doc- Annals of Parasitology
download 
Reklamacja Transkrypt
- Annals of Parasitology
Wiadomoœci Parazytologiczne 2006, 52(4), 263–269 Copyright© 2006 Polskie Towarzystwo Parazytologiczne Artykuły przeglądowe Wykorzystanie sekwencji genu rRNA w molekularnej diagnostyce parazytologicznej Molecular diagnostic of parasites using rRNA gene sequence Ewa Długosz i Marcin Wiśniewski Zakład Parazytologii i Inwazjologii, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02−786 Warszawa, Polska Adres do korespondencji: Ewa Długosz, E−mail: [email protected] ABSTRACT. Ribosomal RNA (rRNA) is a component of the ribosomes. Eukaryotic ribosomes contain four different rRNA molecules: 18S, 5,8S, 28S and 5S rRNA. rRNA is the most conserved (least variable) gene in all cells. For this reason, genes that encode the rRNA (rDNA) are sequenced to identify an organism's taxonomic group, calculate relat− ed groups, and estimate rates of species divergence. Especially the internal transcribed spacers (ITS) are very useful for molecular diagnostic of parasite. They are noncoding regions of DNA sequence that separate genes coding for the 28S, 5.8S, and 18S ribosomal RNAs. These ribosomal RNA (rRNA) genes are highly conserved across taxa while the spac− ers between them may be species−specific. In this paper authors describe practical using of rRNA gene to parasite diag− nostic. Key words: Internal Transcribed Spacer, ribosomal RNA gene Wstęp rRNA wraz z białkami tworzy strukturę ryboso− mu. W skład dużej i małej podjednostki rybosomu wchodzą swoiste łańcuchy rRNA. U Eukaryota 18S rRNA wchodzi w skład małej podjednostki, a 5S, 5,8S i 28S rRNA dużej podjednostki. Geny ko− dujące 5,8S, 18S i 28S rRNA tworzą wspólną jedno− stkę transkrypcyjną, która jest transkrybowana przez RNA polimerazę I. Powstanie dojrzałych czą− steczek 18S, 5,8S i 28S polega na przetworzeniu długiej (45S RNA o długości 12,5 kb u ssaków) czą− steczki prekursorowej przez serię skomplikowanych reakcji [1–3]. U większości Eukaryota jednostka ta jest tandemowo powtórzona w genomie. Pierwotny transkrypt jednostki powtarzającej się zawiera ko− lejno ułożone geny 18S, 5,8S i 28S rRNA rozdzie− lone sekwencjami ITS (internal transcribed spacer), ITS1 pomiędzy 18S rRNA i 5,8S rRNA oraz ITS2 pomiędzy 5,8S i 28S rRNA. Końce 5' i 3' pierwot− nego transkryptu są przedłużone o dodatkowe se− kwencje tzw. ETS (external transcribed spacer) [4]. Scharakteryzowano również region IGS (intergenic spacer), który rozdziela rRNA dużej podjednostki rybosomu (LSU) (kodujący 5,8S i 28S rRNA) jed− nego powtórzenia od rRNA małej podjednostki (SSU) (kodujący 18S rRNA) sąsiedniego powtórze− nia. IGS zawiera miejsce inicjacji transkrypcji, które wyznacza początek 5'ETS [3]. Opisano mię− dzy innymi IGS pierwotniaka Crithidia fasciculata, który jest heterogenny pod względem długości, za− wiera tandemowo powtórzone kopie 19 nukleotydo− wej sekwencji i 4 kopie 55 nukleotydowego po− wtórzenia [3]. Geny kodujące rRNA (18S, 5,8S, 26S) są wyso− ce homologiczne i wykazują podobieństwo nawet między odległymi ewolucyjnie organizmami. Nato− miast regiony ITS ewoluowały znacznie szybciej i wykazują duże zmiany w długości i zawartości za− sad GC pomiędzy odległymi Eukaryotami [3, 5]. Długie domeny o bardzo dużej homologii są często przemieszane z regionami o bardzo niskiej bądź ze− 264 E. D³ugosz, M. Wiœniewski A. A. A. U. N. caninum ceylanicum braziliense stenocephala americanus TAGCTTCAGCGATGGATCGGTCGATTCGCGTATCGATGAAAAACGCAGCTAGCTGCGTTA TAGCTTCAGCGATGGATCGGTCGATTCGCGTATCGATGAAAAACGCAGCTAGCTGCGTTA TAGCTTCAGCGATGGATCGGTCGATTCGCGTATCGATGAAAAACGCAGCTAGCTGCGTTA TAGCTTCAGCGATGGATCGGTCGATTCGCGTATCGATGAAAAACGCAGCTAGCTGCGTTA TAGCTTCAGCGATGGATCGGTCGATTCGCGTATCGATGAAAAACGCAGCTAGCTGCGTTA ************************************************************ 60 60 60 60 60 A. A. A. U. N. caninum ceylanicum braziliense stenocephala americanus TTTACCACGAATTGCAGACGCTTAGAGTGGTGAAATTTTGAACGCATAGCGCCGTTGGGT TTTACCACGAATTGCAGACGCTTAGAGTGGTGAAATTTTGAACGCATAGCGCCGTTGGGT TTTACCACGAATTGCAGACGCTTAGAGTGGTGAAATTTTGAACGCATAGCGCCGTTGGGT TTTACCACGAATTGCAGACGCTTAGAGTGGTGAAATTTTGAACGCATAGCGCCGTTGGGT TTTACCACGAATTGCAGACGCTTAGAGTGGTGAAATTTTGAACGCATAGCGCCGTTGGGT ************************************************************ 120 120 120 120 120 A. A. A. U. N. caninum ceylanicum braziliense stenocephala americanus TTTCCCTTCGGCACGTCTGGTTCAGGGTTGT TTTCCCTTCGGCACGTCTGGTTCAGGGTTGT TTTCCCTTCGGCACGTCTGGTTCAGGGTTGT TTTCCCTTCGGCACGTCTGGTTCAGGGTTGT TTTCCCTTCGGCACGTCTGGTTCAGGGTTGT ******************************* Rys. 1. Porównanie sekwencji nukleotydowych genu 5,8S rRNA dostępnych w bazie danych NCBI wybranych nicieni z rodziny Ancylostomatidae (w nawiasie umieszczono numer dostępu): Ancylostoma canium (Z70739), Ancylostoma ceylanicum (Z70740), Ancylostoma braziliense (DQ438069), Uncinaria stenocephala (AF 217891), Necator ameri− canus (AF217891). Gwiazdką oznaczono nukleotydy identyczne w sekwencji. Porównanie wykonano programem ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html) Fig. 1. Alignment of nucleotide sequences of 5.8 rRNA gene of Ancylostomatidae nematodes from NCBI database (accession numbers in brackets): Ancylostoma canium (Z70739), Ancylostoma ceylanicum (Z70740), Ancylostoma braziliense (DQ438069), Uncinaria stenocephala (AF 217891), Necator americanus (AF217891). Nucleotides identi− cal in all sequences are marked with asterisks. Alignment was done using ClustalW program (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html) rowej homologii (Rys. 1, 2). Na Rys. 1 można zaobserwować 100% homolo− gię w sekwencji kodującej 5,8S rRNA wybranych nicieni z rodziny Ancylostomatidae. Z kolei zesta− wienie sekwencji ITS1 tych samych pasożytów, po− kazuje wyraźne różnice w zapisie DNA. Stąd też rybosomalny DNA jest bardzo użyteczny do celów diagnostycznych. W diagnostyce molekularnej wy− korzystywane są głównie sekwencje ITS, ponieważ regiony te są jednymi z najbardziej zróżnicowa− nych loci [6]. Istnieje wiele doniesień naukowych potwierdzających użyteczność regionów ITS w dia− gnostyce molekularnej pasożytów. Uważa się, że zapis sekwencji ITS stanowi pewnego rodzaju odbicie ewolucyjnych zmian zachodzących w orga− nizmie. Każdemu gatunkowi, a często nawet kon− kretnym szczepom, można przypisać swoisty dla niego zapis sekwencji nukleotydowej tego regionu rDNA, co praktycznie stanowi swoisty dla niego znacznik. Głównym celem tej pracy jest pokazanie wyko− rzystania zapisu sekwencji ITS w diagnostyce na przykładzie wybranych inwazji pasożytniczych. Wykorzystanie rDNA w diagnostyce parazytologicznej Inwazje nicienie żołądkowo−jelitowych to najpo− ważniejszy problem w hodowli przeżuwaczy na ca− łym świecie. Tylko w Stanach Zjednoczonych stra− ty powodowane przez te pasożyty są szacowane na 2 miliardy dolarów rocznie. Szybka i dokładna iden− tyfikacja gatunków pasożytujących w danym sta− dzie pozwoli na efektywną kontrolę inwazji, na za− hamowanie transmisji pasożytów i zmniejszenie strat hodowców. Również ustalenie odpowiedniego leczenia jest ważne z punktu widzenia konsumen− tów, którzy obawiają się zbyt dużych pozostałości leków w mięsie oraz z powodu szerzącej się wśród pasożytów lekooporności [7]. Istnieją trudności w dokładnej diagnozie gatunków nicieni żołądko− wo−jelitowych na podstawie różnic morfologicz− nych jaj pasożytów, stąd poszukiwania szybkich i skutecznych molekularnych metod identyfikacji pasożytów. Zarlenga i wsp. [7] opracowali test wy− korzystujący multiplex PCR do różnicowania pięciu ważnych nicieni żołądkowo jelitowych bydła w Sta− Gen rRNA w diagnostyce parazytologicznej 265 A. A. A. U. N. ceylanicum braziliense caninum stenocephala americanus GTCGAAGCCAAATAATGGTTCCTT-TGATCCTGAGAAACCAACGTGCTAGTCT---TCAC -----------------------------------------ACGTGCTAGTCT---TCAC ----------------GGTTCCTT-TGATCCTGAGAAAC-AACGTGCTAGTCT---TCAC ----------------GGTTCCTT-TGATCCTGAGAAACCAACGTGCTAGTCT---TCAC -TCGAAACCTTCTATGGTTTATTCATGATCTAGAGAAACCAACACGCTAGTGTGATTCAC ** ****** * **** 56 16 39 40 59 A. A. A. U. N. ceylanicum braziliense caninum stenocephala americanus GACTTTGTCGGGAAG---GTTGGGAGTATCGCCC-CCGTTATAGCCCTTCTGTAAGGTGT GACTTTGTCGGGAAG---GTTGGGAGTATCGCCC-CCGTTATAGCCCTTCTGTAAGGTGT GACTTTGTCGGGAAG---GTTGGGAGTATCGCCCACCGTTACAGCCCTA-TGTAAGGTGT GACTTTGTCGGGAAG---GTTGGGAGTATCGCCC-CCCTTTGAGCCCAA-CGTGAGGTGT GACTTTGTCGTGTAATAAGTTGGGAGTATCACCACCCTTTTTAGCCCAA-TGTGAGGTGT ********** * * ************ ** ** ** ***** ** ****** 112 72 95 95 118 A. A. A. U. N. ceylanicum braziliense caninum stenocephala americanus CTATGTACAGCATGAGTCGTTC------------CTGGGTGGCGGCAGTGATTGCTTGTA CTATGTACAGCATGAGTCGTTC------------CTGGGTGGCGGCAGTGATTGCTTGTA CTATGTGCAGCAAGAGTCGTTA------------CTGGGTGGCGGCAGTGATTGCT-GTG CTATGTGCAGCAAGAGCCGTTT------------CTGGGTGGCGGCCGTGATTGCT-GTG CTATGCTTGGCAAGAGTCGTTTACTGTATGTTGGTTGGGTGACGGCTATGATTGCTTG-G ***** *** *** **** ****** **** ******** * 160 120 142 142 177 A. ceylanicum A. braziliense A. caninum U. stenocephala N.americanus CGAAGCTCGCGG-------------------------TTTCGTCA--------------CGAAGCTCGCGG-------------------------TTTCGTCA--------------CGAAGTTCGCG--------------------------TTTCGCT---------------CGAAGTTCGCG--------------------------TTTCGCT---------------CAAAGTTCGCTGTACGTGTTGTATGTGTGCGTGTGCATTGCGTTAACATTGTATACCTGT * *** **** ** ** 180 140 160 160 237 A. A. A. U. N. ceylanicum braziliense caninum stenocephala americanus --------------------GAGCTTTAGACTTGATGAGCATTGCTAGAATGCCGCCTTA --------------------GAGCTTTAGACTTGATGAGCATTGCTAGAATGCCGCCTTA --------------------GAGCTTTAGACTTGATGAGCATTGCATGAATGCCGCCTTA --------------------GAGCTTTAGACTTGATGAGCATTGCTGGAATGCCGCCTTA ACATACGCATGAATACAGCTGAGCTTATGACTTGATGAGCATTGCTTGAATGCCGCCTCA ****** ***************** *********** * 220 180 200 200 297 A. A. A. U. N. ceylanicum braziliense caninum stenocephala americanus CSTGCTTGTGTTGGTGGTTGAGCGCTAGGC--TAAC--GCCTGGTGCGGCACCTGTCT-CCTGCTTGTGTTGGTGGTTGAGCGCTAGGC--TAAC--GCCTGGTGCGGCACCTGTCT-C-TGCTTGTGTTGGTGGTTGAGCATTAGGC--TAAC--GCCTGATGCGGCACCTGTCT-C-TGTTTGTGTTGGTGGTTGGGCATTAGGCGGCAAC--GTCTGGTGCGACACCTGTTT-A-TTTTTGTATTGGTGGTTGGACACACACACATAACTTGTGTGGTGTGGTACCTGTTCTT * **** ********** * *** * ** ** * ****** 274 234 253 255 356 A. A. A. U. N. ceylanicum braziliense caninum stenocephala americanus ---GTCAGGAAACCTTAATGATC-------TGCTAAC-------------------------GTCAGGAAACCTTAATGATC-------TGCTAAC-------------------------GTCAGGAAACCTTAATGATC-------TGCTAAC-------------------------GTCAGGAAACCTTAATGATC-------TGCTCAC----------------------GTGATCAGGAAACGTTAATGATCCTTCACATGTTAACCAATAATGCGCGCTACGTGTTAT ********* ******** ** * ** 301 261 280 282 416 A. A. A. U. N. ceylanicum braziliense caninum stenocephala americanus -------------------GCGGACGCCAGCACAG--CAATAACTTTTAACGTTTAATGT -------------------GCGGACGCCAGCACAG--CAATAACTTTTAACGTTTAATGT -------------------GCGGACGCCAGTACAG--CAATAACTTTTTACGTTTAATGT -------------------GTGGACGCCAATACAG--CACTAACTTTTTACGTTTGATGT GGTGGATGGGACAATATGTGTGGACGCCAACACAAAATATTAACTTTTTACATTTGATGT * ******** *** * ******** ** *** **** 340 300 319 321 476 A. A. A. U. N. ceylanicum braziliense caninum stenocephala americanus TTGCAGA--ATCGTGACGTTAT-------GTCACAATCGA----TTGCAGA--ATCGTGACGTTAT-------GTCACAATCGA----TTGCAGA--ATCGTGACTTTAC-------GTCACAATCGA----TTGCAGA--ATCGTGACTTTAT-------GTCACAA--------TTGCAGATGATCGTGACTTCATCTTAGTCGTCACATTAGACTCGA ******* ******** * * ****** 371 331 350 348 521 Rys. 2. Porównanie sekwencji nukleotydowych ITS1 dostępnych w bazie danych NCBI wybranych nicieni z rodziny Ancylostomatidae (w nawiasie umieszczono numer dostępu): Ancylostoma ceylanicum (Z70740), Ancylostoma braziliense (DQ438069), Ancylostoma canium (Z70739), Uncinaria stenocephala (AF 217891), Necator americanus (AF217891). Gwiazdką oznaczono nukleotydy identyczne w sekwencji. Porównanie wykonano programem ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html) Fig. 2. Alignment of nucleotide sequences of ITS1 of Ancylostomatidae nematodes from NCBI database (accession numbers in brackets): Ancylostoma ceylanicum (Z70740), Ancylostoma braziliense (DQ438069), Ancylostoma canium (Z70739), Uncinaria stenocephala (AF 217891), Necator americanus (AF217891). Nucleotides identical in all sequences are marked with asterisks. Alignment was done using ClustalW program (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ index.html) 266 nach Zjednoczonych. Zaprojektowali pięć par star− terów w oparciu o sekwencje wewnętrznych (ITS) i zewnętrznych (ETS) sekwencji transkrybowanych rDNA oraz fragment końca 3'rDNA małej podjed− nostki rybosomu i końca 5' rDNA dużej podjednost− ki. Efektem jednoczesnego użycia tych starterów w reakcji PCR na matrycy DNA pochodzącego z jaj pasożytów oczyszczonych z kału bydła było uzy− skanie specyficznego układu elektroforetycznego prążków. Każdy z prążków był charakterystyczny dla danego gatunku: Ostertagia ostertagi (257 pz), Haemonchus placei (176 pz), Oesophagostomum radiatum (329 pz), Trichostrongylus colubriformis (243 pz) i Cooperia oncophora (151 pz). Opracowano również test pozwalający na iden− tyfikację Mecistocirrus digitatus, jednego z najbar− dziej powszechnych pasożytniczych nicieni bydła w krajach azjatyckich obok O. ostertagi i C. onco− phora [6]. Reakcja PCR ze starterami obejmujący− mi fragment rDNA pomiędzy ITS1 a ITS2 pozwala również na odróżnienie M. digitatus od innych ni− cieni żołądkowo−jelitowych. Do analizy rDNA oprócz PCR używane są inne techniki biologii molekularnej, np. SSCP (single− strand conformation polymorphism). Zasada SSCP polega na różnicy w mobilności elektroforetycznej w niedenaturującym żelu jednoniciowej cząsteczki DNA. Jednoniciowa cząsteczka przyjmuje w roz− tworze wodnym drugo− i trzeciorzędowe konforma− cje, zależne od jej długości, liczby i położenia miejsc parowania zasad, a więc od jej sekwencji nu− kleodtydowej. Dzięki temu na żelu rozdzielone mo− gą zostać cząsteczki różniące się tylko jednym nu− kleotydem [8]. Analiza sekwencji ITS1 i ITS2 za pomocą techniki SSCP jest z powodzeniem stoso− wana do identyfikacji gatunków i szczepów pasoży− tów, które nie mogą być rozróżnione na podstawie cech morfologicznych [8–10]. Gasser i wsp. [9] użyli SSCP do rozróżnienia dwóch pasożytów świń: Oesophagostomum denatum i O. quadrispinulatum poprzez analizę ITS2. W podobny sposób zidentyfi− kowano i rozróżniono między sobą siedem gatun− ków tęgoryjców: Ancylostoma caninum, A. tubae− forme, A. ceylanicum, A. duodenale, Uncinaria ste− nocephala, Bunostomum trigonocephalum i Neca− tor americanus [10]. W oparciu o ewolucyjnie konserwatywną se− kwencję genu 18S rRNA zaprojektowano startery do amplifikacji charakterystycznego fragmentu dla Babesia canis, przenoszonego przez kleszcze gro− źnego dla psów pierwotniaka, powodującego babe− szjozę [11]. Analiza PCR wykazała obecność pier− E. D³ugosz, M. Wiœniewski wotniaka w krwi badanych psów z terenu Warsza− wy. Analiza porównawcza sekwencji uzyskanych produktów z innymi dostępnymi w bazie danych wykazała, że badany pasożyt należy do szczepu Ba− besia canis canis. W podobny sposób potwierdzono obecność. B. canis canis u psów na Węgrzech [12]. Dzięki różnicom w sekwencji ITS1 można iden− tyfikować dwa gatunki kokcydiów o bardzo podob− nej morfologii: Toxoplasma gondii i Hammondia hammondi. Mimo wielu podobieństw gatunki te różnią się patogennością, T. gondii jest ważnym pa− togenem ludzi i zwierząt, natomiast H. hammondi nie jest chorobotwórczy. Sreekumar i wsp. [13] opracowali, w oparciu o sekwencje ITS1, trzy zesta− wy starterów: pierwszy charakterystyczny dla T. gondii, H. hammondi, H. heydorni i Neospora cani− num, drugi specyficzny dla H. hammondi, oraz trze− ci, charakterystyczny dla T. gondii. Za pomocą pierwszej pary diagnozowana jest obecność pier− wotniaków z rodziny Toxoplasmidae (prążek o dłu− gości 400 pz), drugiej pary — inwazja H. hammon− di (339 pz), a za pomocą trzeciej pary — T. gondii (294 pz). Jednymi z najgrożniejszych pasożytów na ziemi są pierwotniaki z rodzaju Plasmodium wywołujące malarię. Tradycyjne metody diagnozowania malarii — mikroskopia świetlna oraz alternatywne testy se− rologiczne — są czasochłonne, mniej specyficzne i mniej czułe od technik molekularnych oraz często nie określają dokładnie gatunku pasożyta [14]. Opracowano wiele testów opierających się na se− kwencji genu 18S rRNA Plasmodium spp. wyko− rzystujących PCR bądź polimorfizm pojedynczej nici RNA (SSCP) [15–17]. Jednakże testy oparte na technice PCR często wymagają wielu analiz wyko− nanych na jednej próbce, analizy różnych produk− tów PCR, a także nie dają informacji na temat inten− sywności inwazji. Aby wyeliminować te trudności Perandin i wsp. [14] wykorzystali technikę Real−ti− me PCR do diagnostyki malarii. Technika ta oparta jest na znacznikach fluorescencyjnych używanych do monitorowania przyrostu produktu reakcji w czasie rzeczywistym. Zastosowanie starterów komplementarnych do sekwencji genu 18S rRNA umożliwiło skuteczną diagnozę i rozróżnienie trzech gatunków zarodźca: P. falciparum, P. vivax i P. ovale. Zastosowanie Real−time PCR pozwoliło również na szacunkowe oznaczenie liczby pasoży− tów w krwi badanych pacjentów. Testy molekularne opierające się na różnicach w rybosomalnym RNA są często wykorzystywane do rozróżniania gatunków o bardzo podobnej mor− Gen rRNA w diagnostyce parazytologicznej fologii, jak w przypadku dwóch gatunków ameb: Entamoeba histolytica i E. dispar. Jedynie E. histo− lytica jest patogenem, ale ponieważ gatunki te trud− no rozróżnić, stosuje się leki w przypadku obu in− wazji, choć tylko 10% to inwazje chorobotwórcze− go gatunku [18]. Gatunki te można także rozróżniać na podstawie analizy izoenzymów lub z użyciem specyficznych przeciwciał monoklonalnych, ale stosowanie wymienionych metod zajmuje dużo cza− su. Gonin i Trudel [18] opracowali test PCR do roz− różnienia E. histolytica i E. dispar. Wynikiem reak− cji z użyciem starterów komplementarnych do RNA małej podjednostki rybosomu (SSU rRNA) były produkty o charakterystycznej długości: 240 pz dla E. dispar i 266 pz dla E. histolytica. Testy molekularne są przydatne wtedy, gdy in− wazję pasożytów trudno zdiagnozować tradycyjny− mi metodami. Czułość mikroskopowego badania kału pod kątem obecności Giardia intestinalis wy− nosi od 50 do 70% z powodu nieregularnego wyda− lania z kałem cyst lub trofozoitów pierwotniaka oraz niewystarczających umiejętności personelu [19]. Użycie czułej metody molekularnej może wie− lokrotnie poprawić ten wynik. Gosh i wsp. [19] uży− li dwóch par starterów do diagnostyki G. intestina− lis w kale pacjentów metodą nested PCR. Pierwsza para obejmowała region IGS o długości 552 pz. Na− stępnie w celu zwiększenia czułości reakcję prze− prowadzono z drugą parą starterów komplementar− nych do wewnętrznej sekwencji pierwszego pro− duktu i uzyskano prążek o długości 320 pz. Autorzy potwierdzili wyższość nested PCR nad mikroskopią i technikami serologicznymi do identyfikacji tego pierwotniaka. Tasiemce Taenia solium i T. saginata mają waż− ne znaczenie w medycynie ludzkiej i weterynaryj− nej. Pierwszy gatunek powoduje cysticerkozę trzo− dy chlewnej, drugi bydła. Żywicielem ostatecznym obu gatunków jest człowiek. Szczególnie groźne dla człowieka jest zarażenie jajami T. solium, ponieważ prowadzi ono do wągrzycy ośrodkowego układu nerwowego. Stwierdzone w kale człowieka człony tasiemców T. solium i T. saginata są do siebie podobne, dlatego szuka się skutecznych metod iden− tyfikacji. Dokładne rozpoznanie nosicieli T. solium jest istotne, ponieważ są oni źródłem jaj tasiemca, które dostawszy się do układu pokarmowego ludzi z otoczenia chorego mogą powodować neurocysti− cerkozę. Również u nosicieli, w wyniku autoinwa− zji, może dojść do rozwoju wągrzycy. Gonzalez i wsp. [20] badali zastosowanie PCR z użyciem starterów opartych o sekwencje ITS1 i ITS2 tasiem− 267 ców w celu rozróżnienia członów Taenia spp. uzy− skanych z kału pacjentów. Metoda ta pozwoliła na szybką i czułą identyfikację gatunkową nawet w przypadku zniszczonych i pofragmentowanych członów pasożyta. Autorzy pracy wykorzystali rów− nież sekwencje ITS do zbadania różnic wewnątrz− gatunkowych tasiemców izolowanych w odległych rejonach geograficznych. Do tego celu użyli techni− ki PCR−RFLP (polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych), produkty PCR trawili enzymami czterotnącymi. Nie wykazano różnic wewnątrz ga− tunku T. solium, jedynie izolat T. saginata z Kenii różnił się od innych tasiemców tego gatunku pocho− dzących z Hiszpanii i Meksyku. Innym groźnym dla ludzi tasiemcem jest Echino− coccus granulosus. Istnieje wiele szczepów tego ta− siemca, które wykazują różnorodność morfologicz− ną, rozwojową i różnych żywicieli. Różnorodność tę potwierdziły badania molekularne, oparte między innymi na analizie rybosomalnego RNA; rozpozna− no 10 szczepów G1−G10 [21, 22]. U ludzi zanoto− wano w większości inwazje szczepów G1 i kilka przypadków G5 i G6, lecz brakuje ilościowych da− nych na temat inwazji poszczególnych szczepów [21]. Nie ma również danych na temat ich rozprze− strzenienia geograficznego i znaczenia szczepów z medycznego punktu widzenia. Dinkel i wsp. [22] opracowali test rozróżniający szczepy G1, G5, G6 i G7 E. granulosus opierający się na sekwencji mi− tochondrialnego genu 12S rRNA, który może być przydatny do szybkiej diagnostyki dużej ilości próbek. Metodami molekulrnymi można również wykryć obecność pasożytów w żywicielach pośrednich. Magalhaes i wsp. [23] opracowali multiplex−PCR do wykrywania przywry Fasciola hepatica w ślima− kach Lymnaea columella. Pasożyt ten występuje na całym świecie, atakuje wiele gatunków zwierząt go− spodarskich (bydło, owce, kozy), powodując duże straty ekonomiczne. Identyfikacja przywry w żywi− cielu pośrednim ma znaczenie epidemiologiczne w kontroli rozprzestrzeniania się choroby oraz mo− nitorowania czystości pastwisk. Autorzy testu opra− cowali trzy pary starterów, pierwsza para komple− mentarna do fragmentu mitochondrialnego DNA F. hepatica zawierającego tandemowe powtórzenia 85 nukleotydowej sekwencji, druga do fragmentu ITS rDNA F. hepatica i trzecia do fragmentu ITS ślima− ka L. columella (produkt ten służył jako kontrola te− stu). Powyższe przykłady dowodzą ogromnej przy− datności znajomości sekwencji rDNA pasożytów 268 w opracowywaniu i wykonywaniu testów diagno− stycznych inwazji pasożytniczych metodami mole− kularnymi, które, jak pokazuje rzeczywistość, coraz częściej wypierają, bądź uzupełniają metody kla− syczne. Literatura [1] Perry R.P. 1976. Processing of RNA. Annual Review of Biochemistry 45: 605–62. [2] Michot B., Bachellerie J.P., Raynal F. 1983. Structure of mouse rRNA precursors. Complete sequence and potential folding of the spacer regions between 18S and 28S rRNA. Nucleic Acids Research 11: 3375–3391. [3] Schnare N.M., Collings J.C., Spencer D.F., Gray M.W. 2000. The 28S–18S rDNA intergenic spacer from Crithidia fasciculate: repeated sequences, length heterogeneity, putative processing sites and po− tential interactions between U3 small nucleolar RNA and the ribosomal RNA precursors. Nucleic Acids Re− search 28: 3452–3461. [4] van Nues R.W., Rientjes J.M.J., van der Sande C.A.F.M., Zerp S.F., Sluiter C., Venema J., Planta R.J., Raue H.A. 1994. Separate structural elements within internal transcribed spacer 1 of Saccharomyces cerevisiae precursor ribosomal RNA direct the forma− tion of 175 and 26S rRNA. Nucleic Acids Research 22: 912–919. [5] Veldman G.M., Klootwijk J., Van Heerikhuizen H., Planta R.J. 1981. The nucleotide sequence of the in− tergenic region between the 5.8S and 26S rRNA ge− nes of the yeast ribosomal RNA operon. Possible im− plications for the interaction between 5.8S and 26S rRNA and the processing of the primary trans− cript. Nucleic Acids Research 9: 4847–4862. [6] Mochizuki R., Endoh D., Onuma M., Fukumoto S. 2006. PCR−based species−specific amplification of ITS of Mecistocirrus digitatus and its application in identification of GI nematode eggs in bovine feces. Journal of Veterinary Medicine Science 68: 345–351. [7] Zarlenga D.S., Chute M.B., Gasbarre L.C., Boyd P.C. 2001. A multiplex PCR assay for differentiating eco− nomically important gastrointestinal nematodes of cattle. Veterinary Parasitology 97: 199–209. [8] Gasser R.B., Chilton N.B. 2001 Applications of sin− gle−strand conformation polymorphism (SSCP) to ta− xonomy, diagnosis, population genetics and molecu− lar evolution of parasitic nematodes. Veterinary Para− sitology 101: 201–213. [9] Gasser R.B., Woods W.G., Bjorn H. 1998. PCR−based SSCP to distinguish Oesophagostomum dentatum from O. quadrispinulatum developmental stages. In− ternational Journal for Parasitology 28: 1903–1909. [10] Gasser R.B., Monti J.R., Qian B.Z., Polderman A.M., Nansen P., Chilton N.B. 1998. A mutation E. D³ugosz, M. Wiœniewski scanning approach for the identification of hookworm species and analysis of population variation. Molecu− lar and Biochemical Parasitology 92: 303–312. [11] Sobczyk A.S., Kotomski G., Górski P., Wędrycho− wicz H. 2005. Usefulness of touch−down PCR assay for the diagnosis of atypical cases of Babesia canis canis infections in dogs. The Bulletin of the Veterina− ry Institute in Pulawy 49: 407–410. [12] Foldvari G., Hell E., Farkas R. 2005 Babesia canis canis in dogs from Hungary: detection by PCR and sequencing. Veterinary Parasitology 127: 221–226. [13] Sreekumar C., Vianna M.C.B., Hill D.E., Miska K.B., Lindquist A., Dubey J.P. 2005. Differential de− tection of Hammondia hammondi from Toxoplasma gondii using polymerase chain reaction. Parasitology International 54: 267–269. [14] Perandin F., Manca N., Calderaro A., Piccolo G., Galati L., Ricci L., Medici M.C., Arcangeletti M.C., Snounou G., Dettori G., Chezzi C. 2004. Develop− ment of a Real−Time PCR Assay for Detection of Pla− smodium falciparum, Plasmodium vivax, and Plasmo− dium ovale for Routine Clinical Diagnosis. Journal of Clinical Microbiology 42: 1214–1219. [15] Snounou G., Viryakosol S., Zhu X.P., Jarra W., Pi− nheiro L., Rosario V.E., Thaithong S. 1993. High sen− sitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and Biochemical Parasitology 61: 315–320. [16] Kawamoto F., Miyake H., Kaneko O., Kimura M., Dung N.T., Liu Q., Zhou M., Duc Dao L., Kawai S., Isomura S., Wataya Y. 1996. Sequence variation in the 18S rRNA gene, a target for PCR−based malaria diagnosis, in Plasmodium ovale from Southern Viet− nam. Journal of Clinical Microbiology 34: 2287–2289. [17] Seesod N., Nopparar P., Hedrum A., Holder A., Tha− ithong S., Uhlen M., Lundeburg J. 1997. An integra− ted system using immuno−magnetic separation, poly− merase chain reaction, and colorimetric detection for diagnosis of Plasmodium falciparum. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 56: 322–328. [18] Gonin P., Trudel L. 2003. Detection and differentia− tion of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar isolates in clinical samples by PCR and enzyme−lin− ked immunosorbent assay. Journal of Clinical Micro− biology 41: 237–241. [19] Ghosh S., Debnath A., Sil A., De S., Chattopadhyay D.J., Das P. 2000. PCR detection of Giardia lamblia in stool: targeting intergenic spacer region of multico− py rRNA gene. Molecular and Cellular Probes 14: 181–189. [20] Gonzalez L.M., Montero E., Puente S., Lopez−Velez R., Hernandez M., Sciutto E., Harrison L.J.S., Micha− el R., Parkhouse E., Garate T. 2002. PCR tools for the differential diagnosis of Taenia saginata and Taenia solium taeniasis/cysticercosis from different geogra− Gen rRNA w diagnostyce parazytologicznej phical locations. Diagnostic Microbiology and Infec− tious Disease 42: 243–249. [21] Eckert J., Thompson R.C.A. 1997. Intraspecific va− riation of Echinococcus granulosus and related spe− cies with emphasis on their infectivity to humans. Ac− ta Tropica 64: 19–34. [22] Dinkel A., Njoroge E.M., Zimmermann A., Walz M., Zeyhle E., Elmahdi I.E., Mackenstedt U., Romig T. 2004. A PCR system for detection of species and genotypes of the Echinococcus granulosus−complex, with reference to the epidemiological situation in ea− 269 stern Africa. International Journal for Parasitology 34: 645–653. [23] Magalhaes K.G., Jannotti Passos L.K., dos Santos Carvalho O. 2004. Detection of Lymnaea columella Infection by Fasciola hepatica through Multiplex− PCR. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 99: 421–424. Wpłynęlo 10 lipca 2006 Zaakceptowano 23 sierpnia 2006
