Scientific Review in Pharmacy - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transkrypt

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073
Farmaceutyczny
www.fpn.info.pl
Cena 24,50 zł
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH
IC Value - Current 3.66
MNiSW 4
ROK VI (X)
Nr 9/2009 (56)
Scientific Review in Pharmacy
Application of EPR Spectroscopy
to Examination
of Gamma-irradiated Erythromycin
Modelowe postacie wybranych środków
znieczulenia miejscowego.
Cz. I. Charakterystyka postaci farmaceutycznej0
Neurotoksyczność leków
– stale aktualny problem farmakoterapii
Przeciwnowotworowe
oraz cytotoksyczne działanie propolisu
0
Obserwacje kliniczne zwierząt 0
w badaniach toksykometrycznych
Ludzkie topoizomerazy jako cel komórkowy 0
współczesnej chemioterapiI
ISSN 1425-5073
Wpływ łącznego stosowania leku Ukrain
i Metotreksatu na niektóre parametry
biochemiczne w surowicy krwi myszy
świadczące o funkcji nerek
1
0
Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
Farmaceutyczny
Adres redakcji / Editorial Adress:
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
ul. Jedności 8 , 41-200 Sosnowiec, Polska / Poland
Tel. +48 32 364 11 50, +48 514 342 345
Fax. + 48 32 364 11 58
E-mail: [email protected]
Index Copernicus 3,66
MNiSW 4
Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board
Przewodniczący / Head:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec
Członkowie / Members:
Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok
Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja
Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków
Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa
Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź
Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania
Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja
Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin
Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań
Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja
Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia
Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria
Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków
Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin
Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec
Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice
Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia
Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa
Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok
Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław
Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin
Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia
Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja
Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk
Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia
Sekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary:
Dr n. med. Robert D. Wojtyczka
Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board:
Dr n. farm. Paweł Olczyk
Dr n. biol. Małgorzata Kępa
Mgr Anna Szeremeta
Mgr Agnieszka Jura – Półtorak
Dr n. hum. Anna Kierczak
Wydawca / Publisher:
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego
Adres Wydawcy / Publisher Adress:
ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Poland
tel. +48 33 817 28 79, fax +48 33 817 36 31
Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.)
Marketing Manager:
Opracowanie graficzne / Graphics:
Agnieszka Romańska
Robert Cyganik
Nakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copies
Skład / Technical Editor:
Jerzy Partyka
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.
Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education.
Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach
z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania
nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą
wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja
nie odpowiada.
All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright
laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the
rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints
are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for
advertisements and reader letters.
Zdj. Zygmunt Wieczorek
Szanowni Państwo,
Koleżanki i Koledzy,
Drodzy Czytelnicy
W ślad za poprzednim numerem Farmaceutycznego
Przeglądu Naukowego, do którego nie tak dawno przygotowywałam parę słów tytułem wstępu, zaproszenia i zachęcenia Państwa do lektury jego zawartości, już pojawia się
kolejny numer czasopisma, a ja już donoszę o ważnych wydarzeniach naukowych z życia polskiej farmacji.
Tradycyjnie, na wstępie informujemy o wydarzeniach
naukowych, jakimi są Zjazdy, Konferencje czy Sympozja,
krajowe i zagraniczne. I tak, miło mi Państwa powiadomić,
iż już niebawem, bowiem 3 grudnia br., w Sali Konferencyjnej Naczelnej Izby Lekarskiej, w Warszawie, przy ulicy
Sobieskiego 110, odbędzie się Konferencja z cyklu „Zawody medyczne na ziemiach polskich w XIX i XX wieku”,
zatytułowana „Zawód lekarza na ziemiach polskich w XIX
i XX wieku”. Pomysłodawcą i niezawodnym Organizatorem cyklicznych Konferencji z wymienionego zakresu jest
Pani dr hab. Bożena Urbanek, Kierownik Katedry Nauk
Społecznych, Wydziału Farmaceutycznego Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Pierwsza z Konferencji omawianego cyklu odbyła się w 2004 roku i nosiła
tytuł: „Zawód położnej na ziemiach polskich w XIX i XX”.
Kolejna, pod tytułem „Zawód farmaceuty na ziemiach polskich w XIX i XX wieku” odbyła się w dwa lata później, zaś
następna – zorganizowana w 2008 roku, nosiła tytuł „Zawód pielęgniarki na ziemiach polskich w XIX i XX wieku”. Gratulujemy Pani Docent inwencji, oraz konsekwencji
i niezwykłego zaangażowania w promowanie wiedzy o najistotniejszych wydarzeniach z życia wybitnych przedstawicieli wymienionych zawodów medycznych na przestrzeni
minionych lat. Dziękujemy za zapisywanie kolejnych kart
naszej historii.
Na szczególną także uwagę zasługuje Przedsięwzięcie,
organizowane przez Sekcję Studencką Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego – Młoda Farmacja, działającą przy
Wydziale Farmaceutycznym w Bydgoszczy. Przedsięwzięcie to, III Ogólnopolski Kongres Naukowy Młodej Farmacji
– Bydgoszcz 2009, obejmować będzie wykłady i dyskusje
prowadzone przez nauczycieli akademickich, stanowiące
platformę do wymiany poglądów i sposobność do zdobycia
przez studentów wiedzy i nowych, naukowych doświadczeń. W czasie Kongresu odbędzie się także Konkurs studenckich prac naukowych. Z pewnością pojawią się także
prace z zakresu opieki farmaceutycznej. Umiejętność stosowania wiedzy z tej właśnie dziedziny nauk farmaceutycznych, na co dzień, jest powinnością każdego, zatrudnionego
w aptece farmaceuty. Do rzetelnego krzewienia tej wiedzy
przygotowują się nasze Wydziały Farmaceutyczne, a nowe
standardy edukacyjne, uwzględniające w kształceniu przeddyplomowym przedmiot opieka farmaceutyczna, czekają na
akceptację przez Radę Główną Szkolnictwa Wyższego.
A w naszym bieżącym numerze – artykuły z różnych
ośrodków naukowych w Polsce. Zapraszam serdecznie do
ich lektury.
Zapraszam w dalszym ciągu, już tradycyjnie, nieustająco, Autorów prac – na łamy Farmaceutycznego Przeglądu
Naukowego. Publikujemy prace szybko, a nasze możliwości
wydawnicze – zważywszy, iż FPN jest miesięcznikiem, są
znaczne.
W oczekiwaniu na Państwa prace, z życzeniami owocnej
lektury,
załączam jesienne, serdeczne pozdrowienia,
Redaktor Naczelny
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
Farmaceutyczny
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
Index Copernicus 3,66
MNiSW 4
Nr 9 / 2009
Spis treści
Application of EPR spectroscopy to examination
of gamma-irradiated erythromycin0
Zastosowanie spektroskopii EPR 0
do badań gamma-napromieniowanej erytromycyny
Modelowe postacie wybranych środków znieczulenia miejscowego.
Cz. I. Charakterystyka postaci farmaceutycznej0
Model drug formulations of selected of local anesthetics.Part I.
The characterization of the drug formulation
– stale aktualny problem farmakoterapii0
Drug neurotoxicity
– current problem of pharmacotherapy
Przeciwnowotworowe oraz cytotoksyczne działanie propolisu
The anticancer and cytotoxic activity of propolis
8
12
18
0 22
Obserwacje kliniczne zwierząt w
0 badaniach toksykometrycznych0
Clinical observations of animals in toxicometric studies
25
Ludzkie topoizomerazy jako cel komórkowy 0współczesnej chemioterapii0
Human topoisomerases as a cellular target of current chemotherapy0
30
Wpływ łącznego stosowania leku Ukrain i Metotreksatu
na niektóre parametry biochemiczne w surowicy krwi myszy świadczące o funkcji nerek0
Effect of simultaneous treatment with Ukraine and Methotrexate
on some biochemical parameters of mice serum indicating o
0 n kidney function
34
Zawód lekarza
na ziemiach polskich
w XIX i XX wieku
3 grudnia 2009 godz. 10:00
Sala konferencyjna
Naczelnej Izby Lekarskiej
w Warszawie, ul. Sobieskiego 110
Konferencja na temat
Zawód lekarza na
ziemiach polskich
w XIX i XX w.
(w siedzibie Naczelnej
Izby Lekarskiej)
Zakład Historii Medycyny i Farmacji Katedry Nauk
Społecznych Śląskiego Uniwersytetu Medycznego uprzejmie zawiadamia a zarazem zaprasza na konferencję z cyklu Zawody medyczne na ziemiach polskich w XIX i XX
w., poświęconą tym razem Zawodowi lekarza na ziemiach
polskich w XIX i XX w. Współorganizatorem konferencji,
która, odbędzie się 3 grudnia 2009r w Naczelnej Izbie
Lekarskiej w Warszawie jest Instytut Historii Nauki
PAN, Naczelna i Okręgowe Izby Lekarskie (stolicy i Mazowsza). Podczas trwania konferencji będzie mała miejsce promocja publikacji pod podanym powyżej tematem.
W programie przewidziano referaty związane z rozwojem
profesji lekarza w dwóch ostatnich stuleciach. Szczegółowo zaś kształceniem, doskonaleniem zawodowym, kształtowaniem się poszczególnych specjalności, statusem społeczno-prawnym a także warunkami socjalno- bytowymi
w tym okresie. Pragniemy także pokazać zmieniający się
na przestrzeni stulecia warsztat pracy lekarza wybranych
specjalności w tym chirurga czy rentgenologa. Prezentowane treści referatów opracowano na bazie różnorodnych
źródeł w tym czasopiśmiennictwa lekarskiego, archiwaliów,
w tym niejednokrotnie unikatowych a nawet osobistych
wspomnień czy listów, zebranych w całym kraju. Przedmiotem naszych penetracji są ziemie polskie wszystkich zaborów, okresu II Rzeczypospolitej a następnie czasów PRL.
W konferencji uczestniczyć będą historycy, historycy - medycyny, lekarze z całego kraju i zagranicy.
Pragniemy dodać, że konferencja została także wpisana w obchody 200 lecia istnienia warszawskiego Wydziału Lekarskiego, który także przejął opiekę naukową nad
konferencją. Tegoroczna jest piątą z cyklu organizowaną
przez Zakład Historii Medycyny i Farmacji Śląskiego
Uniwersytetu Medycznego. Przeprowadzone do tej pory
poświęcone zostały następującym zawodom medycznym:
zawodowi akuszerki – położnej; aptekarza –farmaceuty;
dentysty – lekarza stomatologa. Ostatnia dotyczyła zawodu pielęgniarki w XIX i XX w. i miała miejsce 15 września 2008r., w Senacie RP. Owocem wszystkich wspomnianych konferencji są tematyczne opracowania do nabycia w Zakładzie Historii Medycyny i Farmacji ŚUM lub
Instytucie Historii Nauki PAN.
Serdecznie zapraszamy
wszystkich zainteresowanych,
Dr hab. n. hum. Bożena Urbanek
Spis treści (Konferencja pt. Zawód lekarza
na ziemiach polskich w XIX i XX w.)
Bożena Urbanek – Wstęp
1. Anita Magowska- Lekarze na Wileńszczyźnie w I połowie
XIX w.
2. Walentyna, Krystyna Korpalska – Lekarze w rejencji bydgoskiej na przełomie XIX i XX wieku.
3. Bożena Urbanek- Specjaliści w Królestwie Polskim
w II połowie XIX w. do
czasów I wojny światowej,
w doniesieniach polskiej prasy medycznej (ze szczególnym
uwzględnieniem Warszawy).
4. Anna Marek – Urządzenie i wyposażenie sal operacyjnych
w szpitalach warszawskich od początku XX w. do 1939 r.
5. Maria Kempa, Kobiety lekarzami.
6. Ewa Szmaj, Pierwsze kobiety – dermatolodzy zainteresowani sprawami kosmetyki na ziemiach polskich.
7. Hanna Bojczuk – Medycy warszawskiego pogotowia ratunkowego (1897 –1939).
8. Elżbieta Więckowska - Ogólna charakterystyka grupy zawodowej lekarzy II Rzeczypospolitej.
9. Agnieszka Bukowska – Powstanie i działalność izb lekarskich.
10. Andrzej Felchner - Lekarze wojskowi w armii II Rzeczypospolitej.
11. Robert Gawkowski -Lekarze akademiccy w służbie sportu
w 20- leciu .
12. Grzegorz Mart – Metody i narzędzia propagandy higieny
międzywojnia.
13. Joanna Majchrzyk Mikuła - Lekarze szkolni w Polsce
w latach 1918-1939.
14. Małgorzata Marcysiak -Opieka lekarska w województwie
lwowskim od 1929 do 1939.
15. Sylwia Kuźma- Markowska – Działacze ruchu Świadomego Macierzyństwa w latach 30. XX w.
16. Jerzy Janiuk - Sylwetki lekarzy we wczesnych (1931-1939)
utworach M. Choromańskiego
17. Janina Fetlińska – Wkład lekarzy w rozwój społeczny i kulturalny Bieżunia.
18. Jarosław Wanecki - W szpitalach płockich w latach 19391983.
19. Wiesława Wardziak –Praca na rzecz jeńców wojennych
podczas II
wojny światowej. Działalność dr Henryka Grabowskiego
20. Marcin Leśniewski – Akademickie środowisko Wilna połowy XX w.
21. Magdalena Paciorek - Wizerunek lekarza w polskim filmie
fabularnym.
22. Maria Lipińska – W zwierciadle „Służby Zdrowia”, w latach 1945-1956.
23. Jacek Tomasz Persa, s. Aneta Krawczyk - Kościół, władza,
lekarze w okresie PRL –u.
24. Joanna Warmuzińska-Wnuk Lekarze Górnego Śląska
w medycynie XX w
25. Jarosław Wanecki - Okręgowa Izba lekarska w Płocku od
1989 do 2009.
26. Ewa Blacha, Monika Warszawska – Udział lekarza
w eksperymencie lekarskim, eksperymencie medycznym na
przełomie XX wieku.
7
Farm Przegl Nauk, 2009,9, 8-11
Application of EPR spectroscopy to examination
of gamma-irradiated erythromycin
Zastosowanie spektroskopii EPR
do badań gamma-napromieniowanej erytromycyny
Sławomir Wilczyński1, Barbara Pilawa1, Marta Ptaszkiewicz2, Ewa Pierzchała3, Jan Swakoń2, Paweł Olko2
Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
2
Zakład Fizyki Radiacyjnej i Dozymetrii, Instytut Fizyki Jądrowej PAN w Krakowie
3
Zakład Medycyny Estetycznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
1
Abstract
Streszczenie
EPR spectra of erythromycin after gamma-irradiation by
using a 60Co source at a dose of 25 kGy were analysed. Irradiation was done in THERATRON 780E. Spectroscopic
measurements were performed by the use of an X-band
(9.3 GHz) EPR spectrometer with magnetic modulation of
100 kHz. Concentration of paramagnetic centers after irradiation in the studied drug was 5x1019 spin/g and its value
decreases with increasing time of storage. Influence of microwave power in the range of 0.7-70 mW on amplitudes
and linewidths of the erythromycin’s lines was evaluated.
The EPR lines saturated at lower microwave powers when
storage time increased. Increase of spin-lattice relaxation
time in gamma-irradiated erythromycin points out that its
molecular structure changes during storage.
Analizie poddano widma EPR gamma napromieniowanej erytromycyny. Próbki zostały gamma napromieniowane dawką 25 kGy przy użyciu aparatu THERATRON
780E zawierającego izotop kobaltu 60Co. Pomiary spektroskopowe zostały przeprowadzone przy użyciu spektrometru EPR na pasmo X (9.3 GHz) z modulacją pola
magnetycznego wynoszącą 100 kHz. Koncentracja centrów paramagnetycznych w badanym leku wynosiła
5 x 1019 spin/g a wartość ta spadała wraz z czasem przechowywania próbki. Analizowano wpływ mocy mikrofalowej
w zakresie 0.7-70 mW na amplitudę i szerokość linii EPR
erytromycyny. Wraz z czasem przechowywania próbki linie
EPR nasycają się dla niższych mocy mikrofalowych. Przyspieszenie czasu relaksacji spin-sieć wskazuje na zmiany
w strukturze chemicznej leku podczas jego przechowywania.
Key words: paramagnetic centers, EPR, microwave saturation, gamma-irradiation, erythromycin
1. Introduction
In the last years drug sterilization by gamma-irradiation
is very active investigate, because there are a lot of advantages of this method: high penetrating power (drugs can be
sterilize in their final containers), low chemical reactivity,
isothermal character of the gamma-rays, and radiosensitivity of microorganism [1]. The knowledge about formation
of paramagnetic centers in drugs during radiosterilization is
still not enough. There is known EPR studies of gammairradiated drugs [2-11], but a lot of antibiotics were not examined so far. Paramagnetic centers in radiosterilized antibiotics may be responsible for toxic effects in organism.
In this work we examined radiosterilized antibiotic,
which is often used in dermatology [12-14]. The aim of this
8
Słowa kluczowe: centra paramagnetyczne, EPR, nasycenie mikrofalowe, promieniowanie gamma, erytromycyna
work was to study concentrations of paramagnetic centers
and spin-lattice interactions in gamma-irradiated erythromycin. Evolution of paramagnetic centers during storage of
this antibiotic after irradiation was described. We compared
microwave saturation of erythromycin’s EPR spectra for
different times after samples irradiation.
2. Material and Methods
2.1. Sample Characterization
Radiosterilized erythromycin was studied. Chemical
structure of its molecule is presented in Figure 1 [14]. Erythromycin is a macrolide antibiotic produced from a strain of
actinomycetes Saccaropolyspora erythraea. It interferes
netic modulation of 100 kHz. Microwave frequency was
measured with MCM 101 recorder.
We used ultramarine as the reference for paramagnetic
centers concentration. Additionally we measured for ultramarine and for sample EPR signals of the second reference-a
ruby crystal.
Concentration of paramagnetic centers in the sample was
calculated as follow:
Fig. 1. Chemical structure of
erythromycin [14].
with protein synthesis in sensitive bacterial cells [1214]. Erythromycin binds to the 23S rRNA molecule in
the 50S of the bacterial ribosome, blocking the exit of the
growing peptide chain thus inhibiting the translocation
of peptides. Erthromycin is active against aerobic and
anaerobic gram-positive cocci, Mycoplasma pneumoniae, Legionella and Bordetells pertussis. Erythromycin
is also used for skin infections. Erthromycin is available
in enteric - coated tablets, slow release capsules, oral
suspensions, ophthalmic solutions, ointments, gels and
injections [12]. Paramagnetic centers may be important
in radiosterilized erythromycin existing in gels or injections.
In this work erythromycin tablets were irradiated with
a 60Co source. On the basis of Polish and European Norms
[15] of radiosterilization erythromycin was given a dose of
25 kGy.
2.2. EPR Measurements
EPR spectra of erythromycin in solid state at room temperature were obtained as first-derivative curves. The measurements we performed by the use of an X-band (9.3 GHz)
electron paramagnetic resonance spectrometer with mag-
N = nu [WuAru/Pu][Pp/(WpArpmp],
where: nu - amount of paramagnetic centers in reference
(ultramarine); Pu, Pp - areas under the absorption curve for
ultramarine and sample, respectively; Wu, Wp - receiver gain
for ultramarine, and sample, respectively; Aru, Arp - receiver
gains for ultramarine, and sample, respectively; mp - mass of
the sample. Double integration was done for calculation of
area under the absorption curves.
Changes of integral intensity of erythromycin’s EPR
line with increasing time of storage after irradiation were
analyzed. Concentration of paramagnetic centers is proportional to integral intensity.
Influence of microwave power from 0.7 to 70 mW on
amplitudes and linewidths of EPR spectra was examined.
Correlations between parameters of EPR lines and microwave power let us to determine type of paramagnetic centers
distribution in the sample. Decrease of EPR amplitudes and
broadening of EPR lines are characteristic for their homogenous distribution in sample [16]. For inhomogeneous distribution amplitudes do not change with microwave power
after reaching the maximum and linewidths remain constant
independently of microwave power [16]. We compared microwave saturation of erythromycin’s EPR lines at 1, 9, and 37
days after gamma-irradiation. Changes in microwave saturation
of EPR lines reflect changes of chemical structure of sample.
3. Results
Fig. 2. EPR spectra of gamma-irradiated erythromycin for times after
irradiation: 3, 5, 10, and 15 days. The data are presented for attenuation of 15 dB.
EPR spectra were not obtained for the original erythromycin, while strong paramagnetism characterized the
studied gamma-irradiated antibiotic. For gamma-irradiated
erythromycin we observed complex EPR spectra. Exemplary EPR spectra of erythromycin for 3, 5, 10, and 15 days after irradiation are compared in Figure 2. Paramagnetic centers concentration after 3 hours from irradiation was 5x1019
spin/g. The amount of paramagnetic centers in erythromycin
depends on storage time. Change of integral intensities of
erythromycin’s EPR line with increasing time after sample
irradiation is presented in Figure 3. The integral intensity
strongly decreases during several days after irradiation.
From 10 days after radiosterilization only slow decrease of
erythromycin’s EPR intensity we detected. The examined
gamma-sterilized antibiotic sample remains paramagnetic
even after 80 days of storage.
Lineshape of the analysed EPR spectra strongly depends
on microwave power. Influence of microwave power on
erythromycin’s EPR spectra 3 hours after drug irradiation
is shown in Figure 4. Complex character of the spectra is
not so visible at higher microwave powers (attenuation: 0.5
dB).
9
Farm Przegl Nauk, 2009,9
Fig. 3. Changes of integral intensity of erythromycin’s EPR line with
increasing time of storage after gamma-irradiation.
Influence of microwave power on amplitudes and linewidths of
EPR spectra of erythromycin after 1, 9, and 37
days of gamma-irradiation is presented in Figures 5 and 6, respectively. Amplitudes rise with
increasing of microwave
power and decrease for
higher microwave power
value (Fig. 5). A weak
broadening of EPR lines
with increasing of microwave power was observed
(Fig. 6). Correlations in
Figures 5 and 6 are typical for homogenous distribution of paramagnetic
centers in the sample, so
gamma-irradiation forms
paramagnetic centers in
whole tablet.
While unirradiated
erythromycin presents
no EPR signal, for gamsamples
Fig. 4. Influence of microwave power ma-irradiated
on EPR spectra of gamma-irradiated was observed complex
erythromycin. The spectra were me- EPR spectrum (Fig. 2).
asured 3 hours after irradiation with
Lineshape of the EPR
attenuations 15, 10, 5 and 0.5 dB.
spectra changes with microwave power (Fig. 4)
and with storage time (Fig. 2). Complex shape of resonance
absorption curve indicates the presence of more than one
type of free radical species induced by gamma radiation in
erythromycin. For the studied drug we obtained apparent
g value of 2.0033. Unpaired electrons in free radicals in
irradiated erythromycin are probably localized on oxygen
atoms. It seems that glicoside bounds are especially sensitive for gamma irradiation. Probably rupturing of glicoside
bounds forms oxygen free radicals in gamma-irradiated
erythromycin.
10
Free radicals in gamma-irradiated erythromycin are not
stable (Fig. 3). The number of free radicals decay was observed. Decrease of integral intensity of erythromycin’s EPR
line/free radicals concentration is caused by interactions with
oxygen molecules in the sample environment. This effect is
the most intensive during the first stage after sterilization. It
can be concluded that radiosterilized erythromycin should be
used in therapy after several days from gamma-irradiation.
Radiosterilized antibiotic should contain the lowest amount
of free radicals. Free radicals of sterilized antibiotic may be
responsible for toxic effects in organism stimulated by their
reactions with different biological structures.
Continuous microwave saturation of gamma-irradiated
erythromycin’s EPR lines indicates that slow spin-lattice relaxation processes occur in this sample (Fig. 5). EPR lines
of the gamma-irradiated erythromycin saturate at low microwave powers independly on time after irradiation (Fig.
5). EPR lines of the antibiotic saturate at lower microwave
power for longer storage times.
Microwave saturation of EPR lines we examined to check
the hypothesis about changes of erythromycin’s chemical
structure during storage. Time evolution of molecular struc-
Fig. 5. Influence of microwave power on amplitudes of EPR lines of
erythromycin for 1, 9, and 37 days after gamma-irradiation. Mo – total
microwave power (70 mW) produced by klystron, M – microwave
power used during the measurement.
Fig. 6. Influence of microwave power on linewidths of EPR lines of
erythromycin for 1, 9, and 37 days after gamma-irradiation. Mo – total
microwave power (70 mW) produced by klystron, M – microwave
power used during the measurement.
ture and paramagnetic centers system in sterilized drug may be
responsible for negative interactions in organism. As result the
efficiency of erythromycin may be considerably lower.
4. Conclusions
Application of EPR spectroscopy to examination of
gamma-irradiated erythromycin indicates that: 1) Paramagnetic centers homogenously distributed in tablet are formed
during gamma-irradiation of erythromycin. 2) Paramagnetic
centers in irradiated erythromycin are not stable. 3) Slow
spin-lattice relaxation processes exist in irradiated erythromycin. 4) Spin-lattice relaxation time increases with increasing of storage time of the drug what indicates changes
of its chemical structure.
References
1. Basly JP, Basly I, Bernard M. Influence of radiation
treatment on doubutamine. Int J Pharm 1998; 170: 265269.
2. Basly JP, Longy I, Bernard M. ESR identification of radiosterilized pharmaceuticals: latamoxef and ceftriaxone. Int J Pharm 1997: 158, 241-245.
3. Basly JP, Basly I, Bernard M. ESR spectroscopy applied
to the study of pharmaceuticals radiosterylization: cefoperazone. J Pharm Biomed Anal 1998; 17: 871-875.
4. Gibella M i wsp. Electron spin resonance of some irradiated pharmaceuticals. Rad Phys Chem 2000; 58: 69 -76.
5. Varshney L, Dodke PB. Radiation effect studies on anticancer drugs, cyclophosphamide and doxorubicin for radiation
sterilization. Rad Phys Chem 2004; 71: 1103-1111.
6. Fauconnet AL, Basly JP, Berdard M. Gamma radiation
induced effects on isoproterenol. Int J Pharm 1996; 144:
123-125.
7. Basly JP, Basly I, Bernard M. Electron spin resonance
identification of irradiated ascorbic acid: Dosimetry and
influence of powder fineness. Anal Chim Acta 1998;
372: 373-378.
8. Onori S i wsp. ESR identification of irradiated antibiotics:
cephalosporins. Appl Rad Isotop 1996; 47: 1569-1572.
9. Basly JP, Doroux J, Bernard M. Radiosterylization dosimetry by ESR spectroscopy: application to terbutaline.
Int J Pharm 1996; 142: 247-249.
10.Yurus S, Ozbey T, Korkmaz M. ESR investigation of
gamma irradiated sulbactam sodium. J Pharm Biomed
Anal 2004; 35: 971-978.
11. Katušin – Ražem B i wsp. Radiation sterilization of ketoprofen. Rad Phys Chem 2005; 73: 111-116.
12. Kostowski W, Herman ZS. Red. Farmakologia. Podstawy farmakologii. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 2003.
13.Janiec W, Krupińska J. Red. Farmakodynamika. Podręcznik dla studentów farmacji. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 2002.
14. Zejc A, Gorczyca M. Red. Chemia leków. Wydawnictwo
Lekarskie PZWL. Warszawa 2002.
15. Polish Norm PN-EN 552, Warszawa 1999.
16. Wertz JE, Bolton JR. Electron Spin Resonance. Elementary Theory and Practical Applications. Chapman and
Hall. New York, London 1986.
Adres do korespondencji:
dr n. farm. Sławomir Wilczyński
tel. 507 169 625, (32) 364 11 72
e-mail: [email protected]
11
Farm Przegl Nauk, 2009,9 12-17
Modelowe postacie wybranych środków znieczulenia miejscowego.
Cz. I. Charakterystyka postaci farmaceutycznej
Model drug formulations of selected of local anesthetics.
Part I. The characterization of the drug formulation
Monika Balcerkiewicz1, Edmund Grześkowiak1,
Pascal Le Corre2, Maja Ratajczak-Enselme2, Karol Szlufik1
Katedra i Zakład Farmacji Klinicznej i Biofarmacji
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
2
Laboratoire de Pharmacie Galenique et Biopharmacie Université de Rennes
1
Streszczenie
O skuteczności i przydatności terapeutycznej leku
w dużym stopniu decyduje jego postać farmaceutyczna.
Zastosowanie leku w nowoczesnej postaci pozwala na
modyfikację farmakokinetyki substancji leczniczej, co
zazwyczaj skutkuje zwiększeniem skuteczności i bezpieczeństwa stosowania leku. W celu zmniejszenia ryzyka wystąpienia działań niepożądanych oraz modyfikacji
działania farmakologicznego leków z grupy środków
znieczulenia miejscowego zadowalające rezultaty w badaniach przedklinicznych przyniosło wykorzystanie mikrosfer polimerowych.
Celem niniejszej pracy była charakterystyka modelowej
postaci mikrosfer polimerowych z inkorporowanym środkiem znieczulenia miejscowego oraz ocena przydatności
ich dalszego wykorzystania w planowanych badaniach
przedklinicznych.
Otrzymane w procesie suszenia rozpyłowego mikrosfery z inkorporowaną substancją leczniczą tj. bupiwakainą i ropiwakainą, poddano badaniu, które polegało
na charakterystyce powierzchni mikrosfer, ocenie wydajności produkcji i stopnia inkorporacji oraz pomiarze
skumulowanej ilości substancji leczniczej uwolnionej
z mikrosfer w ustalonych przedziałach czasowych.
Wyniki oceny modelowej postaci farmaceutycznej in
vitro, wykazały przydatność zastosowania otrzymanych mikrosfer z inkorporowaną substancją leczniczą
w planowanych badaniach przedklinicznych.
Słowa kluczowe: mikrosfery, PLGA, leki miejscowo
znieczulające, bupiwakaina, ropiwakaina
Wstęp
Obecnie w centrum zainteresowania technologii postaci leku znajdują się nośniki leku o wielkości rzędu nanoi mikrometrów. Wiele z nich znalazło zastosowanie w lecznictwie, dzięki czemu urzeczywistniona została idea leku
wielokopartmentowego. Wśród nich znajdują się liposomy,
emulsje submikronowe oraz nano- i mikrosfery polimerowe
[1, 2].
12
Abstract
It is known that the efficacy and the therapeutic usefulness
of medicine depend on its formulation. The application of
medicine in a modern dosage form allows the modification of active ingredient release, what results in significant
reduction of side effect risk and in prolongation of the
therapeutic effect. To reduce the risk of side effects and
to modify drug activity satisfactory results were obtained
with the use of polymer microspheres.
The aim of the study was the characterization of the modeling drug formulation of polymeric microspheres with
the local anaesthetic and evaluation of the usefulness of
their further utilization in planned preclinical research on
the ground results evaluation in in vitro studies.
As result of the study three types of microspheres with
incorporated local anaesthetics i.e. bupivacaine and ropivacaine were prepared using nebulizationas as a method.
Prepared drug formulations were characterized by measurement of the accumulative quantity of active ingredient
released from investigated microspheres and qualification
of the surface of microspheres, to the evaluation of the
output rate and the degree the incorporation.
Results of the evaluation of the modeling drug formulation in in vitro studies showed the usefulness of prepared
microspheres with incorporated drug in planned preclinical researches with the animal model.
Key words: microspheres, PLGA, local anaesthetics,
bupivacaine, ropivacaine
Nano- i mikrosfery stanowią wielozbiornikowy system leku o charakterze matrycowym. Są to monolityczne, kuliste cząstki o porowatej powierzchni i średnicy
od 1 do 500 μm (nie przekraczającej zazwyczaj kilkudziesięciu mikrometrów) dla mikrosfer (ryc. 1, 2) oraz nie większej
niż 1 µm dla nanosfer. Matryce nano- oraz mikrosfer stanowią różnego rodzaju polimery naturalne bądź syntetyczne
oraz lipidy, w których inkorporowana lub rozpuszczona jest
substancja lecznicza [3, 4].
Jak dotąd najszersze zastosowanie w lecznictwie znalazły mikrosfery wykorzystujące biodegradowalne, syntetyczne polimery kwasu polimlekowego oraz kopolimery kwasu
mlekowego i glikolowego (PLGA). Ich średnica wynosi
zwykle od 10 do 50 μm, co pozwala na podskórne i domięśniowe podanie leku w tej postaci. Nanocząstki, ze względu
na swoje rozmiary, mogą być również podane dożylnie, np.
bezpośrednio do tkanki nowotworowej celem wywołania
chemoembolizacji [1, 4].
Metody otrzymywania mikrosfer dobierane są w zależności od zastosowanej matrycy oraz właściwości inkorporowanej w niej substancji leczniczej [5].
Zwykle dąży się do maksymalnego zamykania substancji w mikrosferach w warunkach, które gwarantują trwałość
substancji leczniczej w procesie inkorporacji. Efektywność
inkorporacji jest jednak zmienna i zależy od rodzaju zastosowanej metody otrzymywania mikrosfer. Dodatkowe trudności natury technologicznej stwarza konieczność uzyskania
mikrosfer o powtarzalnych parametrach, zapewniających
inkorporowanie leku w odpowiedniej dawce oraz właściwy
profil uwalniania [4].
Substancja lecznicza z matrycy polimerowej uwalniana
jest zazwyczaj powierzchniowo, w efekcie powierzchniowej erozji matrycy polimerowej i jednoczesnej dyfuzji leku.
Ryc. 1. Mikrosfery - obraz z mikroskopu elektronowego [16]
substancja lecznicza
matryca polimerowa
Ryc. 2. Schemat struktury wewnętrznej mikrocząstek o budowie matrycowej
Tabela I. Właściwości i czas degradacji polimerów [7]
Typ polimeru
Tg (Cº)
Czas degradacji
PGA
35 ~ 40
2-3 miesiące
PLA (L forma)
60 ~ 65
> 2 lat
PLA (D i L forma)
50 ~ 60
12-16 miesięcy
PLGA
45 ~ 55
1-6 miesięcy
Czas uwalniania substancji leczniczej jest różny (od 1 do 4
miesięcy) i zależy od rodzaju użytego polimeru (tab. I).
Tempo hydrolizy łańcuchów polimerowych w największym stopniu zależy od pH i temperatury, dlatego
w warunkach in vivo obserwuje się minimalne różnice prędkości rozpadu mikrosfer aplikowanych różnymi drogami.
W przypadku poliestrów hydroliza enzymatyczna odgrywa
niewielką rolę w procesie rozpadu, większą natomiast dla
amorficznych odmian polimerów [6].
Ogromne znaczenie w technologii nowych postaci leku
mają właściwości substancji pomocniczych wykorzystywanych w ich otrzymywaniu. Biozgodność substancji, z których
wykonywane są matryce mikrosfer, decyduje o bezpieczeństwie stosowania tych postaci leku. Wieloletnie doświadczenie kliniczne oraz liczne badania potwierdziły przydatność
polimerów hydroksykwasów jako materiału implantacyjnego. Mikrosfery wykonane z polimerów mlekowego (PLA),
glikolowego (PGA) oraz kopolimerów PLGA są całkowicie
bioresorbowalne i bardzo dobrze tolerowane przez organizm. Mogą powodować łagodny odczyn tkankowy, jednak
bez miejscowego i uogólnionego stanu zapalnego [7].
Mikrosfery stanowiąc układy mikrokompartmentowe
znalazły zastosowanie głównie jako pozajelitowe formy leku
o przedłużonym i kontrolowanym uwalnianiu. W zależności
od wielkości cząstek możliwe jest podanie ich różnymi drogami. Zawieszone w odpowiednim środowisku mikrosfery wielkości 1-8 μm lub mniejsze od 1 μm, tzw. nanosfery, są odpowiednie do podania dożylnego, mikrosfery o wielkości cząstek
10-150 μm mogą być podane podskórnie lub domięśniowo,
zaś o średnicy 100-500 μm mogą służyć do chemoembolizacji naczyń [1, 8].
Nanosfery, czyli cząstki o wielkości poniżej 1 μm są
testowane jako potencjalne nośniki stosowanych doustnie
leków peptydowych. Wyniki badań potwierdziły penetrację
mikrocząstek o średnicy 200-500 nm w głąb błony śluzowej
przewodu pokarmowego, zapewniającą ochronę leku przed
działaniem enzymów proteolitycznych oraz soku żołądkowego [1, 8].
Zmodyfikowany profil uwalniania substancji leczniczej
z mikrosfer sprawia, że mogą one stanowić korzystny system dozowania leku w leczeniu chorób przewlekłych, a także dla leków charakteryzujących się małą biodostępnością
po podaniu doustnym, bądź krótkim biologicznym okresem
półtrwania [9]. Szczególne cechy biofarmaceutyczne sprawiają, że mikrosfery zapewniają dłuższy czas uwalniania
substancji leczniczej niż zawiesiny czy roztwory o zwiększonej lepkości, a w porównaniu z implantami dodatkowo
ich przewaga polega na możliwości iniekcyjnej aplikacji
bez ingerencji chirurgicznej [10].
Wiele podawanych w formie mikrosfer substancji leczniczych zostało pozytywnie ocenionych w doświadczeniach
13
Tabela II. Preparaty farmaceutyczne stosowane w postaci mikrosfer polimerowych [13, 18]
Preparat
(Producent)
Lupron-Depot®
(Tap)
Risperdal®Consta® (Janssen)
Vivitrol®
(Cephalon & Alkermes)
Sandostatin LAR® (Novartis)
Substancja
lecznicza
Typ mikrosfer
leuprorelina
PLA; PLGA
rysperydon
PLGA
endometrioza, nowotwór
prostaty
schizofrenia
naltrekson
PLGA
uzależnienie alkoholowe
4 tyg.
oktreotyd
PLGA
akromegalia
4 tyg.
Nutropin Depot® (Genentech)
somatropina
PLGA
zaburzenia wzrostu
2, 4 tyg.
Trelstar Depot®
(Watson Pharma)
tryptorelina
PLGA
endometrioza,
nowotwór prostaty
4 tyg.
Somatuline PR®
(Beaufour Ipsen)
lanreotyd
PLGA
akromegalia
14 dni
Suprecur MP®
(Aventis)
buserelina
PLGA
endometrioza
4 tyg.
na zwierzętach lub badaniach klinicznych, wśród nich znajdują się leki z grupy środków znieczulenia regionalnego
[11, 12]. Prawdopodobnie z powodu niedostatecznej wiedzy
na temat wpływu mikrosfer na tkanki, niebezpieczeństwa
kumulacji w miejscu wstrzyknięcia, małej zdolność inkorporacji substancji leczniczej oraz trudnej technologii, tylko
niewielka część z nich została zarejestrowana na rynku farmaceutycznym. Wśród nich przeważają preparaty zawierające mikrosfery przeznaczone do podskórnego lub domięśniowego podania w formie zawiesiny (tab. II) [4, 13].
Materiał i metody
Badane mikrosfery otrzymano we współpracy z Laboratoire de Pharmacie Galenique et Biopharmacie Université de Rennes, France, według opisywanej metody suszenia
rozpyłowego [14].
Otrzymane mikrosfery polimerowe z inkorporowaną
substancją leczniczą (bupiwakaina lub ropiwakaina), poddano ocenie in vitro, w tym badaniu kinetyki uwalniania
substancji leczniczej. Powyższe badania przeprowadzono
również we współpracy z Laboratoire de Pharmacie Galenique et Biopharmacie Université de Rennes, France, według
opisanych poniżej metod.
Materiał
Materiał do badań stanowiły, otrzymane metodą suszenia
rozpyłowego, mikrosfery o następującym składzie: I seria MSBP-1 40/60 - 1800 mg (60 cz.) polimer Medisorb 50/50
low IV oraz 1200 mg (40 cz.) zasady bupiwakainy; II seria
- MSBP-2 40/60 - 1620 mg polimer Medisorb 50/50 low IV
+ 180 mg (10%) polimer R 104 (60 cz.) oraz 1200 mg (40 cz.)
zasady bupiwakainy; III seria - MSRP 40/60 - 1800 mg (60 cz.)
polimer RG503H oraz 1200 mg (40 cz.) zasady ropiwakainy.
Zastosowanie
Czas działania
12, 16 tyg.
2 tyg.
dźwięków. Każda seria mikrosfer była wstępnie sprawdzana
pod mikroskopem optycznym, co pozwoliło na zaobserwowanie ewentualnych agregatów i włóknistych wypustek
filamentowych. Następnie powierzchnia mikrosfer była
obserwowana pod mikroskopem elektronowym. Kroplę
zawiesiny umieszczano na powierzchni szklanej i suszono
w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadzano metalizację. Tak przygotowane próbki gotowe były do obserwacji [15].
1.2. Rozrzut wielkości mikrosfer
Liofilizowane próbki mikrosfer przed pomiarem zostały zawieszone w kilku mililitrach 0,1% roztworu Tweenu.
Następnie tak przygotowaną zawiesinę mikrosfer umieszczano w zbiorniku granulometru napełnionego 75 ml wody
destylowanej. Pomiarów średnicy dokonywano również po
1, 2 i 3 min. działania ultradźwięków, mogących wpływać
na dezintegrację mikrosfer [15].
2. Wydajność produkcji i stopień inkorporacji substancji
leczniczej
2.1. Wydajność produkcji
Celem określenia wydajność produkcji, mikrosfery należało zebrać do odpowiedniego, wytarowanego naczynia.
Następnie mikrosfery były ważone, a masę wyrażano w procentach w stosunku do masy całkowitej użytego do produkcji polimeru i substancji leczniczej [15].
2.2. Stopień i skuteczność inkorporacji
Stopień inkorporacji wyznaczony doświadczalnie odpowiada ilości substancji leczniczej efektywnie obecnej
w mikrosferach (wyrażonej w procentach) [15].
Metody
1. Charakterystyka powierzchni mikrosfer i rozrzut ich
wielkości
Stopień inkorporacji (%): oznaczona substancja lecznicza
(g) x 100 / substancja lecznicza użyta do produkcji mikrosfer (g).
Skuteczność inkorporacji (%): stopień inkorporacji
x 100 / teoretyczny stopień inkorporacji.
1.1. Charakterystyka powierzchni mikrosfer
Mikrosfery otrzymane w postaci suchej, zostały zawieszone w 0,1% roztworze Tweenu i poddane działaniu ultra-
Próbkę otrzymanych mikrosfer dokładnie odważano, tak
aby zawierała ok. 10 mg substancji leczniczej. Następnie
rozpuszczano ją w dichlorometanie celem rozpuszczenia
14
Tabela III. Parametry charakteryzujące badane mikrosfery polimerowe z bupiwakainą i ropiwakainą [15]
Seria
mikrosfer
Seria I
Seria II
Seria III
Wydajność
produkcji [%]
46
52
58
D [4,3] [μm]
D (v, 0.5) [μm]
8,88
11,10
8,41
6,61
8,91
6,45
maniu charakteryzują się niewielkimi rozmiarami, po liofilizacji łatwo jest otrzymać jednorodne zawiesiny w wodzie,
a wydajność produkcji należy do jednej z wyższych. Ponieważ polimer ten znacznie łatwiej tworzy zawiesinę, stąd
w procesie otrzymywania badanych mikrosfer wykorzystano głównie opisywany polimer z dodatkiem lub bez polimeru R 104 (ryc. 3) [15].
Tabela IV. Stopień i skuteczność procesu inkorporacji oraz parametry kinetyczne uwalniania bupiwakainy i ropiwakainy z badanych mikrosfer
in vitro [15]
Seria mikrosfer
Seria I
Seria II
Seria III
Stopień inkorporacji [%]
teoretyczny
eksperymentalny
40
40
40
38,24
38,59
40,48
Skuteczność
inkorporacji
[%]
95,60
96,48
101,2
T 10%
[h]
T 50%
[h]
T 90%
[h]
0,05
0,02
0,16
1,75
0,25
8,17
-12
--
polimeru. Substancję leczniczą poddawano ekstrakcji do
fazy wodnej, a następnie oznaczano zaadaptowaną i zwalidowaną metodą HPLC [15].
3. Kinetyka uwalniania substancji leczniczej in vitro
Substancja lecznicza uwalniana była do roztworu wodnego (900 ml) o temp. 37°C, zawierającego 0,2% NaCl
i doprowadzonego do pH 2, za pomocą HCl. Objętość ta
oraz stałe pH pozwalały na utrzymanie, w każdym momencie prowadzonego doświadczenia, stężenia substancji leczniczej poniżej stanu nasycenia oraz maksymalną szybkość
rozpuszczania wewnętrznego.
Urządzenie z wirującą łopatką było połączone z systemem wymuszonej cyrkulacji. Roztwór był pobierany za pośrednictwem rurek zaopatrzonych w filtry. Dzięki pompie
perystaltycznej doprowadzały one próbkę do kuwet przepływowych spektrofotometru. Po dokonaniu pomiaru absorbancji pobrana próbka wracała do zbiornika z roztworem.
Dokładnie odważoną ilość mikrosfer z substancją czynną, zawierającą około 10 mg substancji leczniczej zawieszano (przy użyciu ultradźwięków) w 50 ml wody destylowanej.
Następnie zawiesinę dodawano do roztworu reakcyjnego.
Próbki pobierano według zaprogramowanego cyklu: przez
pierwszą godzinę co 5 min, przez kolejną godzinę co 15 min,
|w czasie do 6 h w odstępach półgodzinnych oraz co godzinę
w czasie do 24 h.
Każda z serii mikrosfer zawierających bupiwakainę była
badana trzykrotnie, natomiast seria III została poddana sześciokrotnemu badaniu. Otrzymane wyniki analizowano przy użyciu
programu informatycznego Idis EE. Parametrami charakteryzującymi kinetykę uwalniania bupiwakainy i ropiwakainy in vitro
były czasy T 10%, T 50% oraz T 90%, po których uwolnieniu
uległo odpowiednio 10, 50 i 90% substancji leczniczej [15].
Wyniki
Medisorb 50/50 jest kopolimerem kwasu mlekowego
i kwasu glikolowego w stosunku molowym 50:50, masie
cząsteczkowej 63 kDa i strukturze amorficznej. Charakteryzuje się dobrą rozpuszczalnością w dichlorometanie, octanie etylenowym, acetonie i tetrahydrofuranie, natomiast nie
rozpuszcza się w wodzie, metanolu i eterze. Wolne mikrosfery otrzymane przy udziale polimeru Medisorb 50/50 low
posiadają korzystne parametry. Bezpośrednio po ich otrzy-
Ryc. 3. Zdjęcie z mikroskopu elektronowego mikrosfer polimerowych z bupiwakainą [17]
Wyniki oceny badanych postaci leku in vitro oraz badania kinetyki uwalniania substancji leczniczej z badanych
mikrosfer in vitro zamieszczono w tabeli III i IV oraz dodatkowo w postaci wykresów (ryc. 4 i 5).
Dyskusja
Celem uzyskania mikrosfer polimerowych z bupiwakainą (seria I, seria II) oraz ropiwakainą (seria III) zastosowano
metodę suszenia rozpyłowego. Zaletą tej metody jest jednoetapowa technologia otrzymywania mikrosfer, ułatwiająca
przeprowadzenie procesu w warunkach aseptycznych oraz
umożliwiająca przystosowanie tej techniki dla potrzeb przemysłu. Metoda suszenia rozpyłowego jest procesem o wysokim stopniu inkorporacji, a otrzymane w ten sposób mikrosfery mają niewielką średnicę [4]. Jej wadą jest natomiast
aglomeracja powstających mikrocząstek i straty poniesione
w wyniku odzyskiwania mikrosfer. Ponadto suszenie rozpyłowe prowadzone bez dodatku środka powierzchniowo
czynnego utrudnia jednorodną dyspersję mikrosfer przed
ich podaniem. Zastosowanie metody suszenia rozpyłowego
pozwoliło na otrzymanie mikrosfer polimerowych charakteryzujących się wysokim stopniem inkorporacji substancji
leczniczych (tabela IV) oraz niewielkimi rozmiarami (tabela
III). Wydajność produkcji badanych mikrosfer otrzymanych
15
wpłynęło na szybsze uwolnienie inkorporowanej w nim bupiwakainy i wyniosło 90% po 12. godzinach prowadzenia
badania uwalniania substancji czynnej in vitro. Dodatkowo,
wykonane za pomocą mikroskopu elektronowego zdjęcia
otrzymanych mikrosfer wykazały obecność grubych, filamentowych wypustek pochodzących z bupiwakainy. Fakt
ten może tłumaczyć większą dynamikę procesu uwalniania
substancji czynnej in vitro z mikrosfer serii II. Zastosowanie polimeru RG503H wpłynęło z kolei na znaczne wydłużenie wolnej fazy uwalniania ropiwakainy z mikrosfer
serii III i sprawiło, że po około 8 godzinach prowadzenia
obserwacji uwolnieniu uległo zaledwie 50% substancji
leczniczej.
Ryc. 4. Profile średnie (n=3) skumulowanego uwalniania bupiwakainy z mikrosfer z polimeru Medisorb 50/50 low IV o stosunku substancji czynnej do polimeru 40/60 jako funkcja stężenia polimeru R
104 [15]
80
uwolniona ropiwakaina (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
cz as (h)
Ryc. 5. Profile (n=6) skumulowanego uwalniania ropiwakainy z mikrosfer z polimeru RG503H o stosunku substancji czynnej do polimeru 40/60 [15]
metodą suszenia rozpyłowego wahała się w granicach 4658%. Ich średnia średnica wahała się w granicach od 8,41
do 11 μm, natomiast wielkość cząstki dla której 50% próbki
ma wielkość poniżej, a druga połowa powyżej tej wartości
osiągała wartości od 6,45 do 8,91 μm. Otrzymane mikrosfery były jednak posklejane i tworzyły duże aglomeraty co
w połączeniu z ich rozmiarami mogło mieć wpływ na kinetykę uwalniania substancji leczniczej.
Badanie kinetyki uwalniania bupiwakainy i ropiwakainy
z otrzymanych mikrosfer polimerowych w warunkach in
vitro, pozwoliło na określenie skumulowanej ilości substancji leczniczej uwolnionej z badanych postaci leku. Profile
skumulowanego uwalniania in vitro uzyskane dla wszystkich serii badanych mikrosfer wykazały dwufazowy przebieg procesu uwalniania, z początkową szybką i następującą
po niej wolną fazą uwalniania substancji czynnej. W czasie
24-godzinnego badania uwolnieniu uległo około 70% bupiwakainy z mikrosfer serii I, około 97% substancji czynnej
z mikrosfer serii II oraz około 65% ropiwakainy z mikrosfer serii III (ryc. 4 i 5). Mikrosfery otrzymane z polimeru
RG503H (seria III) bądź mieszaniny polimerów Medisorb
50/50 low IV i R104 (seria II) wykazywały zmodyfikowaną
kinetykę uwalniania w porównaniu z mikrosferami serii I.
Zastosowanie 10% dodatku polimeru R104, będącego polimerem kwasu mlekowego o niskiej masie cząsteczkowej
16
Wnioski
Badane mikrosfery polimerowe z inkorporowaną bupiwakainą lub ropiwakainą spełniają wymogi ich pozajelitowego zastosowania w planowanych badaniach przedklinicznych wykorzystujących model zwierzęcy.
Otrzymane metodą suszenia rozpyłowego mikrosfery
serii I, II i III były posklejane i tworzyły duże aglomeraty co
w połączeniu z ich rozmiarami mogło mieć wpływ na kinetykę uwalniania substancji leczniczej in vitro. Planowane
zastosowanie badanych mikrosfer u zwierząt doświadczalnych wymaga zatem zawieszenia ich w roztworze wodnym,
a następnie poddania krótkotrwałemu działaniu ultradźwięków. Dzięki tym zabiegom możliwe będzie uzyskanie jednolitej dyspersji substancji leczniczej.
Wyniki oceny mikrosfer polimerowych z inkorporowanym środkiem znieczulenia miejscowego w badaniach in vitro wskazują na przedłużone uwalnianie substancji czynnej,
co skonfrontowane zostanie z wynikami zaplanowanych
badań, których celem jest biofarmaceutyczna ocena modelowej postaci mikrosfer polimerowych.
Piśmiennictwo
1. Janicki S. Urzeczywistnienie idei leku wielokompartmentowego, Farm Pol. 1999; 55: 139-148.
2. Müller RH, Mäder K, Gohla S. Solid lipid nanoparticles
(SLN) for controlled drug delivery – a review of the state
of the art, Eur J Pharm Biopharm. 2000; 50: 161-177.
3. Müller R, Hildebrand GE (red.). Technologia nowoczesnych postaci leków. PZWL, Warszawa 1998.
4. Sznitowska M. Technologia mikrocząstek i nanocząstek
jako nośników leku, Farm Pol. 2001; 57: 962-969.
5. Janicki S, Fiebig A, Sznitowska M. Farmacja stosowana.
Podręcznik dla studentów farmacji. PZWL, Warszawa
2002.
6. Suffritti G. Toxicological evaluation of the incorporation of polymers and copolymers based on L-, D- and
D,L-lactide and glycolide, 1997; www.ghimas.it/dentale/documenti/inglese/Toxicological%20Evaluation
(06.09.2006)
7. Shive MS, Anderson JM. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres, Adv Drug Deliv
Rev. 1997; 28: 5-24.
8. Janicki S, Sznitowska M. Kierunki doskonalenia postaci
leku, Farm Pol. 1998; 54: 110-120.
9. Halkiewicz A, Janicki S. Mikrosfery jako postać leku do
podawania pozajelitowego, Farm. Pol. 1995; 51: 836-846.
10.Curley J i wsp. Prolonged regional nerve blockade: Injectable biodegradable bupivacaine/polyester microspheres, Anesthesiology. 1996; 84: 1401-1410.
11.Le Corre P i wsp. Spray-dryed bupivacaine-loaded microspheres: in vitro evaluation and biopharmaceutics of
bupivacaine following brachial plexus administration in
sheep, Int J Pharm. 2002; 238: 191-203.
12.Zhang H i wsp. Bupivacaine-loaded biodegradable poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres I. Optimization of
the drug incorporation into the polymer matrix and modelling of drug release, Int J Pharm. 2008; 351: 244-249.
13.D’Souza SS, Faraj JA, DeLuca PP. A model-dependent
approach to correlate accelerated with real time release
from biodegradable microspheres, AAPS Pharm Sci
Tech. 2005; 6: 553-564.
14.Ratajczak-Enselme M i wsp. Effect of epinephrine on
epidural, intrathecal, and plasma pharmacokinetics of
ropivacaine and bupivacaine in sheep, Br J Anaesth.
2007; 99: 881-890.
15.Ratajczak M. Technologia otrzymywania mikrosfer
z kopolimerów kwasu mlekowego i glikolowego oraz
bupiwakainy. Praca magisterska. Akademia Medyczna
im. Karola Marcinkowskiego, Poznaniu/Rennes 2002.
16.Saltzman WM, Olbricht WL. Building Drug Delivery into Tissue Engineering, Nature Reviews 2002; 1:
177-186.
17.Le Corre P i wsp. Spray-dryed bupivacaine-loaded microspheres: in vitro evaluation and biopharmaceutics of
bupivacaine following brachial plexus administration in
sheep, Int J Pharm. 2002; 238: 191-203.
18.Heading CE. Vivitrex (Alkermes/Cephalon), Curr Opin
Investig Drugs. 2006; 7:81-88.
dr n. farm. Monika Balcerkiewicz
Katedra i Zakład Farmacji Klinicznej i Biofarmacji UM w Poznaniu
ul. Św. Marii Magdaleny 14, 61-861 Poznań, tel. (61) 668 78 53
17
– stale aktualny problem farmakoterapii
Drug neurotoxicity
– current problem of pharmacotherapy
Agnieszka Skotnicka, Edyta Szałek, Edmund Grześkowiak
Katedra i Zakład Farmacji Klinicznej i Biofarmacji,
Wydział Farmaceutyczny
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Streszczenie
Neurotoksyczność jako polekowe uszkodzenie układu nerwowego stanowi nadal istotny problem kliniczny ograniczający stosowanie wielu leków. Polekowe objawy neurologiczne dotyczyć mogą ośrodkowego, jak i obwodowego
układu nerwowego. Mogą wystąpić na początku terapii
jak i w trakcie przewlekłego stosowania leku, powodując
konieczność jego odstawienia z ewentualną próbą ponownego włączenia po ustąpieniu objawów. W celu redukcji
powikłań neurologicznych terapii istotne jest zatem zdefiniowanie czynników ryzyka (np. wiek, choroby towarzyszące jak np. neuropatia cukrzycowa), unikanie połączeń leków wspólnie uszkadzających komórki nerwowe
oraz opracowywanie schematów postępowania w zakresie
modyfikacji leczenia u pacjentów z obserwowanymi objawami neurotoksyczności. Znajomość patomechanizmu
powikłań neurotoksycznych pozwala skutecznie poszukiwać substancji o działaniu neuroprotekcyjnym. Nowe kierunki postrzegania neurotoksyczności nabierają większego
znaczenia w kontekście globalnych zmian zachodzących
w populacji jak wydłużenie życia, a obserwowana dziś
możliwość całkowitego wyleczenia wielu chorób koreluje ze zwiększeniem bezpieczeństwa terapii między innymi przez zapobieganie działaniom ubocznym leków oraz
opracowanie efektywnych metod postępowania w przypadku ich wystąpienia. Celem pracy jest przegląd współczesnych doniesień dotyczących mechanizmu i diagnostyki neurotoksyczności oraz neuroprotekcji.
Abstract
Neurotoxicity as a drug-induced toxicity against nervous
system is a major clinical complication limiting patient’s
pharmacotherapy. Neurological symptoms may involve
central and peripheral nervous system and may be observed at the start or during drug therapy leading to drug
discontinuation with a possibility of drug reintroduction
after symptoms resolved. To reduce the incidence of therapy complications, it is important to identify and understand risk factors (i.e. age, comorbidities such as diabetes), to avoid the use of drug with similar toxicity and to
develop effective methods of prevention and treatment of
neurotoxicity. Understanding neurotoxicity at the molecular and cellular levels may help to discover and apply
neuroprotective agents. New directions in understanding
neurotoxicity come into prominence in a context of global population changes such as life prolongation, and
observed possibility of complete cure for many diseases
correlates with increased pharmacotherapy safety due to
adverse reactions prevention and development of effective
management of side effects. The aim of this work was to
present the results of current studies on pathomechanism
of neurotoxicity, assessment and management of neuropathic complications.
Key words: neurotoxicity, neurotoxic agents, neuropathy,
neuroprotective agents
Słowa kluczowe: neurotoksyczność, substancje neurotoksyczne, neuropatia, substancje neuroprotekcjne
Neurotoksyczność jest często występującym działaniem niepożądanym wielu leków i prowadzi do modyfikacji
dawkowania lub przerwania farmakoterapii nawet u 20%
pacjentów onkologicznych. Jako powikłanie terapii może
objawiać się ciężkimi zaburzeniami świadomości, drgawkami, chorobą niedokrwienną mózgu, zaburzeniem słuchu
czy neuropatią. W większości przypadków neurotoksyczność obserwowana jest w postaci neuropatii obwodowej,
co może wynikać w faktu, iż większość leków z trudem
przenika przez barierę krew-mózg [1, 2]. Neurotoksyczność
może dotyczyć określonych leków, schematów leczenia jak
18
i pacjentów o szczególnej wrażliwości i odpowiedzi na ksenobiotyk [3].
Za substancje neurotoksyczne uważa się substancje, głównie egzogenne, które wywołują zmiany patologiczne w komórkach nerwowych o określonym fenotypie (np. nerwy dopaminergiczne) lub w zespole neuronów o wspólnych cechach (np.
neurony zawierające receptory kainianowe) [4]. Substancje
neurotoksyczne lub ich metabolity mogą inicjować apoptozę,
powodować nekrozę i w efekcie prowadzić do upośledzenia
funkcji komórki nerwowej lub jej śmierci. Substancje neurotoksyczne mogą wywoływać wyłącznie zmiany behawioral-
Tabela I. Oznaczanie wskaźnika efektu neurotoksycznego
1. Ocena strukturalnych i patomorfologicznych końcowych efektów uszkodzenia neuronu
Miejsce uchwytu
Zmiana wywołana neurotoksyną
Neurotoksyna
ciało neuronu
neuropatia
rtęć
akson (część dystalna)
aksonopatia dystalna
akrylamid, dwusiarczek węgla
2. Określenie neurochemicznych końcowych efektów uszkodzenia
Miejsce uchwytu
Neurotoksyna
zaburzenie równowagi jonowej:
inhibicja przenikania Na do wnętrza neuronu
tetradoksyna
hamowanie uwalniania neurotransmiterów
botulina
hamowanie metabolizmu neuronu
cyjanki
3. Określenie neuropatofizjologicznych końcowych efektów uszkodzenia
Miejsce uchwytu
Badanie diagnostyczne
zaburzenia przewodnictwa nerwowo-mięśniowego
elektromiografia (EMG)
zaburzenie widzenia
wzorkowe potencjały wywołane (PEP)
poziom pobudzenia OUN
elektroencefalografia (EEG)
4. Ocena neurologicznych i behawioralnych zmian końcowych efektów uszkodzenia
o zmiany aktywności motorycznej
o zaburzenia czucia, węchu
o drgawki
o zmiany wyników testów neurologicznych diagnostycznych
ne bez zmian morfologicznych, histologicznych czy zmian
w liczbie receptorów lub neurotransmiterów. Należy podkreślić,
iż z tysięcy związków chemicznych zdolnych do wywołania
apoptozy neuronu, termin neurotoksyczność dotyczy głównie
tych związków, których mała ilość w sposób natychmiastowy
lub przewlekły wywołuje zmiany patofizjologiczne [5].
Ekspozycja na liczne, strukturalnie zróżnicowane substancje chemiczne może skutkować istotnymi zmianami
morfologicznymi i czynnościowymi w komórkach nerwowych obwodowego i centralnego układu nerwowego.
W celu opracowania skutecznych sposobów ochrony tkanki nerwowej niezbędne jest poznanie patomechanizmu
działania neurotoksycznego poszczególnych leków [1].
W tym celu prowadzone są liczne badania nad określeniem
wpływu różnych ksenobiotyków na strukturę neuronu (np.
akson), na poszczególne organella komórki nerwowej (np.
mitochondrium) czy na procesy metaboliczne (np. transport aksonalny postępujący). Pomimo znaczących sukcesów tych badań, proces uszkodzenia komórek nerwowych
na poziomie molekularnym i patofizjologicznym dla wielu
neurotoksyn pozostaje niejasny. Główna hipoteza badawcza
zakłada, że neurotoksyny, podobnie jak większość substancji toksycznych, wraz z aktywnymi metabolitami posiadają
właściwości elektrofilowe. Dzięki tym właściwościom są
one zdolne tworzyć wiązania kowalencyjne z centrami nukleofilowymi białek, DNA i RNA, zaburzając ich strukturę
i/lub funkcję. Reakcje addycji białek po ekspozycji na neurotoksyny takie jak insektycydy fosforoorganiczne, uznaje
się jako prawdopodobny mechanizm procesu neuropatologicznego. Większość ksenobiotyków ulega biotransformacji
prowadzącej do powstawania związków o właściwościach
elektrofilowych. Toksyczność powstałych metabolitów
wynika z reakcji z centrami miękkich nukleofili takich jak
białka czy tiole GSH, lub z centrami twardych nukleofili,
jak kwasy nukleinowe. Zależnie od rodzaju elektrofilowości ksenobiotyków można przewidzieć kierunek ich toksyczności. Związki o właściwościach twardych elektrofili
wykazują działanie genotoksyczne, zaś miękkich nukleofili
działanie cytotoksyczne o szerokim spektrum, na przykład
Schorzenie o podobnym
obrazie klinicznym
choroba Minamata
neuropatia obwodowa
Neurotoksyna
ditiodimocznik
dwusiarczek węgla
toluen
na komórki nerwowe (akrylamid), hepatocyty (paracetamol)
czy komórki mięśnia sercowego (allyamina). Reakcje addycji substancji neurotoksycznych z białkami szlaków metabolicznych, składników kompleksów czy białek pośredniczących w procesach takich jak neurotransmisja lub wytwarzanie energii w komórkach nerwowych mogą prowadzić
do zaburzeń struktury III-rzędowej białek. Zmiany w strukturze III-rzędowej białek mogą skutkować zaburzeniem ich
roli w różnych procesach (np. w przewodzeniu aksonalnym
czy uwalnianiu presynaptycznych neurotransmiterów).
W badaniach nad wpływem akrylamidu na komórki nerwowe wykazano, iż w wyniku hamowania aktywacji enzymatycznej glikolizy przez akrylamid, dochodzi do deficytu
energii w aksonach i w konsekwencji do degeneracji włókien nerwowych dalszych [6].
Stosowana obecnie klasyfikacja substancji neurotoksycznych opiera się na charakterze generowanych zmian
patomorfologicznych w komórce nerwowej. Uszkodzenie
komórki nerwowej może dotyczyć:
a) neuronu i jego poszczególnych części (np. cytoplazma – rtęć, jądro – doksorubicyna, części postynaptyczne – glutaminian),
b) otoczki mielinowej (np. daktynomycyna),
c) komórki gwiaździstej (np. kwabaina),
d) komórki śródbłonkowej (np. ołów),
e) aksonu (np. akrylamid).
Określenie miejsca docelowego dla substancji neurotoksycznej w komórce nerwowej pozwala przewidzieć rodzaj powstających zmian chorobowych i zaprojektować ich
odpowiednią diagnostykę oraz wykorzystać właściwości
substancji neurotoksycznych dla ustalania patomechanizmu
uszkodzenia określonych części komórki nerwowej w chorobach neurodegeneracyjnych i neurologicznych [7].
Ocena kliniczna stopnia uszkodzenia komórek nerwowych stanowi ważny element postępowania z efektami neurotoksyczności. Istnieje kilka sposobów pomiaru stopnia
uszkodzenia komórek nerwowych. Jedną z metod jest oznaczanie tzw. wskaźnika efektu neurotoksycznego (Tab. I).
19
Główną wadą tej klasyfikacji jest to, iż oceniane zmiany
patomorfologiczne są punktem końcowym działania neurotoksycznego i tym samym są mało użytecznym wykładnikiem neurotoksyczności. Stąd proponuje się nową klasyfikacją opierającą się na teorii elektrofilowej, która dokładniej
opisuje mechanizm neuropatogenezy.
W praktyce klinicznej najczęściej wykorzystuje się metodę pomiaru zaburzeń neurofizjologicznych. Uszkodzenie
określonych nerwów powoduje zaburzenie ich funkcji.
I tak w diagnostyce neuropatii wzrokowych podstawowym
badaniem elektrofizjologicznym jest badanie potencjałów
powstających w korze wzrokowej mózgu na bodziec wzrokowy
(wzrokowe potencjały wywołane – WPW; visual evoked potential – VEP), w diagnostyce uszkodzenia siatkówki jest to elektroretinografia, a w uszkodzeniu CUN elektroencefalografia [8].
Dla oceny stopnia upośledzenia funkcji układu nerwowego i stwierdzenia obecności zaburzeń neurologicznych
zaleca się przeprowadzanie u pacjentów w wieku podeszłym
przez personel pielęgniarski „testu neurologicznego”. Test
ten jest odpowiednikiem uproszczonego badania neurologicznego i pozwala ocenić poziom świadomości oraz przytomności pacjenta, funkcje czuciowo – sensoryczne (reakcje
na światło, dotyk, ból lub temperaturę), funkcje motoryczne
głównych grup mięśni, funkcje dwunastu nerwów czaszkowych (np. węchowego przez ocenę zdolności pacjenta do
wiernego rozpoznania substancji dzięki jej zapachowi lub
określeniu pola widzenia dla nerwu wzrokowego) [9].
W celu określania stopnia neuropatii obwodowej indukowanej chemioterapią (NOICh; ang.: Chemotherapy Induced
Peripheral Neuropathy – CIPN), której wystąpienie wiąże
się z koniecznością redukcji dawki leków przeciwnowotworowych czy przerwaniem leczenia nawet u 90% pacjentów
[1, 2, 10] w czasie i po chemioterapii, w National Cancer
Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events
(NCITCfAE) opracowano skalę neurotoksyczności. Skala ta
jest narzędziem pomocniczym. Oszacowanie stopnia neurotoksyczności opiera się na wypełnieniu kwestionariusza,
w którym pacjent w skali od 0 (wcale) do 4 (bardzo) ocenia
obecność i nasilenie objawów takich jak:
• drętwienie i mrowienie w dłoniach,
• drętwienie i mrowienie w stopach,
• uczucie dyskomfortu w dłoniach,
• uczucie dyskomfortu w stopach,
• bóle stawów i skurcze mięśni,
• ogólne osłabienie,
• upośledzenie słuchu,
Tabela II. Mechanizm działania i zastosowanie kliniczne najczęściej stosowanych substancji neuroprotekcyjnych
Nazwa związku
Acetylo-L-karnityna
Amifostyna
Gabapentyna
Glutamina
Glutation
Erytropoetyna
Kapsaicyna
Kwas α-liponowy
Neurotropiny (czynnik
wzrostu komórki
nerwowej - NGF)
Trójcykliczne leki
przeciwdepresyjne (TLP)
Wapń i Magnez
Mechanizm działania i zastosowanie kliniczne
o reguluje poziom neurotropowego czynnika wzrostu w OUN oraz proces transkrypcji genu p75NGFR
o skutecznie chroni i leczy neuropatię wywołaną paklitakselem, winkrystyną, cisplatyną
o prolek aktywowany prze błonową fosfatazę alkaliczną, osiągająca wyższe stężenie w zdrowych
tkankach niż w nowotworowych
o posiada właściwości cytoprotekcyjne – zmiatacz wolnych rodników wytwarzanych przez lek
przeciwnowotworowy
o stosowana podczas terapii cisplatyną, cyklofosfamidem
o chemicznie podobna do neuroprzekaźnika (kwasu γ-aminomasłowego) zmniejsza napływ jonów
wapnia do zakończeń nerwowych i redukuje uwalnianie pobudzających neurotransmiterów
o skuteczne leczenia powikłań neuropatii w postaci bólu neuropatycznego
o aminokwas – źródło energii dla szybko proliferujących komórek – spadek stężenia glutaminy wokół
komórki nowotworowej
o stosowana podczas terapii paklitakselem
o tiol uczestniczący w detoksykacji – przeciwutleniacz
o stosowany podczas terapii cisplatyną (zapobiega kumulacji adduktów platyny w zwoju korzenia
grzbietowego)
o hormon wykazujący działanie neuroprotekcyjne na uszkodzone komórki nerwowe
o zapobiega apoptozie i degeneracji aksonalnej (badania na modelu zwierzęcym)
o zmniejsza stężenia substancji P we włóknach czuciowych, odpowiedzialnej za transmisję bólu
neuropatycznego
o redukcja bólu neuropatycznego w cukrzycy, potencjalny kandydat leczenia bólu neuropatycznego
wywołanego chemioterapią
o
o
o
o
o
o
o
o
o
20
zmiatacz wolnych rodników
powoduje poprawę u pacjentów z NOICh wywołaną docetakselem i cisplatyną
Neurotropina 3 i Neurotropina 4/5 - interakcja z receptorem o niskim powinowactwie (p75NGFR) oraz
z receptorem dla kinazy tyrozynowej o wysokim powinowactwie
neuroregeneracja
wzmagają aktywność neuronów adrenergicznych i serotoninergicznych w OUN, co wpływa
modulująco na segmentarne i nadsegmentarne układy nocyceptywne
redukują ból neuropatyczny o około 50%
metabolit oksaliplatyny hamuje zależne od napięcia kanały sodowe oraz chelatuje wapń
podczas terapii oksaliplatyną zmniejszają neurotoksyczność (zaburzenia sensoryczne w obrębie
krtani i gardła)
umożliwiają na stosowanie większej dawki kumulacyjnej oraz wydłużenie czasu trwania terapii
• trudności w zapinaniu guzików,
• trudności w chodzeniu,
• trudności w ocenie kształtu małych przedmiotów
trzymanych w dłoniach.
Agencja NCITCfAE przedstawia ogólną klasyfikację
neuropatii i bólu neuropatycznego, która wyróżnia 5 stopni
neuropatii zależnie od stopnia nasilenia bólu oraz objawów
uszkodzenia włókien ruchowych i czuciowych, uwzględniając stopień zakłócania jakości życia pacjenta jak i farmakoterapię konieczną do kontroli występujących objawów.
W przypadku nasilenia objawów neuropatii w trakcie lub
po terapii wybranymi lekami neurotoksycznymi, NCITCfAE
wskazuje metody ich diagnozy, zasady modyfikacji terapii (redukcja dawki stosowanego leku neurotoksycznego)
i interwencji farmakologicznej (np. gabapentyna dla uśmierzenia bólu), oraz kierunki edukacji pacjenta (np. jakich
dolegliwości można się spodziewać, kiedy powiadamiać
lekarza o nasileniu neuropatii). NCITCfAE dodatkowo sugeruje wdrożenie innych niezbędnych metod postępowania dla
ograniczenia stopnia upośledzenia funkcjonowania pacjenta
(np. kompresy rozgrzewające, masowanie miejsca dotkniętego neuropatią) [11].
Zapobieganie wystąpieniu NOICh można realizować
poprzez redukcję dawki, modyfikację schematu leczenia
czy w skrajnych przypadkach przez wyłączenie leku neurotoksycznego z terapii. W większości przypadków postępowanie to jest mało skuteczne, stąd istnieje potrzeba
poszukiwania innych metod postępowania z NOICh [12].
Negatywnym skutkom działania leków neurotoksycznych
można zapobiec poprzez inhibicję określonego etapu procesu uszkodzenia komórki nerwowej lub/i przez stosowanie
substancji neuroprotekcyjnych [13, 14]. Idealna substancja
neuroprotekcyjna powinna zapewniać skuteczną, swoistą dla
tkanki ochronę przy jednoczesnym braku wpływu na efektywność terapii przeciwnowotworowej [15, 16]. Intensywne
badania nad poszukiwaniem substancji o właściwościach
neuroprotekcyjnych, pozwoliły ustalić, że właściwości te
wykazują zarówno substancje egzogenne jak i endogenne
[4]. Główne grupy substancji neuroprotekcyjnych to substancje chelatujące, antyapoptotyczne, antyoksydacyjne oraz
czynniki neurotropowe (Tab. II). Z wyżej wymienionych grup
największym zainteresowaniem cieszą się czynniki neurotropowe ze względu na to, iż nie tylko chronią komórki nerwowe
przed działaniem substancji toksycznych, ale również powodują ich regenerację. Innym kierunkiem poszukiwania sposobów zapobiegania neurotoksyczności są badania genetyczne,
polegające na identyfikacji genotypu pacjentów ze zwiększoną wrażliwością na neurotoksyny, przejawiającą się wyższym
ryzykiem wystąpienia neuropatii obwodowej [14].
Nowe kierunki postrzegania neurotoksyczności nabierają większego znaczenia w kontekście globalnych zmian
zachodzących w populacji jak wydłużenie życia czy wzrost
stopnia wyleczalności chorób. Obserwowana dziś coraz
częściej możliwość całkowitego wyleczenia wielu chorób
koreluje ze zwiększeniem bezpieczeństwa terapii między
innymi przez zapobieganie skutkom działań ubocznych
leków i opracowanie efektywnych metod postępowania w
przypadku ich wystąpienia.
Piśmiennictwo
1. James SE, Burden H, Burgess R, Xie Y, Yang T, Massa
SM, Longo FM, Lu Q. Anti-cancer drug induced neurotoxicity and identification of Rho pathway signalling modulators as potential neuroprotectants. Neurotoxicology
2008; 29: 605-12.
2. Fischer SJ, Podratz JL, Windebank AJ. Nerve growth factor rescue of cisplatin neurotoxicity is mediated through the
high affinity receptor: studies in PC12 cells and p75 null
mouse dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 2001; 308: 1-4.
3. Esiri MM. Ageing and the brain. J Pathol. 2007; 211: 181-7.
4. Segura-Aguilar J, Kostrzewa RM. Neurotoxins and neurotoxicity mechanisms. An overview. Neurotox Res. 2006; 10: 263-87.
5. Segura Aguilar J, Kostrzewa RM. Neurotoxins and
neurotoxic species implicated in neurodegeneration.
Neurotox Res. 2004; 6: 615-30.
6. LoPachin RM, DeCaprio AP. Protein adduct formation
as a molecular mechanism in neurotoxicity. Toxicol Sci
2005; 86: 214-25.
7. Spencer PS, Schaumburg HH. Classification of neurotoxic disease: a morphological approach. In Experimental
and Clinical Neurotoxicology. Spencer PS, Schaumburg
HH, eds., Baltimore, Williams, and Watkins, 92-9.
8. Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. Federal
Register 1998; 63: 26926-26954, EPA/630/R-95/001F.
9. Zang SM, Allender JA, eds. Home Care of the Elderly.
Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 1999.
10.Quasthoff S, Hartung HP. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy. J Neurol 2002; 249: 9-17.
11. Tariman JD, Love G, McCullagh E, Sandifer S. Peripheral neuropathy associated with novel therapies in patients with multiple
myeloma: consensus statement of the IMF Nurse Leadership
Board. Clinical Journal of Oncology Nursing 2008; 12: 29-35.
12.Cavaletti G, Marmiroli P. The role of growth factors in
the prevention and treatment of chemotherapy-induced
peripheral neurotoxicity. Curr Drug Saf 2006; 1: 35-42.
13.Dunlap B, Paice JA. Chemotherapy-induced peripheral
neuropathy: A need for standardization in measurement.
J Support Oncol 2006; 4: 398-9.
14.Ocean AJ, Vahdat LT. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy: pathogenesis and emerging therapies.
Support Care Cancer 2004; 12: 619-25.
15.Links M, Lewis C. Chemoprotectants: a review of their
clinical pharmacology and therapeutic efficacy. Drugs
1999; 57: 293-308.
16.van den Bent MJ. Prevention of chemotherapy-induced
neuropathy: leukemia inhibitory factor. Clin Cancer Res
2005; 11: 1691-3.
17.Skotnicka A, Grześkowiak E. Substancje neuroprotekcyjne o potencjalnym zastosowaniu w neuropatii obwodowej
indukowanej chemioterapią. Farm Współ 2009; 2: 36-41.
mgr farm. Agnieszka Skotnicka
Katedra i Zakład Farmacji Klinicznej i Biofarmacji,
Wydział Farmaceutyczny
Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego
ul. Marii Magdaleny 14, 60-861 Poznań
tel. 61 668 78 65, e-mail: [email protected]
21
Przeciwnowotworowe oraz cytotoksyczne działanie propolisu
The anticancer and cytotoxic activity of propolis
Robert Kubina1, Agata Kabała-Dzik1, Robert D. Wojtyczka2, Ewa Szaflarska-Stojko1, Paweł Tylka1
Katedra i Zakład Patologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
2
Katedra i Zakład Mikrobiologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
1
Streszczenie
Propolis był używany w medycynie ludowej od wieków. Dynamiczny rozwój nauk analitycznych umożliwił
dokładne poznanie właściwości i składu chemicznego
produktów pszczelich. Konsekwencją badań nad właściwościami produktów pszczelich było wyizolowanie
i standaryzacja substancji biologicznie czynnych w nich
zawartych. Propolis jest naturalnym produktem pochodzącym z roślin zbieranym przez pszczołę miodną. Propolis i jego ekstrakty posiadają właściwości biologiczne
takie jak: przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, przeciwzapalne oraz przeciwnowotworowe. Analiza chemiczna
przy użyciu chromatografii gazowej połączonej z spektrometrią mas wykazała obecność około 150 polifenolowych
substancji zawierających miedzy innymi flawonoidy
i kwas cynamonowy. Istnieje wiele doniesień dotyczących
właściwości farmakologicznych propolisu, także przeciwnowotworowych. Ester fenyloetylowy kwasu kawowego
(CAPE) zawarty w propolisie jest naturalnym inhibitorem
NF-kappaB posiadającym właściwości przeciwnowotworowe.
Abstract
Propolis has been used in folk medicine for centuries.
Dynamical development of analytical sciences enabled
precise recognition of features and chemical composition
of bee products. Consequences of research on the bee products had been extracting and standardization of bioactive
substances therein. Propolis is a natural product derived
from plant resins collected by honeybees. The propolis
and his extract are known to have biological effects such
as antibiotic, anti-viral, anti-inflammatory and anti-tumor
activities. Chemical analysis using GCmass spectrometry demonstrated that approximately 150 polyphenolic
compounds including flavonoids and cinnamic acid derivatives are present in propolis. There have been several
reports indicating various biological activities of propolis
and its constituents, such as anticancer. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE), a component of honeybee propolis,
has been reported to hold various biochemical responses.
Caffeic acid phenethyl ester (CAPE), a natural NF-kappaB
inhibitor from honeybee propolis has been shown to have
anti-tumor and anti-inflammatory properties.
Słowa kluczowe: propolis, właściwości przeciwnowotworowe, ester fenyloetylowy kwasu kawowego
Key words: propolis, antitumor properties, caffeic acid
phenethyl ester
Choroby cywilizacyjne dotyczą zarówno krajów Trzeciego Świata jak i krajów wysoko rozwiniętych, w których
degradacja środowiska spowodowała nieodwracalne zagrożenia dla zdrowia człowieka. Nowotwór to nieprawidłowa
masa tkankowa, której wzrost jest nadmierny i rozrasta
się w sposób nieskoordynowany z pozostałymi tkankami,
a nadmierny rozrost tkanki utrzymuje się dalej pomimo
wyeliminowania czynnika indukującego onkogenezę. Istnieje wiele dobrze poznanych czynników karcynogennych,
wśród których należy wymienić m.in. dym tytoniowy,
azbest, dioksyny, benzen, wolne rodniki, alkohol oraz promieniowanie jonizujące i ultrafioletowe. To tylko nielicznie
wybrane czynniki odpowiedzialne za indukcję procesu nowotworzenia. Rozwój cywilizacji sprawił, że mimo coraz
wygodniejszego życia, w dużo większym stopniu narażeni
jesteśmy na stres, minimalizację aktywności ruchowej oraz
wiele substancji karcynogennych dodawanych do żywności
w celu przedłużenia jej przydatności do spożycia.
Od setek lat w diecie ludzi obecne były produkty pocho-
22
dzenia pszczelego. Najstarsza informacja pochodzi z okresu kamiennego. Malowidła na ścianach pieczary Aranów w
Hiszpanii, przedstawiają m.in. człowieka wspinającego się
do gniazda dzikich pszczół. W Abusyrze znajduje się płaskorzeźba z około 2600 r. p.n.e. przedstawiająca hodowlę
pszczół, niewiele różniącą się od dzisiejszej. Starożytni
Chińczycy (w III tysiącleciu p. n. e.) wykorzystywali aktywność farmakologiczną produktów pszczelich dla celów
leczniczych. Już zapisy kalendarza starogreckiego są dokumentem, w którym opisywano właściwości lecznicze miodu
i wosku. Miód stosowany był także przez Inków i Greków.
Rzymianie i Arabowie używali oprócz miodu, również propolisu do leczenia ran i owrzodzeń.
W historii medycyny właściwości lecznicze produktów
pszczelich przedstawił już Hipokrates. Jego wiekopomne
stwierdzenie „dobrze jest gdy pokarm jest lekiem, a lek pokarmem” jest aktualne do dziś.
Na kontynencie europejskim już w XVI-wiecznych kronikach ruskich można spotkać wzmianki na temat stosowa-
nia miodu i różnych produktów pszczelich w profilaktyce
i leczeniu. Progresja nauk analitycznych przyczyniła się do
rozwoju badań nad składem chemicznym i właściwościami
farmakologicznymi produktów zebranych i częściowo zmienionych lub wydzielanych przez pszczoły. Ośrodki kliniczne
i badawcze wyposażone w coraz nowocześniejszą aparaturę
analityczną wzbogacają przekazywaną od pokoleń wiedzę
na temat składu i właściwości produktów pszczelich [1, 2].
Propolis jako surowiec farmakopealny
Jednym z dobrze poznanych surowców farmakopealnych jest propolis (kit pszczeli). Ta smolista substancja wytwarzana jest z żywic drzew liściastych, iglastych, pączków
młodych pędów drzew, krzewów i innych roślin zielonych.
Surowiec kitu pszczelego przynoszony jest do ula w postaci
kropel żywicy umieszczonej w koszyczkach odnóży pszczół
lotnych, a następnie przeżuwany przez pszczoły stacjonarne, które modyfikują jego skład wydzieliną gruczołów ślinowych i woskowych zwiększając w ten sposób jego aktywność farmakologiczną. Propolisu używają pszczoły do
uszczelniania ramek i ścian ula oraz do budowy bariery wokół jego otworu wejściowego. Pszczoły wykorzystują ten produkt
również do utrzymania prawidłowej homeostazy epizootycznej
atmosfery wewnątrz ula. Wykorzystując jego silne działanie bakteriobójcze i bakteriostatyczne, zabezpiecza on środowisko ula
przed działaniem bakterii, grzybów oraz pleśni [3].
Propolis – aktywność biologiczna
Zawartość w propolisie wielu substancji o aktywności
biologicznej determinuje jego działanie przeciwdrobnoustrojowe, przeciwzapalne, immunoprotekcyjne, regeneracyjne, znieczulające, detoksykacyjne, przeciwutleniające,
antyproliferacyjne, proapoptotyczne oraz przeciwnowotworowe. Dokładne poznanie funkcji farmakopealnych propolisu umożliwiły badania prowadzone w wielu ośrodkach
naukowo-badawczych przy zastosowaniu najnowocześniejszych metod badawczych w tym technik z zakresu biologii
molekularnej [4, 5].
W artykule tym skupiliśmy się na prześledzeniu doniesień naukowych potwierdzających w sposób jednoznaczny przeciwnowotworowe działanie propolisu, jako zbioru
wielu substancji wykazujących aktywność biologiczną.
Przeciwnowotwowe działanie kitu pszczelego zostało potwierdzone przez wielu naukowców zarówno w badaniach
in vitro przy użyciu linii komórkowych jak i in vivo na zwierzęcym modelu doświadczalnym.
Zespół brazylijskich naukowców z Biosciences Institute
w swoich badaniach in vitro opisał cytotoksyczny efekt brazylijskiego zielonego propolisu w stosunku do linii komórkowej raka krtani HEp-2. Wykazał on, że wysokie stężenia
propolisu dodawane do hodowli komórkowych powodowały krótkotrwały efekt cytotoksyczny, w przeciwieństwie
do niskich stężeń, gdzie z czasem aktywność ta wzrastała.
Twierdzą oni, iż aktywność ta jest spowodowana synergizmem substancji chemicznych zawartych w kicie pszczelim. Jak wiadomo jednym z najlepiej poznanych składników
o działaniu przeciwnowotworowym jest ester fenyloetylowy kwasu kawowego (CAPE) [6, 7, 8].
Najnowsze badania przeprowadzone w Universitaets
Klinikum Eppendorf w Niemczech pokazują, iż zawarty
w propolisie ester fenyloetylowy kwasu kawowego powoduje, w badaniach in vivo na myszach, prawie całkowitą regresje
guza mózgu wywołanego nerwiakowłókniakowatością typu II
(ang. neurofibromatosis). W tych samych badaniach udowodniono, że CAPE powoduje także, zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych w przebiegu nerwiakowłókniakowatości
typu I. Badania te zapowiadają się bardzo obiecująco, z tego też
względu, że zespół ten odnalazł idealny rozpuszczalnik zdolny
do solubilizacji CAPE. Poza tym rozpuszczalnik ten – Bio 30,
zawiera kilka substancji, które działają synergistycznie wraz
z estrem fenyloetylowym kwasu kawowego [9].
Inne doniesienia naukowe z Tamkang University
w Tajwanie wskazują, że zawarte w propolisie propoliny
A, B, C, D, E oraz F odpowiedzialne są za działanie antyproliferacyjne i cytotoksyczne w stosunku do sześciu linii
komórkowych. Badania przeprowadzono na liniach: A2058
linia ludzkiego czerniaka, B16F10 linia czerniaka mysiego,
MCF-7 linia ludzkiego raka sutka, HepG2 linia ludzkich komórek guza wątroby Hepatoblastoma, Hep3B linia ludzkich
komórek raka wątroby oraz HT-29 linia ludzkich komórek
gruczolakoraka jelita. Zespół ten wykazał, że cztery spośród
sześciu propolin (B, D, E oraz F) wykazują bardzo silne
właściwości przeciwproliferacyjne [10, 11, 12, 13].
Zaskakujące wydają się również doniesienia z Gifu
Pharmaceutical University, Japonia, gdzie przeprowadzone
badania przy użyciu dwóch ekstraktów pochodzących z różnych części świata (Japonia i Brazylia), wykazały iż oba te
produkty pszczele wykazują aktywność przeciwnowotworową w stosunku do czterech różnych nowotworów jelit:
CaCo2, HCT116, HT29 oraz SW480. Sugerują oni nawet, iż
badania nad aktywnością propolisu mogą wpłynąć na podejście lekarzy do chemioprewencji oraz leczenia nowotworów
układu pokarmowego [14].
Badania przeprowadzone w University of Catania we
Włoszech pokazały, że propolis wykazuje właściwości przeciwnowotworowe także w stosunku do opornych na androgeny nowotworów złośliwych prostaty (linia DU145). Praca
ta miała na celu porównanie ekstraktu propolisu z stosowanymi w leczeniu raka prostaty półsyntetycznymi chemioterapeutykami takimi jak vinorelbina. W doświadczeniu tym
brano pod uwagę takie parametry jak: żywotność komórek
(test MTT), integralność błon komórkowych, status oxydoredukcyjny, fragmentacje genomowego DNA oraz zmianę
potencjału błonowego mitochondriów. Badania te udowodniły, że propolis wykazuje właściwości przeciwnowotworowe na skutek jego działania cytotoksycznego prowadzącego do śmierci komórki na drodze nekrozy oraz apoptozy.
Autorzy pracy sugerują, iż dokładna analiza propolisu może
doprowadzić do użycia substancji czynnych zawartych w nim
do wprowadzenia tych związków do rutynowej chemioterapii
lub wspomaganie leczenia syntetycznymi lekami [15].
Badania przeprowadzone w National Changhua
University of Education w Tajwanie, pokazują, że zastosowanie CAPE jest szersze niż dotychczas myślano. W eksperymencie tym wykazano, iż ester fenyloetylowy kwasu
kawowego wykazuje działanie cytotoksyczne w stosunku
do glejaka C6. W badaniach tych odkryto dokładny mechanizm działania CAPE. Wiadome jest, iż CAPE powoduje
23
uwolnienie cytochromu c z mitochondrium do cytozolu
oraz aktywacje CPP32. CAPE spowodowało również aktywacje białek proapoptotycznych z rodziny Bcl-2. Badania
te jednoznacznie potwierdziły, iż zawarty w propolisie ester
fenylowy kwasy kawowego spowodował aktywację mechanizmów biochemicznych prowadzących do kontrolowanej
śmierci komórek – apoptozy [16, 17].
Inne badania przeprowadzone w Graduate School of
Medicine w Japonii wskazują natomiast, iż aktywność propolisu została wykazana także na linii komórkowej mysiego mięsaka S-180 in vitro oraz in vivo u myszy. Badania
te polegały na ocenie aktywności mitotycznej komórek
przeszczepionych do myszy oraz aktywności tej w liniach
komórkowych. W obu przypadkach naukowcy zauważyli
znaczny spadek aktywności mitotycznej, a co za tym idzie
zahamowanie wzrostu guza [18].
Coraz częściej w publikacjach z całego świata ukazują się
doniesienia o aktywności proapoptotycznej propolisu w stosunku do komórek zmienionych nowotworowo. Kolejne badania przeprowadzone w 2009 roku w Department of Histology
and Embryology w Turcji potwierdziły domysły wielu naukowców, że substancje biologicznie czynne zawarte w propolisie zdolne są do aktywowania szlaku programowanej śmierci
komórek, który jak wiadomo w onkogenezie zostaje zahamowany. Naukowcy z Turcji badając właściwości propolisu przeprowadzili badania in vitro na linii komórek nowotworowych
raka sutka MCF-7. W badaniach immunocytochemicznych
z użyciem odpowiednich przeciwciał skierowanych przeciwko
kaspazie 6, 8 i 9 udowodnili, iż roztwór propolisu dodawany w
określonych stężeniach do hodowli komórkowej pobudza komórkę do śmierci apoptotycznej [19].
Wszystkie opisane powyżej badania wskazują, iż propolis
posiada aktywność antynowotworową, cytotoksyczną zdolną
do zahamowania rozwoju nowotworu. Badania te przeprowadzane były za równo in vitro jak i in vivo. Jednakże należy
pamiętać, że zastosowanie propolisu w onkologii wydaje się
niemożliwe. Należy jednak szukać substancji chemicznych
w nim zawartych, których użycie mogłoby wspomóc obecną
chemioterapie lub zmniejszyć jej skutki uboczne.
Piśmiennictwo:
1. Brzeziński T. Historia medycyny. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1995, 141-150.
2. Guderska J. Zarys dziejów pszczelnictwa. W: Hodowla
pszczół. Red. Demianowicz A, Guderska J. Wydawnictwo PWRiL. Warszawa 1974, 13-16, 42-49, 116-121.
3. Ahn MR i wsp. Correlation between antiangiogenic activity and antioxidant activity of various components from
propolis. Mol Nutr Food Res 2009; 53: 643-651.
4. Sha N i wsp. Cytotoxic constituents of chinese propolis.
J Nat Prod 2009; 72: 799-801.
5. Kędzia B. Skład chemiczny i aktywność biologiczna
propolisu pochodzącego z różnych rejonów świata. Post
Fitoter 2006; 1: 23-35.
mgr Robert Kubina,
Katedra i Zakład Patologii,
tel. 32 364 13 50, e-mail: [email protected],
24
6. Búfalo MC, Candeias JM, Sforcin JM. In vitro cytotoxic
effect of Brazilian green propolis on human laryngeal
epidermoid carcinoma (HEp-2) Cells. Evid Based Complement Alternat Med 2007 http://ecam.oxfordjournals.
org/cgi/reprint/nem147v1.
7. Jin UH i wsp. Caffeic acid phenethyl ester induces mitochondria-mediated apoptosis in human myeloid leukemia U937 cells. Mol Cell Biochem 2008; 310: 43-48.
8. Beltrán-Ramírez O i wsp. Evidence that the anticarcinogenic effect of caffeic acid phenethyl ester in the resistant
hepatocyte model involves modifications of cytochrome
P450. Toxicol Sci 2008; 104: 100-106.
9. Demestre M i wsp. CAPE (caffeic acid phenethyl ester)-based propolis extract (Bio 30) suppresses the growth
of human neurofibromatosis (NF) tumor xenografts in
mice. Phytother Res 2009; 23: 226-230.
10.Chen CN i wsp. Isocostunolide, a sesquiterpene lactone, induces mitochondrial membrane depolarization and
caspase-dependent apoptosis in human melanoma cells.
Cancer Lett 2007; 246: 237-252.
11.Chen CN, Wu CL, Lin JK. Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin
A and propolin B from Taiwenese propolis. Cancer Lett
2007; 245: 218-231.
12.Chen CN i wsp. Comparison of Radical Scavenging Activity, Cytotoxic Effects and Apoptosis Induction in Human Melanoma Cells by Taiwanese Propolis from Different Sources. Evid Based Complement Alternat Med
2004; 1: 175-185.
13.Chen CN, Wu CL, Lin JK. Propolin C from propolis induces apoptosis through activating caspases, Bid and cytochrome c release in human melanoma cells. Biochem
Pharmacol 2004; 67: 53-66.
14.Ishihara M i wsp. Growth inhibitory activity of ethanol
extracts of Chinese and Brazilian propolis in four human colon carcinoma cell lines. Oncol Rep 2009; 22:
349-354.
15.Scifo C i wsp. Resveratrol and propolis as necrosis or
apoptosis inducers in human prostate carcinoma cells.
Oncol Res 2004; 14: 415-426.
16.Lee YJ i wsp. Involvement of tumor suppressor protein p53 and p38 MAPK in caffeic acid phenethyl esterinduced apoptosis of C6 glioma cells. Biochem Pharmacol 2003; 15; 66: 2281-2289.
17.Huang WJ i wsp. Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese propolis, induces caspase-dependent
apoptosis in brain cancer cells. J Agric Food Chem 2007;
55: 7366-7376.
18.Inoue K. Anti-tumor effects of water-soluble propolis on
a mouse sarcoma cell line in vivo and in vitro. Am J Chin
Med 2008; 36: 625-634.
19.Seda Vatansever H. Propolis from Turkey induces apoptosis through activating caspases in human
breast carcinoma cell lines. Acta Histochem 2009
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19733388.
Obserwacje kliniczne zwierząt
w badaniach toksykometrycznych
Clinical observations of animals in toxicometric studies
Inga Mrzyk, Aleksandra Szewczyk, Robert Sornat, Małgorzata Przybyła
Instytut Przemysłu Organicznego
Oddział w Pszczynie
Streszczenie
Obserwacja wyglądu i zachowania się zwierząt to ważny
element w badaniach toksykometrycznych substancji chemicznych, zarówno w badaniu toksyczności po podaniu
jednorazowym jak również w badaniach toksyczności po
podaniu wielokrotnym. Często niedoceniane obserwacje
kliniczne stanowią ważne źródło informacji o niekorzystnym wpływie badanej substancji na stan zdrowia zwierzęcia. W opracowaniu przedstawiono zakres obserwacji klinicznych i stopniowanie ich nasilenia. System ten
sprawdził się w praktyce i może być poddany międzylaboratoryjnej weryfikacji.
Słowa kluczowe: toksykometria, obserwacje kliniczne,
klasyfikacja objawów klinicznych
Jednym z podstawowych a często niedocenianych elementów oceny działania szkodliwego substancji chemicznych w badaniach toksykometrycznych są obserwacje kliniczne. Pozwalają one często na uchwycenie objawów działania toksycznego, które nie uwidaczniają się w badaniach
kliniczno-chemicznych i patomorfologicznych. Niejednokrotnie stanowią one pierwsze sygnały działania neurotoksycznego badanej substancji.
W badaniach toksykometrycznych obserwacje kliniczne
prowadzone są już od dawna, lecz ich zakres był określany zbyt ogólnie i różnił się w znacznym stopniu w różnych
laboratoriach przeprowadzających badania. Brak było również ujednoliconego sposobu oceny nasilenia występujących objawów.
W nowelizowanych lub nowoopracowanych Wytycznych OECD (Wytyczna 407-1995, Wytyczna 408-1998, Wytyczna 424-1997) zalecane jest opracowanie i zastosowanie
systemu punktacji zawierającej kryteria lub skalę punktową
dla każdego parametru klinicznego. Rozbudowanie zakresu obserwacji klinicznych, obok wprowadzenia elementów
badania zachowania się zwierząt, miało na celu zwrócenie
uwagi na ocenę funkcjonowania układu nerwowego w badaniach toksyczności po narażeniu jednorazowym i wielokrotnym. W obowiązujących wytycznych działanie neurotoksyczne rozumiane jest znacznie szerzej niż tylko neuropatia,
uwzględnia się też m.in. zaburzenia koordynacji ruchowej
czy ubytki sensoryczne [1].
Abstract
Observation of animals’ appearance and behavior is an
important element in toxicometric studies of chemical
substances including toxicological studies after single
administration as well as repeated dose toxicological studies. The underestimated clinical observations are important source of information on unfavorable influence of test
item on health state of animal. In the treatise a range of
clinical observations and grading of their intensity are presented. This system was verified in practice and may be
subjected to interlaboratory verification.
Key words: toxicometrics, clinical observations, classification of clinical signs
W tradycyjnych metodach ustalania toksyczności ostrej
padnięcia stanowiły wartość końcową [2]. Nowe podejście
w tego rodzaju badaniach polega na obserwacji wyraźnych
objawów toksyczności w jednym z poziomów ustalonych
dawek, unikając w ten sposób padnięć zwierząt [3].
Częstość przeprowadzania obserwacji klinicznych zależy od
rodzaju badania. W badaniu toksyczności ostrej obserwacje kliniczne zwierząt prowadzi się przed podaniem badanej substancji,
następnie kilka razy w dniu podania badanej substancji, a potem
raz dziennie w czasie 14-dniowego trwania doświadczenia [3].
W badaniach przy powtarzanym dawkowaniu szczegółowe obserwacje kliniczne przeprowadza się przed podaniem badanej substancji, a następnie w odstępach tygodniowych [4, 5]. Kliniczne oznaki toksyczności odnotowywane
w trakcie trwania narażenia mogą wiązać się albo z punktami
końcowymi toksyczności albo z procesami chorobowymi.
Mogą one zostać użyte jako dowody popierające zależność
dawka - odpowiedź, a w ten sposób mogą odgrywać znaczącą rolę w określeniu poziomu bez obserwowanego działania
szkodliwego (NOEL –No Observed Effect Level). Jednakże
nie wszystkie objawy kliniczne muszą być skorelowane ze
zmianami patologicznymi w tkankach i narządach. Niektóre
z nich, powodowane przez biochemiczne lub fizjologiczne
skutki, tj. brak koordynacji, skurcze mięśni, drżenie, biegunka, mogą wskazywać na inhibicję acetylocholinoesterazy bez jakichkolwiek zmian morfologicznych spotykanych
w tkance nerwowej [6, 7].
25
Tabela I. Szczegółowe obserwacje kliniczne zwierząt i ich stopniowanie
I
UKŁAD RUCHU, ZACHOWANIE SIĘ, REAKCJE NA BODŹCE
1.
Postawa ciała:
0 – bez zmian
1– grzbiet zaokrąglony
2 – zwierzę leży na boku
3 – zwierzę leży na brzuchu
4 – zwierzę chwycone za ogon kręci się po okręgu
2.
Sposób chodzenia
0 – prawidłowy: głowa jest w poziomie, brzuch nieznacznie uniesiony nad podłogą, ciało podnosi się i opuszcza delikatnie podczas chodzenia
1 – chwiejny chód
2 – niedowład tylnych kończyn (zwierzę wlecze tylne kończyny)
3 – zwierzę leży bezwładnie
3.
Aktywność ruchowa:
0 – normalna
1 – nieznaczny spadek
2 – wyraźny spadek
3 – nieznaczny wzrost
4 – wyraźny wzrost
5 – brak ruchu
4.
Ruch mimowolny – kloniczny (szybko występujące jeden po drugim skurcze mięśniowe)
0 – brak
1 – drżenie
2 – drgawki
5.
Ruch mimowolny – toniczny (długo trwające naprężenia mięśniowe):
0 – brak
1 - występuje
6.
Reakcja zwierząt na ich chwytanie:
0 – bez zmian (łatwo, normalnie, zwierzę nie stawia wyraźnego oporu)
1 – bardzo łatwo (zwierzę siedzi lub leży, pozwala się podnieść i zabrać)
2 – trudno (zwierzę kuli się i staje się sztywne lub biega wkoło i jest trudne do uchwycenia)
3 – bardzo trudno (zwierzę atakuje)
7.
Wokalizacja:
0 – brak
1 – występuje
8.
Reakcje na bodźce dźwiękowe (stukanie palcem w bok klatki lub w podłoże, gdy zwierzę jest poza klatką)
0 – prawidłowa
1 – zmniejszona reakcja (osowiałość)
2 – zwiększona reakcja (nadpobudliwość)
3 – brak reakcji
II. SKÓRA I SIERŚĆ
1.
Barwa skóry:
0 – prawidłowa
1 – rumień
2 – bladość
3 – zasinienie
2.
Obrzęk
0 – brak (bez zmian)
1 – występuje
3.
Naskórek
0 – bez zmian
1 – wysuszenie
2 – złuszczanie się
4.
Sierść:
0 – bez zmian
1 – nastroszenie
2 – przerzedzenie
3 – wyłysienie
5.
Zmiany na skórze:
0 – bez zmian
1 – strup lub strupki
2 – ropień
3 – guz
III. OCZY I POWIEKI
1.
Wydzielina z oczu:
0 – brak
1 – łzawienie
26
2 – wydzielina z krwią
3 – odkładanie się porfiryn wokół oczu („czerwone łzy”)
2.
Wytrzesz oczu:
0 – brak
1 - występuje
3.
Zmętnienie rogówki:
0 – brak
1 – występuje
4.
Zamknięcie powieki:
0 – otwarta
1 – przymknięta
2 – zamknięta
IV. UKŁAD ODDECHOWY
1.
Oddychanie:
0 – normalne
1 – szmery oddechowe
2 – przyśpieszony oddech
3 – utrudnione oddychanie
2.
Wydzielina z nozdrzy:
0 – brak
1 – śluzowa
2 – ropna
3 – z krwią
4 – odkładanie się porfiryn wokół nozdrzy
V. UKŁAD POKARMOWY
1.
Ślinotok
0 – brak
1 – wilgoć tylko wokół pyska
2 – ślina płynie z pyska
2.
Biegunka
0 – brak
1 – występuje
3.
Krwawienie z odbytu:
0 – brak
1 – występuje
VI. UKŁAD MOCZOWY
1.
Moczenie się:
0 – brak
1 – występuje
2.
Krwiomocz:
0 – brak
1 – występuje
VII UKŁAD ROZRODCZY
1.
Wydzielina patologiczna z narządów rozrodczych
0 – brak
1 – występuje
Ponieważ ocena objawów klinicznych jest z natury oceną subiektywną, różniącą się pomiędzy laboratoriami jak
i wykonywana w danym laboratorium przez różne osoby,
wskazane było zatem by obserwacje kliniczne prowadziła
zawsze ta sama osoba. W przypadku badań toksyczności
ostrej jest to możliwe, natomiast w badaniach przewlekłych
trwających do 2 lat takie rozwiązanie jest praktycznie niemożliwe.
Ważną zasadą wykonywania obserwacji klinicznych jest
prowadzenie ich każdorazowo o tym samym czasie i w standardowym miejscu zapewniając jednocześnie, że zmiany
w warunkach badania były minimalne.
Zakres badań klinicznych w badaniach toksykometrycznych wg Wytycznych OECD do Badań Substancji Chemicznych powinien obejmować, ale nie ograniczać się, do zmian
w skórze, sierści, oczach i błon śluzowych, występowania
wydzielin i wydalin oraz objawów odruchowych tj. łzawienie, stroszenie się sierści, nienormalny sposób oddychania.
Należy odnotować zmiany w chodzie, postawie i reakcji
na chwytanie, jak również obecność ruchów klonicznych
lub tonicznych, stereotypię lub dziwaczne zachowanie się
[3, 4, 5].
Uzyskane wyniki obserwacji klinicznych powinny być
opisane przy zastosowaniu systemów punktowych, wyraźnie określonych przez dane laboratorium. Celem ujednolicenia oceny zmian klinicznych i ich optymalizacji opracowano
klasyfikację punktową stosowaną w naszym laboratorium.
Klasyfikację tę przedstawiono w tabeli I. Opracowanie tej
skali miało na celu dokładne scharakteryzowanie zmian
z jednoczesnym uwzględnieniem ich natężenia. Z wprowa-
27
Tabela II.
Wyniki szczegółowych obserwacji klinicznych – karta badania
Rodzaj badania: ………………………………………………………………………………..
Badany materiał: ………………………………………………………………………….…….
Kod badania: .……. Dawka / stężenie* (mg/kg m.c.) / (ppm)*: ………Nr klatki: ……….
Gatunek: …………..….… Płeć: ……………………. Nr zwierzęcia (komp./rejstr.): ...….……
Dzień lub tydzień doświadczenia * / data obserwacji
Parametr
I Układ ruchu, zachowanie
się, reakcje na bodźce
1. Postawa ciała
2. Sposób chodzenia
3. Aktywność ruchowa
4. Ruch mimowolny – kloniczny
5. Ruch mimowolny – toniczny
6. Reakcja zwierzęcia na chwytanie
7. Wokalizacja
II Skóra i sierść
8. Reakcja na bodźce dźwiękowe
1. Barwa skóry
2. Obrzęk
3. Naskórek
4. Sierść
5. Zmiany na skórze
III Oczy i
powieki
1. Wydzielina z oczu
2. Wytrzeszcz oczu
3. Zmętnienie rogówki
IV Układ
oddechowy
4. Zamknięcie powieki
1. Oddychanie
2. Wydzielina z nozdrzy
VII Układ
rozrodczy
VI
Układ
moczowy
V Układ
pokarmowy
1. Ślinotok
2. Biegunka
3. Krwawienie z odbytu
1. Moczenie się
2. Krwiomocz
1. Wydzielina patologiczna z narządów
rozrodczych
Podpis
* niepotrzebne skreślić
dzeniem klasyfikacji związane było wprowadzenie odpowiedniej karty badania, w której notuje się wyniki przeprowadzonych szczegółowych obserwacji klinicznych (tabela
II). Regularne prowadzenie obserwacji dostarcza informacji
o momencie pojawienia się oznak toksyczności, ich nasileniu jak również czasie trwania.
Wprowadzenie w naszym laboratorium ujednoliconego
systemu uchwycenia i kwalifikacji objawów klinicznych
oraz ich opisywanie w odpowiednich kwestionariuszach
sprawdziło się. Pomimo subiektywnego charakteru obser-
28
wacji, opracowany system pozwala na wykrycie i jednolitą ocenę występujących objawów klinicznych, w tym objawów wczesnej neurotoksyczności. System ten może być
przeniesiony do innych laboratoriów toksykometrycznych
i poddany miedzylaboratoryjnej ocenie.
Prowadzenie obserwacji klinicznych pozwala na wczesne wykrycie oznak toksyczności, zmian chorobowych
oraz zapobiega stratom zwierząt dla oceny toksyczności ze
względu na ich padnięcie, a następnie autolizę tkanek [8].
Z punktu widzenia etycznego prowadzenie tych obserwacji
pozwala na identyfikację zwierząt będących w stanie agonii
lub widocznie cierpiących bądź też wykazujących oznaki
silnego i trwałego bólu, co daje podstawę do przeprowadzenia eutanazji [9].
Piśmiennictwo
1. Rydzyński K. Przegląd zmian w metodach toksykometrycznych zalecanych przez OECD i Unię Europejską;
metody alternatywne. Med Pr 1996; 5:17-30.
2. OECD. Acute Oral Toxicity. W: OECD Guidelines for
Testing of Chemicals. Section 4, No 401,OECD, Paris,
1987.
3. OECD. Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Method. W:
OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Section 4,
No 420,OECD, Paris, 1992.
4. OECD. Repeated Dose 28-Day Oral Toxicity Study in
Rodents. W: OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Section 4, No 407,OECD, Paris, 1995.
5. OECD. Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in
Rodents. W: OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Section 4, No 408,OECD, Paris, 1998
6. OECD.Guidance Notes for Analysis and Evaluation of
Repeated Dose Toxicity Studies. Enviromental Health
and Safety Monograph Series on Testing and Assesment
No 32, OECD 2000
7. Gralewicz S. Ocena działania neurotoksycznego. W:
Toksykologia przemysłowa. Red Indulski J A, Piotrowski J K. Wydawnictwo IMP. Łódź 1993, 39-49.
8. Zasady i metody oceny toksyczności związków chemicznych. Kryteria Zdrowotne Środowiska. Wydawnictwo PZWL. T 6, Warszawa 1986.
9. OECD. Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation.
Enviromental Health and Safety Monograph Series on
Testing and Assesment No 19, OECD 2000
Inga Mrzyk
Instytut Przemysłu Organicznego
Oddział w Pszczynie
ul. Doświadczalna 27, 43-200 Pszczyna
tel. 32 210 30 81 wew. 102
29
Ludzkie topoizomerazy jako cel komórkowy
współczesnej chemioterapii
Human topoisomerases as a cellular target of current chemotherapy
Dorota Mańkowska
Instytut Podstaw Chemii Żywności
Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności
Politechnika Łódzka
Streszczenie
Doświadczalne określenie związku pomiędzy cytotoksycznym działaniem najstarszego chemioterapeutyku
– kamptotecyny, z zablokowaniem aktywności enzymatycznej topoizomerazy I okazało się punktem zwrotnym
w poszukiwaniu skutecznej broni przeciw nowotworom
Od tego momentu obserwuje się gwałtowny wzrost zainteresowania badaczy udoskonalaniem znanych już leków,
wprowadzanie do klinik ich nowych, skuteczniejszych
analogów, a także syntetyzowanie całkowicie nowych
cząsteczek o odmiennych od dotychczasowych mechanizmach działania. Odkrycie nowych sposobów walki
z rakiem, choćby terapii celowanej, teoretycznie mogłoby
spowodować zmniejszenie zainteresowania naukowców
topoizomerazami, jednak w praktyce klinicznej to inhibitory tych właśnie enzymów nadal pozostają głównym orężem w walce z nowotworami, zarówno w monoterapii jak i
w terapii wielolekowej.
Abstract
Experimental determination of the connection between cytotoxic way of action of the oldest chemotherapeutic agent
– camptothecin, with blocking of the enzymatic activity of
topoisomerase I, turned out to be a turning point in quest
for the effective weapon against cancers. From this moment
a significant increase in the interest of researchers in the
improvement of the already known medicines is being observed, introduction of their new, more effective analogues
into clinics, as well as synthesis of completely new molecules with different from previous mechanisms of action. The
discoveries of new ways to the fight against the cancer, for
instance targeted therapy, theoretically could cause a reduction of interest of scientists in topoisomerases, however in
clinical practice these inhibitors of the very enzymes still
remain the main weapon in the fight against cancers, both
in the monotherapy and in combination therapy.
Słowa kluczowe: topoizomeraza I, topoizomeraza II, mechanizm działania topoizomeraz, inhibitory topoizomeraz
Key words: topoisomerase I, topoisomerase II, mode of
action of topoisomerases, inhibitors of topoisomerases
Lokalizacja i funkcje w komórce
Topoizomerazy to enzymy komórkowe występujące
w dużej ilości w jądrze komórkowym (w szczególności
w jąderku) oraz w mitochondriach. Odpowiadają one za
usuwanie napięcia torsyjnego powstającego w strukturze
DNA podczas transkrypcji i replikacji, umożliwiając w ten
sposób bezpośredni dostęp polimerazom do kodu genetycznego komórki [4, 5].
Podczas podziałów komórkowych funkcja topoizomeraz polega na rozplątywaniu i fizycznym oddzieleniu od
matrycy nowo zreplikowanej nici DNA, poprzez umożliwienie przejścia nietkniętej nici DNA przez pęknięcie
w podwójnym heliksie [6]. W przypadku braku topoizomeraz, nagromadzenie silnie skręconego i splątanego materiału
genetycznego uniemożliwiłoby zachodzenie niezbędnych
do życia procesów komórkowych, ostatecznie doprowadzając do przedwczesnej śmierci komórki.
Działanie wszystkich rodzajów topoizomeraz oparte jest
na przejściowym przecinaniu jednej lub dwóch nici DNA
30
poprzez tworzenie kowalencyjnego wiązania fosfodiestrowego pomiędzy resztą tyrozyny z centrum aktywnego enzymu i grupą fosforanową jednego z końców nici DNA [4].
Klasyfikacja topoizomeraz
Opierając się na różnicach w budowie i funkcji, w rodzinie topoizomeraz wyróżnia się dwie główne grupy białek
[5]:
- topoizomerazy typu I,
- topoizomerazy typu II.
Topoizomerazy typu I generują pęknięcie tylko w jednej
nici podwójnego heliksu, tworząc kowalencyjne wiązanie
z grupą fosforanową końca 5’ lub 3’ DNA, w zależności od
tego czy mamy do czynienia odpowiednio z podgrupą IA
czy IB enzymu [4, 7]. Stąd też niekiedy spotkać się można z nazewnictwem I-5’ lub I-3’, tożsamym odpowiednio
z IA lub IB [4]. Głównym zadaniem topoizomeraz typu I jest
relaksacja silnie skręconych cząsteczek DNA, przy czym
białka typu IA usuwają napięcie torsyjne z negatywnych superzojów, natomiast enzymy typu IB
– bardzo efektywnie relaksują zarówno pozytywnie jak i negatywnie skręcone cząsteczki DNA [5].
W odróżnieniu od topoizomeraz typu I, które
do swojej aktywności enzymatycznej nie potrzebują zewnętrznego źródła energii, enzymy typu
II do pracy potrzebują energii z hydrolizy ATP.
Topoizomerazy typu II generują przejściowe pęknięcie jednocześnie w obu niciach DNA. Również
tę grupę topoizomeraz podzielono na dwie podgrupy – typ IIA i IIB, wykazujące pewne różnice
w strukturze łańcucha aminokwasowego [4].
Mechanizm działania
topoizomeraz
W cyklu katalitycznym ludzkiej topoizomerazy I (EC 5.99.1.2.) wyróżnia się pięć etapów
[7]:
1) wiązanie DNA,
2) rozcinanie jednej nici,
3) usuwanie napięcia torsyjnego,
Rys.1. Struktura krystaliczna fragmentu centrum aktywnego ludzkiej topoizo4) religacja (odtworzenie ciągłości nici),
5) odłączenie białka od DNA i przemieszcze- merazy I w kompleksie rozszczepialnym topo I–DNA (cytozyna w pozycji -1)
otrzymana przez Champoux [4], dostępna w Protein Data Bank (ID 1EJ9); zienie na inną cząsteczkę substratu.
lona przerywana linia obrazuje wiązania wodorowe; długość wiązań podano
Topoizomeraza I wiąże się wyłącznie z dwu- w angstremach (Å).
niciowym DNA, co więcej znacznie łatwiej
Ludzka topoizomeraza II (EC 5.99.1.3) posiada dwie
z DNA superhelikalnym, niż z cząsteczką liniową [8]. Rozcięcie jednej nici DNA następuje poprzez atak izoformy – α i β, różniące się między sobą przede wszystnukleofilowy tlenu z grupy hydroksylowej reszty tyrozyny kim poziomem ekspresji w zależności od stanu fizjologiczz centrum aktywnego enzymu (Tyr723) na grupę fosfora- nego komórki, typem oddziaływania z DNA oraz nieznacznową jednego z końców ciętej nici. W przypadku ludzkiej nie masą cząsteczkową [4, 10]. Ekspresja topoizomerazy IIβ
topoizomerazy IB jest to koniec 3’ łańcucha DNA. W skutek jest względnie stała w całym cyklu komórkowym. W przytego ataku powstaje wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy resz- padku topoizomerazy IIα obserwuje się gwałtowny wzrost
tą tyrozyny i fosforanem końca 3’ podwójnej helisy – tworzy stężenia tego białka w komórkach aktywnie dzielących się
się tzw. „kompleks rozszczepialny” (ang. cleavable/cleava- – dwa do trzech razy podczas fazy G2/M [10]. Ta właścige complex). Kompleks ten dodatkowo stabilizują wiązania wość topoizomerazy IIα została wykorzystana w projektowodorowe, utworzone pomiędzy resztami aminokwasowy- waniu leków cytotoksycznych.
Mechanizm działania topoizomeraz typu II jest w dużym
mi z centrum aktywnego enzymu (Arg488, Arg590, His632,
Lys532) i wolnymi atomami tlenu grupy 3’ fosforanowej stopniu zbliżony do opisanego wcześniej cyklu katalitycznego topoizomeraz typu I. Homodimery topoizomerazy II
przyłączonej do Tyr723 (Rys. 1.) [4, 9].
Usuwanie napięcia torsyjnego następuję prawdopodob- wiążą się z obiema nićmi DNA (zamiast z jedną, jak w przynie według jednego z dwóch mechanizmów. Jeden z zapro- padku topo I), tworząc kompleks rozszczepialny i generuponowanych modeli zakłada, że koniec nici DNA z wolną jąc podwójne pęknięcie w helisie. Proces wiązania enzymu
grupą 5’-hydroksylową ulega rotacji wokół drugiej nietknię- do DNA również nie wymaga dostarczenia energii z zetej nici DNA (mechanizm wolnej rotacji) [8]. Natomiast we- wnątrz. Zaobserwowano natomiast, że obecność kationów
dług drugiego modelu nienaruszona nic DNA przechodzi dwuwartościowych (zwłaszcza Mg2+) działa pobudzająco
przez rodzaj mostu utworzonego przez topoizomerazę po- na przyłączanie się białka do DNA [10]. Podczas tworzełączoną kowalencyjnie z końcem 3’ i równocześnie nieko- nia kompleksu rozszczepialnego najważniejszą funkcję i tu
walencyjnie z końcem 5’ przeciętej nici DNA (mechanizm pełni katalityczna reszta tyrozyny, a dokładnie dwie reszty
tego aminokwasu – po jednej z obu podjednostek enzymu.
kontrolowanej rotacji) [9].
W kolejnym etapie cyklu katalitycznego ludzkiej topo- Podczas przecinania podwójnego heliksu następuje kowaizomerazy IB następuje religacja DNA. Cykl zamyka odłą- lencyjne przyłączenie obu podjednostek topoizomerazy II
czenie się białka od DNA i przemieszczenie na inną czą- do końca 5’ DNA poprzez utworzenie wiązania fosfotyrozynowego, analogicznie jak w przypadku topoizomerazy I
steczkę substratu [8].
Podobny mechanizm działania prezentują ludzkie topo- [11]. Powstałe zmiany konformacyjne w cząsteczce DNA
izomerazy z podgrupy IA, z tym że rozcinanie jednej nici powodują fizyczne oddalenie od siebie obu nici przecinanej
DNA następuje na skutek przyłączenia enzymu do końca 5’, helisy, formując ten fragment DNA w rodzaj bramy (ang.
G-segment), przez którą „przeciągany” jest (transportowaa nie 3’ jak w przypadku enzymów z podgrupy IB [4].
31
jące w fazie S mają od 100 do 1000 razy większą
wrażliwość na kamptotecynę niż komórki w fazie
G1 lub G2 [16]. Co więcej okazało się, że stężenie
topoizomerazy I w komórkach nowotworowych
jest o wiele wyższe niż w komórkach zdrowych
[17], nawet 14-16 razy wyższe w komórkach raka
okrężnicy niż w sąsiadujących prawidłowych komórkach śluzówki [18].
Drugą grupę cytostatyków fazowo swoistych
stanowią inhibitory topoizomerazy II, a ściślej
Rys. 2. Schemat wyjaśniający mechanizm przechodzenia fragmentu jednej cząjej izoformy IIα [3, 19].
steczki DNA (T-segment) przez fragment drugiej cząsteczki DNA (G-segment)
Jak już wspomniano wcześniej, stężenie tow cyklu katalitycznym topoizomerazy II, zaproponowany przez Wanga [5]; miejsca wiązania ATP oznaczono gwiazdkami.
poizomerazy IIα zmienia się w trakcie cyklu komórkowego. Podczas podziałów komórkowych,
ny) drugi nietknięty fragment tej samej lub innej cząsteczki
a zwłaszcza w fazie G2 i M, ekspresja topoizomeDNA (ang. T-segment) (Rys. 2.). Ten etap cyklu katalitycz- razy IIα osiąga maksymalne wartości. W komórkach pozonego topoizomerazy II wymaga dostarczenia energii z hy- stających w fazie spoczynkowej (G0) stężenie tego białka
drolizy ATP. Cykl kończy ponowne łączenie wolnych koń- jest nawet 2-3 razy niższe niż w przypadku aktywnych proliców uprzednio uszkodzonego DNA w jedną, dwuniciową feracyjnie komórek [19]. Zatem zdolność topoizomerazy IIα
cząsteczkę [4, 5].
do rozdzielania dwóch splątanych cząsteczek DNA wskaZarówno topoizomerazy I jak i II typu mogą usuwać napięcie zuje jak ważną rolę pełni to białko w organizacji materiału
torsyjne z pozytywnych i negatywnych superzwoi DNA. Nie- genetycznego, a zwłaszcza w segregacji chromosomów.
mniej jednak tylko topoizomerazy II typu potrafią relaksować
Aktywność topoizomerazy IIα wzrasta szczególnie wyzwinięte ze sobą na kształt łańcucha dwie cząsteczki DNA [6].
raźnie w komórkach zmienionych nowotworowo i jest związana z postępującą agresywnością oraz powiększaniem się
Inhibitory topoizomeraz
guza [19]. Dlatego też ta izoforma topoizomerazy II stała się
jednym z najważniejszych, obok ludzkiej topoizomerazy I,
W odpowiedzi na odkrycie, iż celem ataku najstarszego celem współczesnych chemioterapeutyków.
z chemioterapeutyków (kamptotecyny) jest topoizomeraza
Kompleksy rozszczepialne topo IIα – DNA są punktem
I [1] nastąpił gwałtowny wzrost zainteresowania badaczy uchwytu dla leków z grupy antracyklin, aminoakrydyn oraz
tą grupą białek. Prowadzone badania skupiły się wokół po- epipodofilotoksyn (etopozyd, tenipozyd) [3].Mechanizm dziaszukiwań nowych, skuteczniejszych inhibitorów topoizo- łania tych cytostatyków jest w dużej mierze podobny do opisameraz.
nego wyżej mechanizmu działania kamptotecyny i jej pochodNajlepiej poznanymi inhibitorami topoizomerazy I nych. Leki te stabilizują kompleksy rozszczepialne tworzone
jest kamptotecyna i jej analogi, a wśród nich powszechniej przez topoizomerazę IIα i DNA, uniemożliwiając religację nici
stosowane w chemioterapii – topotekan i irinotekan [12- DNA, dochodzi do zatrzymania komórki w fazie G2 i ostatecz14]. Mechanizm cytotoksycznego działania kamptotecyny nie śmierci komórki. Niemniej jednak komórki nowotworowe
i wszystkich jej analogów polega na stabilizacji kompleksu coraz częściej potrafią ominąć problemy związane z zablokorozszczepialnego topo I–DNA. Prowadzi to do zderzenia waniem przez selektywne cytostatyki topo IIα, zwiększając
widełek replikacyjnych z unieruchomionym przez inhibitor ekspresję drugiej izoformy – topoizomerazy IIβ [19].
kompleksem rozszczepialnym i zahamowania dalszej replikacji. Powstanie kompleksu topo I–DNA–lek doprowadza
Poszukiwanie nowych sposobów walki z nowotworami,
do zerwania ciągłości nici, zatrzymania komórek w fazie G2 m. in. wprowadzenie do klinik terapii celowanej, być może
i w konsekwencji apoptotycznej śmierci [15]. Kamptotecy- pociągnie za sobą spadek zainteresowania topoizomerazana i jej analogi wiążą się swoiście w kompleks zarówno z mi. Jednak w praktyce to inhibitory tych właśnie enzymów
topoizomerazą I, poprzez interakcje z katalityczną tyrozyną, nadal pozostają głównym orężem w walce z rakiem, zarówjak i z DNA, ale nie mają powinowactwa do wolnego enzy- no w monoterapii (cytostatyki selektywne) jak i w terapii
mu (nie związanego z DNA), ani też do wolnego DNA [8].
wielolekowej [2, 3]. Dowodem czego są prowadzone na
Drugi, równoległy efekt działania tej grupy leków za- szeroką skalę badania przedkliniczne jak i kliniczne nowych
chodzi w czasie transkrypcji i dotyczy przesuwających się inhibitorów topoizomeraz, takich jak gimatecan, diflomotecząsteczek polimerazy RNA oraz stabilizowanych przez can, edotecarin czy ARC-111 [14, 20].
nie kompleksów rozszczepialnych zlokalizowanych na matrycowym DNA w obrębie rejonu, który aktualnie podlega Piśmiennictwo
transkrypcji. Dochodzi do zatrzymania proliferacji komórek w fazie G1 i uruchomienia aparatu apoptozy, głównie 1. Hsiang YH i wsp. Camptothecin induces protein-linked
w fazie S. Ponieważ stężenie i aktywność topoizomerazy I
DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I. J
w jądrze jest najwyższa w fazie S cyklu komórkowego, inBiol Chem 1985; 260: 14873-14878.
hibitory topo I określa się jako cytostatyki fazowo swoiste 2. Omyła-Staszewska J, Deptała A. Inhibitory topoizome(ang. S-phase specific), blokujące kompleksy rozszczepialne
razy I – unikalna grupa leków przeciwnowotworowych.
w tej właśnie fazie [2]. Udowodniono, że komórki pozostaWspółczesna Onkologia 2003; 7: 45-53.
32
3. Liu WM, te Poele RH. Recent advances and developments in the inhibitors of DNA topoisomerases. Curr
Enzyme Inhib 2007; 3: 161-174.
4. Champoux JJ. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanizm. Annu Rev Biochem 2001; 70:
369-413.
5. Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: A
molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3:
430-440.
6. Nitiss JL. Investigating the biological functions of DNA
topoisomerases in eukaryotic cells. Biochim Biophys
Acta 1998; 1400: 63-81.
7. Derlacz R. Informacja genetyczna pod kontrolą – rola
eukariotycznej topoizomerazy I. Postępy Biochem 2001,
47: 243-252.
8. Pommier Y i wsp. Mechanism of action of eukaryotic
DNA topoisomerase I and drugs targeted to the enzyme.
Biochim Biophys Acta 1998; 1400: 83-106.
9. Stewart L i wsp. A model for the mechanism of human
topoisomerase I. Science 1998; 279: 1534-1541.
10.Burden DA, Osheroff N. Mechanism of action of eukaryotic topoisomerase II and drugs targeted to the enzyme. Biochim Biophys Acta 1998; 1400: 139-154.
11.Berger JM, Wang JC. Recent developments in DNA
topoisomerase II structure and mechanism. Curr Opin
Struct Biol 1996; 6: 84-90.
12.Pizzolato JF, Saltz LB. The camptothecins. Lancet 2003;
361: 2235-2242.
13.Li QY i wsp. Review camptothecin: current perspectives. Curr Med Chem 2006; 13: 2021-2039.
14.Teicher BA. Next generation topoisomerase I inhibitors:
Rationale and biomarker strategies. Biochem Pharmacol
2008; 75: 1262-1271.
15.Hsiang YH, Lihou MG, Liu LF. Arrest of replication
forks by drug-stabilized topoisomerase I-DNA cleavable
complexes as a mechanism of cell killing by camptothecin. Cancer Res 1989; 49: 5077-5082.
16.Li LH i wsp. Action of camptothecin on mammalian
cells in culture. Cancer Res 1972; 32: 2643-2650.
17.Husain I i wsp. Elevation of topoisomerase I messenger
RNA, protein, and catalytic activity in human tumors:
demonstration of tumor-type specificity and implications for cancer chemotherapy. Cancer Res 1994; 54:
539-546.
18.Giovanella BC. DNA topoisomerase I-targeted chemotherapy of human colon cancer in Xenografts. Science
1989; 246: 1046-1048.
19.Kellner U. Culprit and victim – DNA topoisomerase II.
Lancet Oncol 2002; 3: 235-243.
20.Basili S, Moro S. Novel camptothecin derivatives as topoisomerase I inhibitors. Expert Opin Ther Pat 2009; 19:
555-574.
dr inż. Dorota Mańkowska
Instytut Podstaw Chemii Żywności
Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka
ul. Stefanowskiego 4/10
90-924 Łódź
tel.: 42 631 34 14
33
Wpływ łącznego stosowania leku Ukrain i Metotreksatu
na niektóre parametry biochemiczne w surowicy krwi myszy
świadczące o funkcji nerek
Effect of simultaneous treatment with Ukrain and Methotrexate
on some biochemical parameters of mice serum indicating
on kidney function
Magdalena Izdebska1, Magdalena Ćwieka1, Bogumiła Sobkowiak2, Ewa Jagiełło-Wójtowicz1
Katedra i Zakład Toksykologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Analityki Medycznej,
Uniwersytet Medyczny w Lublinie
2
Apteka Szpitalna, Centrum Onkologii Ziemi Lubelskiej
1
Streszczenie
W pracy oceniano wpływ łącznego stosowaniu dwóch leków przeciwnowotworowych tj. leku Ukrain (9,5 lub 19,0
mg/kg ip. 1x dziennie przez 14dni) i Metotreksatu (MTX,
18,8 mg/kg ip. 1x w 1 i w 8 dniu doświadczenia) na wybrane parametry biochemiczne świadczące o funkcji nerek myszy. W surowicy krwi zwierząt oznaczono stężenia
mocznika, kreatyniny i beta-2-mikroglobuliny (β-2-M).
Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, istotne
zwiększenie stężenia mocznika, kreatyniny oraz β-2-M
w surowicy krwi myszy otrzymujących łącznie oba leki
w porównaniu z odpowiednimi grupami otrzymującymi
tylko Ukrain lub MTX. Uzyskane wyniki sugerują, że
łączne stosowanie leku Ukrain z MTX może prowadzić
do nasilania ich działania toksycznego.
Słowa kluczowe: Ukrain, Metotreksat, mocznik, kreatynina, beta-2-mikroglobulina (β-2-M)
Wstęp
Lek przeciwnowotworowy Ukrain (NSC – 631570) jest
tiofosforowo – kwasowo pochodną alkaloidów Chelidonium
majus L. W badaniach in vitro i in vivo wykazano, że Ukrain
cechuje się selektywnym działaniem cytotoksycznym i/lub
cytostatycznym na komórki nowotworowe [1, 2, 3, 4]. W terapii onkologicznej Ukrain często stosowany jest przed lub
po chemioterapii i/lub radioterapii. Stosowanie leku u pacjentów onkologicznych powoduje redukcję masy guza oraz
częściową lub całkowitą remisję [5, 6]. Podczas skojarzonej chemioterapii cytostatykami często obserwuje się liczne działania niepożądane stosowanych leków gdyż nie są
one obojętne dla zdrowych komórek organizmu [7]. Ukrain
w terapii skojarzonej osłabia toksyczne działania niepożądane innych cytostatyków oraz poprawia tolerancję chemioterapii u pacjentów w różnym wieku [4, 8, 9]. Ponieważ
w dostępnym piśmiennictwie brak jest danych dotyczących stosowania leku Ukrain w połączeniu z metotreksa-
34
Summary
In this study evaluated the influence of simultaneous treatment with two anticancer drugs i.e. Ukrain (9,5 or 19,0
mg/kg ip. once daily for 14 days) and Methotrexate (MTX,
18,8 mg/kg ip. once in the first and eighth day of experience)
on some biochemical parameters indicating on kidney function. The serum concentration of urea, creatinine and beta-2microglobulin (β-2-M) were determined. The study showed
a significant increase the concentrations of urea, creatinine
and β-2-M in the serum of mice treatment Ukrain with MTX
as compared with the groups receiving Ukrain or MTX only.
The results suggest that simultaneous treatment with Ukrain
and MTX can lead to increasing their toxic activity.
Key words: Ukrain, Methotrexate, urea, creatinine, beta2-microglobulin (β-2-M), mice
tem (MTX) wydawało się celowym podjęcie takich badań.
W onkologii MTX stosowany jest w leczeniu wielu chorób nowotworowych, m.in. guzach piersi, szyi i głowy oraz
w zaawansowanych stadiach chłoniaka nieziarniczego. Charakteryzuje się jednak dużą toksycznością i daje toksyczne
interakcje z wieloma lekami. Do zwiększenia toksyczności
MTX dochodzi przy równoczesnym stosowaniu takich cytostatyków jak cyklosporyna, cisplatyna oraz alkaloidy barwinka różowatego (Vinca rosea) [7, 10]. Dlatego też celem tej
pracy była ocena wpływu skojarzonego działania leku Ukrain
i MTX na niektóre parametry biochemiczne świadczące
o czynności nerek myszy.
Materiał i metody
Badania przeprowadzono na myszach, samicach szczepu Albino Swiss o masie ciała 20±5g. Zwierzęta pochodziły
od licencjonowanego dostawcy (Hodowla Zwierząt Laboratoryjnych, Teresa Górzkowska, Warszawa, Polska). Myszy
przebywały w klatkach, w pomieszczeniu o standardowych
warunkach laboratoryjnych (temp. 20±1 oC, stała wilgotność, hałas) z zachowaniem naturalnego cyklu dobowego.
Miały swobodny dostęp do wody i paszy. Po 2-3 dniach
adaptacji zwierzęta rozdzielano losowo do grup doświadczalnych liczących po 8 sztuk. Procedury eksperymentalne
badań uzyskały zgodę i zostały zatwierdzone przez I Lokalną Komisję Etyczną d/s Doświadczeń na Zwierzętach przy
Uniwersytecie Medycznym w Lublinie.
W pracy stosowano: lek Ukrain (wodny koncentrat 1:30,
Ukrainian Anti-Cancer Institute, Vienna, Austria), Metotreksat (MTX, Metotreksat-Ebewe, amp. 10mg/1ml, Ebewe
Pharma, Unterach, Austria), oraz wodę do iniekcji (aqua
pro injectione; Polfa, Lublin, Polska). Do oznaczeń biochemicznych używano gotowych zestawów diagnostycznych: mocznik (Liquick Cor-UREA 120) i kreatynina
(Liquick Cor-CREATININE 60) z firmy P.Z. CORMAY,
Lublin, Polska; oraz β-2-mikroglobulina (β-2-M, Beta-2Microglobulin, ELISA, Immundiagnostik AG, Bensheim,
Niemcy).
Wodne roztwory leku Ukrain (9,5 lub 19 mg/kg) oraz
MTX (18,8 mg/kg) przygotowywano ex tempore i podawano myszom dootrzewnowo (ip), w stałej objętości
0,1 ml/10g m.c. Zwierzęta grup kontrolnych otrzymywały
ip takie same objętości wody do iniekcji.
Procedura doświadczeń składała się z 6 grup (I-VI).
Myszy poszczególnych grup otrzymywały kolejno jeden
raz (1x) dziennie przez 14 dni: I - wodę do iniekcji, II i III
-Ukrain 9,5 i 19 mg/kg; IV – MTX (1x w 1 i 8 dniu doświadczenia) a w pozostałych dniach wodę do iniekcji; V – Ukrain
(9,5 mg/kg) w kombinacji z MTX (1x w 1 i 8 dniu doświadczenia); VI - Ukrain (19 mg/kg) w kombinacji z MTX (1x
w 1 i 8 dniu doświadczenia). Schemat podawania obu leków
zastosowany w niniejszej pracy oparty był na dostępnych
w piśmiennictwie schematach leczenia pacjentów onkologicznych tymi lekami [1,4,11,12].
W 15 dniu doświadczenia tj. 24 godz. po ostatniej iniekcji zwierzęta w/w grup dekapitowano i pobierano krew,
którą pozostawiano do wykrzepnięcia w celu uzyskania surowicy. Krew po wykrzepnięciu wirowano (3000 obr./min.)
przez 10 min. Następnie pobierano surowicę do probówek
polistyrenowych i przechowywano w temp. (-20 oC) do
jednoczasowego oznaczania badanych parametrów biochemicznych tj. mocznika, kreatyniny i β-2-M.
Stężenie mocznika (mg/dl) oznaczono metodą enzymatyczną, kinetyczną z ureazą i dehydrogenazą glutaminianową zgodnie z instrukcją zamieszczoną przez producenta.
Absorbancje prób badanych i próby wzorcowej odczytywano na czytniku mikropłytek ELx808IU (Bio-Tek Instruments
Inc.) przy długości fali λ=340 nm.
Stężenie kreatyniny (mg/dl) oznaczono kolorymetrycznie, zgodnie z instrukcją podaną przez producenta. Absorbancje prób badanych i próby wzorcowej odczytywano
wobec powietrza, przy długości fali λ=500 nm.w spektrofotometrze Spekol 11.
Stężenie β-2-M (mg/l) oznaczono metodą immunoenzymatyczną ELISA, zgodnie z instrukcją zamieszczoną przez
producenta. Absorbancje prób wzorcowych i badanych odczytywano w czytniku mikropłytek ELx808IU (Bio-Tek Instruments Inc.) przy długości fali λ = 450 nm.
Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono przy użyciu testu t-Studenta przy poziomie istotności
p<0,05.
Wyniki badań
Ocena wybranych parametrów biochemicznych świadczących o funkcji nerek myszy poddanych działaniu leku
Ukrain, Metotreksatu i ich kombinacji.
1. Stężenie mocznika w surowicy krwi myszy
Po 14 dniowym stosowaniu leku Ukrain (9,5 lub19,0
mg/kg) nie notowano zmian w stężeniu mocznika w surowicy krwi myszy w porównaniu z grupą kontrolną (Ryc. 1).
Zaś po 14 dniach w grupie myszy otrzymującej Metotreksat
(18,8 mg/kg ip. 1 x w 1 i 8 dniu doświadczenia) obserwowano istotne zwiększenie stężenia mocznika w surowicy krwi
w porównaniu z wynikami otrzymanymi w grupie kontrolnej. W surowicy krwi myszy otrzymujących łącznie lek
Ukrain (9,5 lub 19,0 mg/kg) z Metotreksatem (18,8 mg/kg)
stwierdzono istotne zwiększenie stężenia mocznika w porównaniu tylko z lekiem Ukrain w odpowiednich dawkach.
2. Stężenie kreatyniny w surowicy krwi myszy
Po 14 dniowym stosowaniu leku Ukrain w dawkach
(9,5 lub 19,0 mg/kg ip.) praktycznie nie notowano zmian
w stężeniu kreatyniny w surowicy krwi myszy w porównaniu z grupą kontrolną (Ryc. 2). Podobnie w grupie zwierząt otrzymujących Metotreksat (18,8 mg/kg) nie obserwowano zmian w stężeniu kreatyniny w surowicy krwi
w porównaniu z grupą kontrolną. W surowicy krwi myszy
otrzymujących łącznie lek Ukrain i Metotreksat stwierdzono istotne zwiększenie stężenia kreatyniny w porównaniu
z wynikami tego parametru w grupie otrzymującej sam Metotreksat.
3. Stężenie β-2-mikroglobuliny w surowicy krwi myszy.
14 dniowe stosowanie myszom leku Ukrain w dawkach
9,5 lub 19,0 mg/kg ip. istotne zmniejszało stężenie β-2mikroglobuliny w surowicy krwi w porównaniu z wartościami
w grupie kontrolnej (Ryc.3). Po 14 dniach od iniekcji Metotreksatu (18,8 mg/kg ip. w 1 i 8 dniu doświadczenia) stwierdzono zwiększenie stężenia β-2-mikroglobuliny w porównaniu
z grupą kontrolną. W surowicy krwi myszy otrzymujących
łącznie lek Ukrain i Metotreksat obserwowano zwiększenie
stężenia β-2-mikroglobuliny w surowicy w porównaniu do
wyników otrzymanych w grupach myszy, którym podawano
tylko lek Ukrain. Zaznaczyć należy przy tym, że stężenie
β-2-mikroglobuliny w tych grupach zbliżone było do stężenia tego białka w surowicy krwi myszy grupy kontrolnej.
Dyskusja
Z piśmiennictwa [11, 12, 13] wiadomo, że poważnym
powikłaniem terapii MTX jest uszkodzenie nerek ponieważ głównie tą drogą zachodzi eliminacja leku i narząd ten
jest narażony na większe stężenia MTX i jego metaboli-
35
19,46 ± 1,65
mg/dl
* Δ p< 0,05 * w porównaniu z grupą kontrolną Δ w porównaniu z lekiem Ukrain
Wyniki wyrażono jako średni % grupy kontrolnej
0,99 ± 0,13
mg/dl
Ryc.1. Wpływ łącznego stosowania leku Ukrain (1x dziennie przez 14 dni) i MTX (1x w 1 i 8
dniu doświadczenia) na stężenie mocznika w surowicy krwi myszy
# p< 0,05 w porównaniu z MTX
0,29 ± 0,03
mg/l
Ryc. 2. Wpływ łącznego stosowania leku Ukrain (1x dziennie przez 14 dni) i MTX (1x w 1 i 8
dniu doświadczenia) na stężenie kreatyniny w surowicy krwi myszy
W surowicy krwi zwierząt oznaczono
stężenia mocznika, kreatyniny i beta2-mikroglobuliny (β-2-M).
Diagnostyka laboratoryjna funkcji nerek oparta jest m.in. na oznaczaniu w surowicy krwi substancji
wydalanych głównie przez nerki
takich jak mocznik czy kreatynina.
Wzrost ich stężenia może świadczyć o zaburzeniu czynności nerek
[14]. Czułym wskaźnikiem zmniejszenia wartości przesączania kłębuszkowego (GRF) oraz stopnia
uszkodzenia cewek proksymalnych
nerek jest wzrost stężenia β-2-M
w surowicy krwi [15].
W pracy wykazano, że 14– dniowe stosowanie myszom leku Ukrain (9,5 lub 19,0 mg/kg 1x dziennie ip.) nie wpływało na stężenie
mocznika i kreatyniny, obniżało
zaś stężenie β-2-M w surowicy
krwi w porównaniu z wartościami tych parametrów otrzymanymi
w surowicy krwi myszy grupy kontrolnej. Natomiast po 14 dniach
w grupie myszy, którym dwukrotnie podano MTX (1x ip w 1 i 8 dniu
doświadczenia) stwierdzono istotne zwiększenie stężenia mocznika
i β-2-M w porównaniu z wynikami
uzyskanymi w grupie kontrolnej.
W pracy wykazano również, że
lek Ukrain (9,5 lub 19,0 mg/kg) podany w kombinacji z MTX (18,8 mg/
kg) istotnie zwiększał w surowicy
krwi myszy stężenie mocznika (w porównaniu tylko z lekiem Ukrain) oraz
kreatyniny (w porównaniu z MTX).
Wartości stężenia β-2-M w tych grupach były zbliżone do wartości tego
białka w grupie kontrolnej.
Na podstawie uzyskanych wyników można przyjąć, że przy łącznym
stosowaniu leku Ukrain z MTX dochodzi do zwiększenia toksyczności
obydwu leków.
Wnioski
1. Ukrain stosowany przez 14 dni
zmniejszał istotnie tylko stężenie
* Δ p< 0,05 * w porównaniu z grupą kontrolną Δ w porównaniu z lekiem Ukrain
β-2-M w surowicy krwi myszy.
2. MTX (podany w 1 i 8 dniu doRyc. 3. Wpływ łącznego stosowania leku Ukrain (1x dziennie przez 14 dni) i MTX (1x w 1 i 8
świadczenia) istotnie zwiększał stędniu doświadczenia) na stężenie β-2-mikroglobuliny w surowicy krwi myszy
żenie mocznika i β-2-M w porównaniu z grupą kontrolną .
tów. Kwaśne pH moczu sprzyja wytrącaniu się kryształków
3.
Po
łącznym
stosowaniu
leku Ukrain (9,5 lub 19 mg/kg)
MTX w kanalikach nerkowych. Dlatego też w pracy postaz
MTX
(18,8
mg/kg)
notowano
istotne zwiększenie stęnowiono ocenić funkcję nerek myszy poddanych działaniu
żenia
mocznika
i
kreatyniny
w
surowicy
krwi myszy.
leku Ukrain, Metotreksatu oraz łącznego ich stosowania.
36
Piśmiennictwo
1. Jagiełło-Wójtowicz E, Kleinrok Z, Urbanska EM.
Ukrain (NSC-631570) in experimental and clinical
studies: a review. Drugs Exp Clin Res 1998; 24:
213-219.
2. Liepins A i wsp. Induction of bimodal programmed cell
death in malignant cells by the derivative Ukrain (NSC631570). Drugs Exp Clin Res 1996; 22: 73-79.
3. Nowicky JW i wsp. Ukrain both as an anticancer and
immunoregulatory agent. Drugs Exp Clin. Res 1992; 18:
51-54.
4. Uglyanitsa KN i wsp. Ukrain: A novel antitumor drug.
Drugs Exp Clin Res 2000; 26: 341-356.
5. Aschhoff B. Retrospective study of Ukrain treatment
in 203 patients with advanced-stage tumors. Drugs Exp
Clin Res 2000; 26: 249-252.
6. Lohninger A, Hamler F. Chelidonium majus L. (Ukrain)
in the treatment of cancer patients. Drugs Exp Clin. Res
1992; 18: 73-77.
7. Blower P i wsp. Drug – drug interactions on oncology:
Why are they important and can they be minimized?,
Crit Rev Oncol Hematol 2005; 55: 117-142.
8. Gansauge F i wsp. NSC-631570 (Ukrain) in the palliative treatment of pancreatic cancer. Results of a phase II
trial. Langenbecks Arch Surg 2002; 386:570-574.
9. Gansauge F i wsp. The clinical efficacy of adjuvant systemic chemotherapy with gemcitabine and NSC-631570
in advanced pancreatic cancer. Hepatogastroenterology
2007; 54: 917-920.
10.Bangert CA, Costner MI. Methotrexate in dermatology.
Dermatol Ther 2007; 20: 216-228.
11.Green MR, Chamberlain MC. Renal dysfunction during
and after high-dose methotrexate. Cancer Chemother.
Pharmacol 2009, 63:599-604.
12.Strang A, Pullar T.Methotrexate toxicity induced by acute renal failure. J R Soc Med 2004; 97: 536-537.
13.Świerkot J. Działanie niepożądane w czasie terapii metotreksatem u chorych na reumatoidalne zapalenie stawów. Adv Clin Exp Med 2007, 16: 287-295.
14.Angielski S. Nerki. W: Biochemia kliniczna. Red. Angielski S, Jakubowski Z, Dominiczak MH. Wyd. Preseusz, Sopot 1997, 44-78.
15.Jovanovic D i wsp. Serum cystatin C and β2-microglobulin
as markers of glomerular filtration rate. Ren. Fail. 2003,
25: 123 – 133.
dr n. farm. Magdalena Izdebska
Katedra i Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie
ul. Chodźki 8, 20-093 Lublin
tel/fax 81 718 75 63
37
INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OF
MANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY
1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewed
transdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicine and related sciences. The journal publishes conference
reports and materials, conference announcements, as well as
letters to the Editor.
2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printed
and an electronic form. Electronic versions of articles are to be
sent to [email protected] or supplied on
CD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagrams
and figures) should be addressed to:
3.
4.
5.
6.
7.
8.
38
41-200 Sosnowiec
ul. Jedności 8
Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345
Fax: +48 32 364 11 58
Disk label should contain the first name(s) and surname(s)
of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphics
should be included in separate files. Do not paste pictures and
graphics to text files. The Editor advises to use Star Office,
Word, or Word Perfect. The acceptable graphics format is *.
TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi.
All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief. The Authors are encouraged to suggest their reviewers, however the final selection of a reviewer is up to the Editorial Board. The Editors-in-Chief reserves the right to correct or
abbreviate the text (after the Author’s approval).
Authors are requested to resubmit the revised manuscript
within four weeks. Papers that are not resubmitted within
four weeks will be treated as a new submission.
The manuscript that has been rejected by the Scientific
Review in Pharmacy should not be resubmitted.
A cover letter should be included with the manuscript, containing a declaration that the manuscript has not been previously
published in print or electronic format and is not under consideration by another journal or electronic medium, signed by all
the Authors. It should also include written approval from the
head of the institution in which the study was conducted.
All human and animal research will have obtained ethical consent from the local Bioethical or Ethical Committee.
The material sent in and the review will remain among the
documentation of the Board of Editors.
Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the whole
of the copyrights for the published papers (including the right
to publishing in print, on electronic media, such as CD-ROM
disks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries is
allowed without any written permission of the Editor.
Instructions for authors:
8.1. Manuscript Page Setup
• Paper: white, A4 format.
• Margins: 2.5 cm (top, left, right, bottom)
• Font: Times New Roman, no smaller than 12 points.
• Text: Double-spaced, one side of the page only.
• Numbering: Insert page numbers at bottom right of each
page.
• Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extra
line space between paragraphs.
• Subheads: All subheads should be flush with the left margin,
with one line above. Indent first line after a subhead. Use an
extra line space between the subhead and the text.
• Title or Heading of the article: boldface, on separate
line.
• Second-level subhead: boldface, on separate line.
• Third-level subhead: italic, on separate line.
8.2. Organization of Manuscript
• Title page should include: submission date and Author(s)
full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’
full current affiliations (for papers with multiply authors,
please enumerate the authors and their affiliations in the
following way: Author1, Author2, etc; 1Affiliation, 2Affiliation,
etc.). Affiliations should contain the full name of the institution. One corresponding author must be designated for
papers with coauthors. At the bottom of the page the full
name, academic degrees/titles, and address of the corresponding author should be given, including the telephone
number, fax number and/or e-mail address. If research
has been funded, please indicate the source of funding
(including grant index/symbol, grant agencies, corporations, or sponsors).
• The second page should include an abstract (150-250
words). The abstract must be self-contained, and must not
require reference to the paper to be understood. The abstract should present objectives and scope of the study or
reasons for writing the paper. The methods and techniques
or approaches should be described only to the extent necessary for comprehension. The findings and conclusions
should be concise and informative. The abstract should
be followed by the key words consistent with the Medical
Subject Headings Index Medicus, and should not contain
unfamiliar terms that are not defined, undefined acronyms
and reference citations. Neither displayed equations or
lists should appear in the abstract.
• Body text should be organized as follows:
original paper - introduction, material and methods descriptions, research results, discussion;
review papers – free structure;
case studies – introduction (motivation for the study), case
descriptions, discussion of the characteristic symptoms,
treatment results etc.
• Figures (diagrams, drawings, color or black-and-white
photographs) should be put into a separate envelope. On
each figure there should be its number (Arabic numerals),
the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking.
Figure captions should be placed on separate pages and
numbered consecutively using Arabic numerals. Previously published visual materials should be supplied together
with the written consent of the Publisher for reprint.
• Tables, each on a separate page, should be numbered
using Roman numerals and preceded by their captions.
Table captions should be placed on separate pages, numbered using Roman numerals.
• The papers should not exceed the following limitations:
original and review work – 10 pages and others – 5 pages.
8.3. References to the works cited should be presented at the end of the paper and arranged according to the sequence
of citations in the body text. The acronyms for journal titles
should be used according to Index Medicus. Each entry,
starting with a new line, should be given a number and
must be presented as follows:
• journal citation:
Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic
multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117:
557-67.
If there are more than three authors, the name of the first
one should be given, followed by an ,,et al” annotation.
Komosińska-Vassev K et al. Graves’ disease-associated
changes in the serum lysosomal glycosidases activity and
glycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331:
97-102.
• the specific chapter:
Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. Biochemia
Harpera. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.
Warszawa 1994, 59-69.
• monograph:
Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw
2004.
References to the works cited within the text should be numbered using Arabic numerals and placed between brackets,
e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations: original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliography entries.
REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM
1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowane prace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe, z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych. Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na temat
konferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji.
2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłać w formie elektronicznej na adres: kolegium.redakcyjne@
kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dysku CDROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego
(z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji:
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
41-200 Sosnowiec
ul. Jedności 8
Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345
Fax: +48 32 364 11 58
Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów)
i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory.
Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych.
Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word,
Word Perfect. Akceptowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor:
CMYK, rozdzielczość 300 dpi.
Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonych każdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca się
autorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcja
zastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta,
jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniu z autorem).
Autorzy proszeni są o odesłanie poprawionego manuskryptu, zgodnie z uwagami recenzenta, w terminie nieprzekraczającym czterech tygodni. W przeciwnym razie
praca będzie traktowana jako nowa publikacja.
Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta nie
może być ponownie przedkładany Redakcji Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego.
Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie była
uprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcji
innego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawierać również podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodę
Kierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczenie
publikacji w czasopiśmie.
Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, które
są przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, muszą
mieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej.
Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacji Redakcji.
Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskich
do wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, na
nośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszcza się natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy.
Instrukcje dla autorów
8.1.Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu:
• Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, na
białym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnego
odstępu między kolejnymi wierszami.
• Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny).
• Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt.
• Numeracja stron – kolejne numery stron, począwszy od
strony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnym rogu.
• Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowych odstępów pomiędzy kolejnymi akapitami.
• Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównane
do lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstem należy wprowadzić jeden odstęp.
• Tytuł pracy – powinien być napisany pogrubioną czcionką.
• Tytuł rozdziału – powinien być napisany pogrubioną
czcionką.
• Tytuł podrozdziału – powinien być napisany pochyloną
czcionką,
8.2 Układ manuskryptu
• Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowych przy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afilia-
3.
4.
5.
6.
7.
8.
cję każdego z nich, w następujący sposób Autor1, Autor2,
…; 1Afiliacja, 2Afiliacja; tytuł pracy w języku polskim i angielskim, nazwę placówki naukowej skąd pochodzi praca.
U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres,
telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję, dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanych prosimy o wskazanie źródła finansowania (w tym
numery dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lub
sponsorów).
• Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie (150-250 słów w języku polskim i angielskim), będące
autonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczać odnośników literaturowych. Streszczenie powinno
zawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawowe
procedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych, metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Pod
streszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w języku
polskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject Headings
Index Medicus.
• Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały,
według następującego schematu:
prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań,
dyskusja oraz wnioski;
prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziały i podrozdziały;
prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby, charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp.
• Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe) powinny być umieszczone w osobnej kopercie, ponumerowane, opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy,
z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać na
oddzielnej stronie z numerami ilustracji podanymi cyframi arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane, należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy na
ponowną publikację.
• Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należy ponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułami
umieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać na
oddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframi
rzymskimi.
• Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinna
wynosić 10, a pozostałych – 5 stron.
8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowania w tekście pracy.
Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z Index
Medicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza,
powinna być opatrzona numerem oraz zredagowana
zgodnie z niżej podanym przykładem:
• czasopismo naukowe:
np.: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic
multisystem fibrotic
disorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67.
Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podać nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.
np.: Komosińska-Vassev K i wsp. Graves’ disease-associated changes in the serum lysosomal glycosidases activity
and the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003;
331: 97-102.
• wydawnictwo zbiorowe:
np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: Biochemia Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1994, 59-69.
• monografia:
np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław
2004.
Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych, powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1].
Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracach
oryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do
10 pozycji.
39
Farmaceutyczny
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
IC Value - Current 3.66
MNiSW 4
Prosimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literami
i dokonanie wpłat na poczcie lub w banku.
Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu.
Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej prenumeraty otrzymają Państwo po około 2 tygodniach
od dokonania wpłaty.
Dodatkowych informacji udziela Dział Prenumeraty
i Kolportażu:
Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiego
ul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Biała
TEL. 033 817 38 99
WYDAWCA
Nr rachunku odbiorcy:
0
PRENUMERATA
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
ODBIORCA:
kwota:.......................................................................................
wpłacający:..............................................................................
.................................................................................................
.................................................................................................
Zamawiam
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
Nr ............
Nr rachunku odbiorcy:
0
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
ODBIORCA:
kwota:.......................................................................................
wpłacający:..............................................................................
.................................................................................................
.................................................................................................
Zamawiam
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
Nr ............
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY

Scientific Review in Pharmacy - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transkrypt

Podobne dokumenty

Analiza DNA - praktyka - Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

Mikroturbina wiatrowa o pionowej osi obrutu 3 KW - M

12.3. Inhibitory topoizomerazy