°C). Nie zakrywać folią adhezyjną.
N.B.: Dodanie substratu, który ma barwę różową, jest kontrolowane wizualnie: widać
wyraźną
różnicę pomiędzy pustą studzienką a studzienką zawierającą różowy roztwór (w celu
weryfikacji
automatycznej patrz rozdział 12: WERYFIKACJA SPEKTROFOTOMETRYCZNA PIPETOWANIA PRÓBKI
I ODCZYNNIKA).
12. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 µl roztworu zatrzymującego
(R10). Roztwór ten dodawać w tej samej kolejności jak substrat do reakcji barwnej. Wymieszać
zawartość studzienki.
N.B.: Dodanie roztworu zatrzymującego, który jest bezbarwny, jest kontrolowane wizualnie. Po
dodaniu tego roztworu znika różowa barwa substratu w studzienkach próbek ujemnych, natomiast
studzienki z próbkami dodatnimi zmieniają barwę z niebieskiej na żółtą.
7
13. Wytrzeć spód mikropłytki i po upływie co najmniej 4 minut od zatrzymania reakcji, w ciągu 30 minut
zmierzyć gęstość optyczną (przy długości fali 450 / 620-700 nm) każdej studzienki.
14. Przed opisem wyników sprawdzić zgodność kolejności odczytu z ustalonym na początku rozkładem
studzienek.
10 - ADAPTACJA SYSTEMU
PŁUKANIE: Należy dokładnie przestrzegać opisanej procedury płukania, aby otrzymać optymalne
właściwości testu.
W przypadku niektórych aparatów trzeba zwiększyć liczbę cykli płukania, aby zachować akceptowany
poziom tła.
11 - OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW
Obecność lub brak przeciwciał anty-HCV lub/i antygenu kapsydowego HCV określa porównanie absorbancji
danej próbki z obliczoną wartością cut-off.
1.
Obliczenie średniej absorbancji dla kontroli dodatniej (ODR4)
Przykład: Kontrola dodatnia R4
Próbka
B1
C1
D1
Razem
Gęstość optyczna
1.636
1.704
1.650
4.990
całkowita gęstość optyczna 4.990
Średnia ODR4 = --------------------------------------- = --------- = 1.663
3
3
2.
Obliczenie wartości granicznej cut-off (CO)
Średnia ODR4
CO = --------------------4
Przykład: Średnia wartość OD R4 = 1.663
CO =
3.
1.663
--------4
= 0.415
Kryteria walidacji testu:
a) Dla kontroli ujemnej R3: wartość absorbancji musi być mniejsza niż: O.D. cut off x 0.6.
b) Dla kontroli dodatniej przeciwciał R4:
Średnia wartość absorbancji musi być wyższa lub równa 0.800 i niższa lub równa 2.400.
Jeśli jedna z kontroli dodatniej przeciwciał wykazuje wartość absorbancji o 30% przekraczającą
średnią, należy pominąć tę wartość i do obliczeń użyć dwóch pozostałych.
c) Dla roboczego roztworu kontroli dodatniej antygenu (R5a + R5b):
Wartość absorbancji musi być wyższa niż 0.500.
Test należy powtórzyć, jeśli kontrola ujemna R3, roboczy roztwór kontroli dodatniej antygenu (R5a +
R5b) i/lub więcej niż jedna kontrola dodatnia R4 wykazują wartości wykraczające poza limity podane
powyżej.
4. Interpretacja wyników
Próbki o absorbancji poniżej wartości granicznej cut-off są ujemne w teście Monolisa™ anty-HCV Ag – Ab
ULTRA.
Wyniki tuż poniżej wartości cut-off (OD cut off - 10% < OD próbki < OD cut-off) należy interpretować
ostrożnie (zaleca się powtórzenie oznaczenia takich próbek w duplikacie, o ile pozwala na to system oraz
procedury laboratoryjne).
Próbki o absorbancji równej lub wyższej niż wartość cut-off, zostają uznane za początkowo dodatnie i przed
ostateczną interpretacją muszą być ponownie oznaczone w duplikacie.
Jeśli po powtórzeniu oznaczenia próbki początkowo dodatniej, wartość absorbancji podczas drugiego lub
trzeciego pomiaru jest większa lub równa wartości cut-off, próbka zostaje uznana za dodatnią w teście
8
Monolisa
ujemną.
12
-
™
anty-HCV Ag – Ab ULTRA. Jeśli obie wartości są niższe niż cut-off, próbka zostaje uznana za
SPEKTROFOTOMETRYCZNA
ODCZYNNIKA (OPCJA)
WERYFIKACJA
PIPETOWANIA
PRÓBKI
I
WERYFIKACJA PIERWSZEGO ETAPU: PIPETOWANIE KONIUGATU 1 (R6) I PRÓBKI
Obecność koniugatu 1 (R6) i próbek w studzienkach można potwierdzić za pomocą pomiaru
spektrofotometrycznego przy długości fali 620 nm. Wartość OD studzienek zawierających koniugat 1 (R6) i
próbkę musi być wyższa niż 0.800.
UWAGA: Po dodaniu próbki, koniugat 1 (R6) zmienia barwę z purpurowej na niebieską.
WERYFIKACJA DRUGIEGO ETAPU: OBECNOŚĆ KONIUGATU 2 (R7)
Koniugat 2 (R7) ma barwę zieloną.
Obecność koniugatu (R7) w studzienkach można potwierdzić przez pomiar spektrofotometryczny przy
długości fali 620 nm: Wartość OD każdej studzienki powinna być wyższa niż 0.300. Wartość niższa wskazuje
na niedostateczne dodanie koniugatu.
WERYFIKACJA PIPETOWANIA ROZTWORU SUBSTRATU
Można zweryfikować dodanie różowego roztworu substratu za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego
gęstości optycznej studzienek przy długości fali 490 nm. Prawidłowa wartość powinna być wyższa od 0.100.
Wartość niższa wskazuje na niedostateczne dodanie roztworu substratu.
Widać wyraźnie różnicę pomiędzy bezbarwnymi pustymi studzienkami, a studzienkami różowymi po
naniesieniu roztworu substratu.
13 – CHARAKTERYSTYKA TESTU
A – SWOISTOŚĆ
Swoistość testu Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA określono, testując próbki pobrane od dawców krwi i od
pacjentów, oraz wykonując rutynowe badania w różnych ośrodkach.
Swoistość badana dla dawców krwi
Badania prowadzono w 3 ośrodkach. Badano surowice od stałych i nowych dawców krwi.
Ośrodek
Liczba badanych próbek
Liczba próbek dodatnich po
powtórzeniu
Rungis B.B
Francja
2410
5
Bordeaux B.B
Francja
2503
3
Dawcy z Montpellier
Francja
2248
4
Ogółem
7161
12
Z 7161 próbek od dawców krwi, dla 12 próbek uzyskano wynik dodatni po powtórzeniu w teście Monolisa™
HCV Ag-Ab ULTRA, wykonanym i zinterpretowanym zgodnie z rekomendacjami zawartymi w instrukcji, lecz
nie zostały one potwierdzone jako HCV-dodatnie metodą PCR lub w teście HCV PLUS Deciscan
Immunoblott.
Swoistość dla grupy dawców krwi określono na 99.83% (99.71% do 99.91%, w przedziale ufności 95%).
Swoistość badana dla pacjentów hospitalizowanych
W 2 ośrodkach oznaczono 469 bieżących próbek, pobieranych od hospitalizowanych pacjentów. 440 próbek
było ujemnych w rutynowo wykonywanym teście HCV Ab, zarejestrowanym w UE i w teście Monolisa™ HCV
Ag-Ab ULTRA. Dla 22 próbek uzyskano wynik dodatni w teście Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA i w teście
rutynowym; dla 21 z nich wynik dodatni potwierdzono i dla 1 prawdopodobnie potwierdzono testem Deciscan.
Dla 7 próbek uzyskano wyniki niezgodne pomiędzy testem Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA, HCV PLUS
Deciscan Immunoblott i metodą PCR.
Dla tych 7 próbek uzyskano następujące wyniki:
•
2 próbki dodatnie w teście rutynowym (ujemne w HCV PCR i HCV PLUS Deciscan Immunoblott) i
ujemne w teście Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA uznano za fałszywie dodatnie w teście rutynowym.
•
Dwóch próbek nie można było ocenić ze względu na nie interpretacyjny wynik PCR. Zostały one
wyłączone z dalszych obliczeń.
•
Jedna próbka była dodatnia w teście rutynowym, ujemna w teście Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA,
wątpliwa w teście HCV PLUS Deciscan Immunoblott i ujemna metodą PCR.
•
Tylko 2 próbki dodatnie teście Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA (o niskim mianie poniżej 1.7) i rutynowym
teście HCV Ab, były ujemne w teście PCR i wątpliwe w teście HCV PLUS Deciscan Immunoblott (nisko
dodatni prążek NS4).
Swoistość określona na podstawie tych badań wynosi 99.5% (443/445), przyjmując dwie ostatnie próbki jako
fałszywie dodatnie i 100%, jeśli zostaną one uznane za prawdziwie dodatnie ze względu na obecność
przeciwciał pozostałych po dawnym zakażeniu (wynik wątpliwy w teście immunoblot).
Swoistość dla potencjalnie interferujących próbek
Oznaczono 429 próbek, mogących indukować krzyżową reaktywność w teście immunoenzymatycznym.
Próbki pochodziły od:
9
Pacjentów z innymi chorobami zakaźnymi, jak zapalenie wątroby typu B, typu A, różyczka,
toksoplazmoza, świnka, odra, CMV, HSV, EBV, VZV, HTLV I, HIV, choroba Chagasa, Flavivirus, oraz od
pacjentów szczepionych przeciw grypie
•
Pacjentów z dodatnim czynnikiem reumatoidalnym,
•
Pacjentów z chorobą autoimmunologiczną (SLE), szpiczakiem, dodatnich pod względem przeciwciał
przeciwjądrowych HAMA i ANA
•
Kobiet w ciąży, pacjentów z marskością wątroby, przewlekłą niewydolnością nerek i chorych
dializowanych.
Wśród tych 429 próbek, 1 była dodatnia po powtórzeniu w teście Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA oraz
dodatnia w teście HCV Ab zarejestrowanym w UE.
Swoistość testu dla tej grupy próbek wynosiła 100% (428/428).
•
B - CZUŁOŚĆ
Badania czułości polegały na testowaniu dużych serii próbek dodatnich pod względem HCV, z komercyjnych
paneli serokonwersyjnych, z kolekcji Bio-Rad i z ośrodka referencyjnego. Przedstawiono podsumowanie tych
badań:
Czułość dla próbek dodatnich pod względem HCV
Badano 646 próbek dodatnich od przewlekłych nosicieli wirusa HCV (obecność przeciwciał anty-HCV) z
czego dla 405 oznaczono genotyp.
Dla wszystkich 646 próbek uzyskano wynik wysoce dodatni w teście Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA, co
pozwoliło określić czułość testu na 100%.
25 dodatkowych próbek pozytywnych, Świerzych (≤ 1 dzień po pobraniu) były testowane i wszystkie wyniki
były pozytywne.
Czułość dla genotypowanych próbek dodatnich pod względem HCV
Oznaczono ogółem 405 próbek genotypowanych: 133 pochodziły z różnych źródeł i 272 z laboratoriów
szpitalnych
Rozkład testowanych genotypów:
Genotyp
Liczba
Genotyp
Liczba
1a
53
3a/b
2
1b
83
4
10
1c
2
4a
21
1d
3
4c
6
1a/b
3
4d
5
2
31
4h
2
2a
7
4k
2
2b
18
4f
3
2c
4
4c/d
1
2i
1
5a
24
2a/c
17
6a
1
3
25
6d
1
3a
77
1b,2a/2
1
3b
1
1a/b,2a/c
1
Ogółem
405
Wszystkie badane próbki oznaczono jako dodatnie: 100% czułości.
Próbki od pacjentów z ostrym zakażeniem
Czułość testu określono także dla próbek pobranych w ostrej fazie zakażenia HCV (początek zakażenia).
Ogółem oznaczono w teście Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA 53 panele serokonwersyjne, zawierające 421
próbek i porównano wyniki z uzyskanymi w teście do wykrywania przeciwciał anty-HCV, zarejestrowanym w
U.E. Za pomocą testu Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA zakażenie wykryto wcześniej w przypadku praktycznie
wszystkich paneli: wykryto 119 dodatkowych próbek w porównaniu z testem do wykrywania przeciwciał antyHCV.
53 panele serokonwersyjne
(421 próbek)
Liczba próbek dodatnich
Test anty-HCV
Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA
152
271
Z 53 oznaczanych paneli serokonwersyjnych, 11 zaczyna się od próbki nie-wiremicznej, umożliwiając
dokładniejsze określenie okresu okna serologicznego, gdy nie występują przeciwciała anty-HCV).
Czas potrzebny do uzyskania wyniku dodatniego
od pierwszego pobrania (dni)
Panel
BCP-6211
BCP-6213
BCP-6222
BCP-6225
BCP-6227
BCP-9041
BBI-PHV919
BCP-9054
BCP-9055
BCP-6216
Genotyp
1a
1a
1a
1a
1a
1a
1a
3a
NG*
NG*
HCV RNA**
Test
anty-HCV
140
11
17
45
42
24
25
52
31
23
186
43
40
78
74
62
28
60
68
23
Monolisa™
HCV Ag-Ab
ULTRA
140
30
17
45
46
24
28
52
33
23
Różnica
między testem
anty-HCV i
Monolisa™
HCV Ag-Ab
ULTRA (dni)
46
13
23
33
28
38
0
8
35
0
10
NABI-SC90
NG*
10
52
10
42
Średnia w dniach
38.2
64.9
40.7
24.2
* Nie oznaczono genotypu
** Wynik testu RNA podany przez producenta panelu.
W przypadku oznaczonych 11 paneli, w teście Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA wykryto zakażenie średnio 24
dni wcześniej niż w teście anty-HCV. Jest to spowodowane zdolnością wykrywania antygenu kapsydowego
wirusa w teście Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA.
Czułość detekcji antygenu
Czułość detekcji antygenu HCV również oceniano przy pomocy paneli serokonwersyjnych, np. panelu BBI
917. Wykres przedstawia porównanie czułości testu Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA z konkurencyjnym HCV
Ab EIA.
Powtarzalność
Powtarzalność wewnątrz- i pomiędzy-testową określono, oznaczając 7 próbek: jedną ujemną, 3 dodatnie pod
względem przeciwciał anty-HCV i 3 dodatnie pod względem antygenu HCV.
W badaniu powtarzalności wewnątrz-testowej, oznaczono te próbki 30 razy w tym samym teście. W badaniu
powtarzalności pomiędzy-testowej, próbki oznaczało 2 techników przez 20 dni (Stosując procedurę NCCLS
EP5)
Średni stosunek OD/cut-off, odchylenie standardowe i współczynnik zmienności przedstawiają tabele:
Tabela 1: Powtarzalność wewnątrz-testowa
Próbki
OD/cut-off
Ujemna
0.14
HCV Ab nisko dodatnia
1.12
HCV Ab średnio dodatnia
2.39
HCV Ab wysoko dodatnia
4.88
HCV Ag nisko dodatnia
1.14
HCV Ag średnio dodatnia
1.97
HCV Ag wysoko dodatnia
5.86
SD
0.01
0.04
0.08
0.18
0.03
0.06
0.14
CV%
6.1
3.65
3.39
3.7
3.04
3.02
2.38
Współczynnik zmienności uzyskany dla 6 próbek dodatnich wynosił poniżej 10%.
Tabela 2: Powtarzalność pomiędzy-testowa
Próbki
OD/cut-off
Ujemna
0.16
HCV Ab nisko dodatnia
1.2
HCV Ab średnio dodatnia
2.39
HCV Ab wysoko dodatnia
4.77
HCV Ag nisko dodatnia
1.13
HCV Ag średnio dodatnia
2.0
HCV Ag wysoko dodatnia
5.99
SD
0.02
0.08
0.13
0.17
0.09
0.15
0.37
CV%
12.4
6.65
5.38
3.58
7.97
7.73
6.2
Współczynnik zmienności uzyskany dla 6 próbek dodatnich wynosił poniżej 15%.
11
14 - OGRANICZENIA TESTU
Ze względu na zróżnicowanie reakcji immunologicznych, występujących u pacjentów zakażonych wirusem
zapalenia wątroby typu C (szczególnie w trakcie serokonwersji), mogą wystąpić pewne różnice w wykrywaniu
przeciwciał za pomocą testów opartych na różnych antygenach białkowych wirusa. Wynik ujemny w teście
przesiewowym nie wyklucza możliwości ekspozycji na HCV.
We wszystkich testach ELISA można uzyskać wyniki fałszywie dodatnie. Zaleca się zweryfikowanie
swoistości reakcji w przypadku próbek dodatnich po powtórzeniu, zinterpretowanych zgodnie z kryteriami
testu Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA, odpowiednią metodą: testem przesiewowym ELISA do wykrywania
przeciwciał anty-HCV lub testem immunoblot do wykrywania przeciwciał anty-HCV. W razie konieczności,
można zastosować test do wykrywania genomu HCV lub test na swoisty antygen HCV w połączeniu z testem
neutralizacji.
Podczas weryfikacji pipetowania metodą kolorymetryczną nie można oznaczyć objętości dodanej próbki,
koniugatu i substratu, lecz jedynie potwierdzić ich obecność w studzienkach. Poziom błędu tej metody jest
ściśle związany z dokładnością używanego systemu (łączny współczynnik zmienności nanoszenia i odczytu
wynoszący ponad 10% znacznie obniża jakość weryfikacji).
15 - LITERATURA
∑
∑
∑
∑
∑
∑
∑
∑
∑
∑
∑
∑
∑
∑
Busch MP, Kleinman SH. Committee report: nucleic acid amplification testing of blood donors for
transfusion-transmitted infectious diseases. Report of the Interorganizational Task Force on Nucleic Acid
Amplification Testing on Blood Donors. Transfusion. 2000, 40: 143-1 59.
Busch MP, Kleinman, SH, Nemo GJ. Current and emerging infectious risks of blood transfusions. JAMA.
2003, 289: 959-962.
Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical
utility of total core HCV core antigen quantification: a new indirect marker of HCV replication. Hepatology.
2002, vol 36: 211-218.
Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT fot HIV, HCV and HBV
in whole–blood donations. Transfusion. 2003, 43: 721-729.
Lambert N, Vermet L, Bordier M, Clément A, Costaille M, Prigent V, Flecheux O, Sanjuan A et al.
Performance features of the new Bio-Rad HCV antigen and antibody assay: MonolisaTM HCV Ag- Ab
ULTRA. Vox sanguinis. 2004, 87 (suppl 3): 61-62.
Laperche S, Le Marrec N, Simon N, Bouchardeau F, Defer C, Maniez-Montreuil M, Levayer T, Zappitelli
JP, Lefrère JJ. A new HCV core antigen assay based on disassociation of immune complexes: an
alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV Infection. Transfusion. 2003, 43: 958-962.
Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection
in the early infection phase. Transfusion. 2002. 42: 1037-1 045.∑ Masalova OV, Atanadze SN,
Samokhvalov EI, Petrakova NV, Kalinina TI, Smirnov VD, Khudyakov YE, Fields HA, Kushch AA.
Detection of hepatitis C virus core protein circulating within different virus particle populations. Journal of
Medical Virology. 1998, 55: 1-6.
Pawlotsky JM. Use and interpretation of virological tests for hepatitis C. Hepatology. 2002, 36: 565-573.
Pillonel J, Laperche S, Saura C, Desenclos JC, Couroucé AM et al.. Trends in residual risk of transfusiontransmitted viral infections in France between 1992 and 2000. Transfusion. 2002, 42: 980-988.
Simmonds P. HCV heterogeneity: the science and the practice. In Hepatitis C. 1998. Yanamouchi Europe
BV Ed. p 3-10.
Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C.
AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39: 1147-1171.
Centers for Disease Control. Guidelines for Laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis
C virus. MMWR 2003, 52: RR-3.
EASL International Consensus Conference on Hepatitis C. Consensus Statement. Journal of Hepatology.
1999, 30: 956-961.
NIH Consensus Statement on Management of hepatitis C: 2002. NIH Consensus and State-ofthe-Science
Statements. 2002, 19 N°3. 46p.
13
•
•
CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
Znak CE (Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady nr 98/79/CE o wyrobach diagnozy medycznej in vitro)
•
•
For in vitro diagnostic use
Wyrób do diagnostyki in vitro
•
•
Catalogue number
Numer katalogowy
•
•
Manufacturer
Wytwórca
•
•
Authorised Representative
Autoryzowany przedstawiciel
•
•
Batch code
Kod partii
•
•
Expiry date YYYY/MM/DD
U y przed RRRR/MM/DD
•
•
Storage temperature limitation
Przestrzega zakresu temperatur
•
•
Consult Instruction for use
Sprawd w instrukcji obsługi
Bio-Rad
3, Bd Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette – France
Tél. : 33 (0) 1 47 95 60 00
Fax.: 33 (0) 1 47 41 91 33
0459
11/2010
nr 883607
14