Analiza molekularna polimorFizmu szczepów 3TAPHYLOCOCCUS

&ARM0RZEGL.AUK †
!NALIZAMOLEKULARNAPOLIMORFIZMU
SZCZEPÌW3TAPHYLOCOCCUSSPP
IZOLOWANYCHZEuRODOWISKASZPITALNEGO
!NALYSISOFMOLECULARPOLYMORPHISMOF3TAPHYLOCOCCUSSPP
STRAINSISOLATEDFROMHOSPITALENVIRONMENT
2OBERT$7OJTYCZKA-AŒGORZATA+ÃPA$ANUTA)DZIK+RZYSZTOF*ASIK*ERZY0ACHA$ANIEL+RAKOWIAN
|UKASZ-AREK$OMINIK3KIBA!DAM+UDELSKI
+ATEDRAI:AKŒAD-IKROBIOLOGII7YDZIAŒU&ARMACEUTYCZNEGOZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJW3OSNOWCU
gL’SKIEGO5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW+ATOWICACH
+OŒO34.PRZY+ATEDRZEI:AKŒADZIE-IKROBIOLOGII7YDZIAŒU&ARMACEUTYCZNEGO
Z/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJW3OSNOWCUgL’SKIEGO5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW+ATOWICACH
Streszczenie
Zakażenia szpitalne stanowią złożony problem dla współczesnego lecznictwa i są przyczyną przedłużonego leczenia, rekonwalescencji, zwiększonych kosztów a nawet wielu zgonów wśród pacjentów hospitalizowanych.
W badaniach przedstawiono zastosowanie techniki PCR
RFLP z użyciem fragmentu genu 16S rRNA, ITS PCR
oraz MSSCP do analizy szczepów Staphylococcus spp.
izolowanych ze środowiska szpitalnego. W otrzymanych
wynikach badań analiza restrykcyjna obszaru 16S rRNA
z użyciem enzymów MspI i Hind III nie wykazała przydatności do badań pokrewieństwa wyizolowanych szczepów Staphylococcus spp. Większe zdolności różnicujące
otrzymano poprzez analizę odcinka znajdującego się między 16S rRNA i 23S rRNA, który cechował się dużym
polimorfizmem.
Analiza rejonu polimorficznego pomiędzy 16S rRNA
a 23S rRNA za pomocą techniki wielotemperaturowego
SSCP (MSSCP) wykazała bardzo duże zróżnicowanie
wyizolowanych szczepów, jednak otrzymany wzór prążkowy z uwagi na zbyt dużą liczbę prążków może utrudniać interpretację.
Abstract
Nosocomial infections pose very complicated problem for
nowadays. They are a reason for longer treatment, longer time of recovery, bigger costs of treatment and what
most important death of some hospitalized patients. In this
study following techniques: PCR RFLP using 16SrRNA
fragment, ITS PCR and MSSCP were used for analysis of
Staphylococcus spp. strains isolated form hospital milieu.
We showed that restriction analysis of the 16S rRNA digested with MspI and Hind III was not a proper techniques
for finding relationship between examine strains. Better
results we obtained after analysis much more polymorphic fragment found between 16S rRNA and 23S.
Multitemperature single strand conformation polymorphism technique (MSSCP) used to analysis selected polymorphic region showed big diversity of tested strains.
However multiply band patterns obtained in this analysis
cause problem in results interpretation.
Key words: MSSCP, PCR RFLP, Staphylococcus spp.,
16S rRNA, 16S – 23S rRNA
Słowa kluczowe: MSSCP, PCR RFLP, Staphylococcus
spp., 16S rRNA, 16S – 23S rRNA
Wstęp
Zakażenia szpitalne stanowią złożony problem dla
współczesnego lecznictwa i dotyczą wszystkich osób mających kontakt ze środowiskiem szpitalnym. Nie tylko pacjentów znajdujących się na oddziale, personelu medycznego,
ale także i osób przypadkowo znajdujących się w szpitalu
[1].
Zakażenia szpitalne są przyczyną przedłużonego leczenia i rekonwalescencji, zwiększonych kosztów ponoszonych
przez szpitale, a nawet wielu zgonów pacjentów w nich hospitalizowanych. Dane oparte na badaniach prospektywnych
wykazują od 10% do 30% śmiertelność wśród pacjentów
w wyniku zakażeń nabytych w trakcie ich pobytu w szpitalu.
W latach 90-tych trzy ziarenkowce Gram – dodatnie takie
jak: Staphylococcus aureus, koagulazoujemne gronkowce
i eneterokoki stanowiły aż 34% infekcji szpitalnych. Duży
problem stwarzają także szczepy wielolekooporne, których
leczenie jest utrudnione ze względu na ograniczone możliwości terapeutyczne [2]. Problem ten jest też widoczny
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
wśród szczepów metycylinoopornych gronkowca złocistego
(MRSA) jak u szczepów metycylinoopornych gronkowców
koagulazoujemnych (MRCNS).
Ważnym elementem ograniczającym przenoszeniu zakażeń szpitalnych jest odpowiednie monitorowanie środowiska szpitalnego wraz z odpowiednią techniką laboratoryjną.
Tradycyjna diagnostyka mikrobiologiczna oparta na analizie
cech fenotypowych, nie daje pełnych możliwości analizy
zróżnicowania szczepów izolowanych ze środowiska szpitalnego, dlatego poszukuje się coraz nowszych, dokładniejszych i o większej zdolności do różnicowania metod badawczych, opartych głównie na analizie molekularnej szczepów
poprzez analizę cech genotypowych bakterii. Do badań tych
używa się analiz wielu różnych fragmentów genów zarówno
tych konserwatywnych jak i wysoce zmiennych.
Analizę sekwencji genu 16S rybosomalnego RNA (16S
rRNA) używa się do identyfikacji gatunkowej bakterii
i wykonywania badań taksonomicznych. Bakteryjny gen
16S rRNA zwykle zawiera 9 wysokozmiennych obszarów
wykazujących znaczną różnorodność pomiędzy gatunkami
bakteryjnymi i może być on wykorzystywany do identyfikacji gatunkowej. Obszary wysokozmienne są flankowane
u wielu bakterii przez konserwatywne fragmenty, pozwalając na amplifikację techniką PCR (Polymerase Chain Reaction) sekwencji docelowych przy użyciu uniwersalnych
starterów [3].
W ostatnich latach coraz częściej w badaniach polimorfizmu znajduje technika ITS PCR (ang. Intergenic Transcribed Spacer PCR) gdzie amplifikowany jest obszar pomiędzy
genami kodującymi 16S i 23S rRNA. Ten wysokozmienny
obszar prawdopodobnie umożliwi typowanie szczepów
w obrębie gatunku [4, 5].
W badaniach pokrewieństwa szczepów coraz większe
znaczenie ma łączenie kilku technik biologii molekularnej
(PCR i RFLP, PCR i MSSCP) w celu zwiększenia czułości
i specyficzności prowadzonych badań.
Użycie techniki PCR, w połączeniu z techniką MSSCP
(Multitemperature Single Strand Conformation Polymorphism), która jest nową, szybką techniką do analizy polimorfizmów i mutacji występujących w DNA pozwoli prawdopodobnie na opracowanie szybkiej i wiarygodnej metody
diagnostycznej służącej do analiz zakażeń szpitalnych [6].
Mając na uwadze konieczność poszukiwania prostych
ale zarazem wysoce specyficznych technik analizy podobieństwa lub zróżnicowania szczepów izolowanych ze środowiska szpitalnego w naszych badaniach podjęto próbę
zastosowania techniki PCR RFLP, ITS PCR oraz MSSCP
w celu określenia ich przydatności do badania pokrewieństwa szczepów Staphylococcus spp. wyizolowanych ze środowiska szpitalnego.
Metodyka badań
Badania hodowlane
W wyniku przeprowadzonych badań czystości mikrobiologicznej środowiska szpitalnego wyizolowano 110
szczepów, które poddano analizie gatunkowej w kierunku
rodzaju Staphylococcus, zgodnie z obowiązującą metodyka
badań mikrobiologicznych. Wszystkie wyizolowane szczepy gronkowców zostały zidentyfikowane biochemicznie do
gatunku przy użyciu testów API Staph (BioMerieux France).
Do badan molekularnych wybrano 11 szczepów Staphylococcus spp. (Tab. I): 10 szczepów wyizolowanych ze
środowiska szpitalnego - 5 szczepów Staphylococcus epidermidis, 3 szczepów Staphylococcus aureus, 2 szczepów
Staphylococcua xylosus oraz szczepu wzorcowego Staphylococcus aureus ATCC 25923. Szczepy do dalszych badań
przechowywano w systemie VIABANK w temperaturze
-800C.
Izolacja DNA
Z namnożonych na agarze krwawym (24 h w 370C)
szczepów przeprowadzono izolację DNA za pomocą zestawu Genomic Mini (DNA-Gdańsk II s.c.) z dodatkiem lizostafiny (400u/ml) i lizozymu (18mg/ml). Stężenie wyizolowanego DNA określano metoda fluorymetryczna w aparacie Qubit Fluorymetr (Invitrogen). DNA do dalszych badań
przechowywano w temperaturze -200C.
Reakcja PCR
W kolejnym etapie badań przygotowano 2 pary starterów. Dla fragmentu genu 16S rRNA i dla rejonu zmiennego
pomiędzy genami 16S rRNA i 23S rRNA (Tab. II)
Tab. I. Identyfikacja gatunkowa szczepów użytych do analiz
Nr szczepu
1
2
3
4
5
6
identyfikacja
Staphylococcus xylosus
Staphylococcus aureus MSSA
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus aureus MSSA
Nr szczepu
7
8
9
10
11
identyfikacja
Staphylococcus aureus MSSA
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus xylosus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Tab. II. Sekwencje starterów użytych do reakcji PCR
starter
sekwencja
16S-f
16S-r
G1
L1
5’-TACATGCAAGTCGAGCGAAC-3’
5’-ACCTTCCGATACGGCTACCT-3’
5’-GAAGTCGTAACAAGG-3’
5’-CAAGGCATCCACCGT-3’
amplifikowany fragment
wielkość
amplimeru
16S rRNA
1482 pz
16S rRNA – 23S rRNA
zmienna
&ARM0RZEGL.AUK
Amplifikację przeprowadzono w mieszaninie reakcyjnej
HotStarTaq Plus Master Mix (QIAGEN) zawierającej: 1u
polimerazy DNA HotStarTaqPlus, 1x bufor PCR z 15mM
MgCl2, po 200 μM mieszaniny dNTP, 1x CoralLoad Concentrate, po 0,1 μM odpowiednich starterów (Tab. II) i około
200 ng wyizolowanego DNA. Reakcje PCR przeprowadzono w termocyklerze MJ Mini Personal Thermal Cycer (BioRad) wg następującego profilu temperaturowego. Wstępna
denaturacja 950C w czasie 5 minut, a następnie 30 cykli
w układzie: denaturacja 950C w czasie 1 minuty, przyłączanie starterów – dla pary 16Sf i 16Sr 650C w czasie 1 minuty
oraz dla pary G1 i L1 540C w czasie 1 minuty, wydłużanie
starterów 720C przez 1 minutę. Amplifikację zakończono wydłużaniem końcowym w temperaturze 720C przez 10 minut.
Rozdział elektroforetyczny
Otrzymane amplimery rozdzielano w 3 % żelu agarozowym dla 16S rRNA – 23 rRNA oraz w 1,5% żelu agarozowym dla 16S rRNA z dodatkiem bromku etydyny (0.5 μg/
ml). Żele analizowano następnie z wykorzystaniem programu UVI-DocMW.
Ryc. 1. Analiza restrykcyjna produktu amplifikacji fragmentu genu 16S rRNA z użyciem enzymu MspI.
PCR – RFLP
Otrzymany produkt reakcji PCR z starterami dla fragmentu genu 16S rRNA poddano analizie z użyciem enzymów restrykcyjnych HindIII oraz MspI (Fermentas).
W tym celu przygotowano mieszaninę reakcyjną zawierającą 10 μl produktu reakcji PCR, 18 μl jałowej wody dejonizowanej, 2 μl 10x buforu Hind III lub MspI oraz 1 μl
odpowiedniego enzymu. Analizę restrykcyjną prowadzono
w termobloku DR1 – Block DB30 (Techne) w następującym
układzie temperaturowym: 2 godziny w temperaturze 370C,
a następnie w celu przerwania trawienia w 800C przez 10
minut. Produkty trawienia poddano elektroforezie w 1,5%
żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (0.5 μg/ml).
Otrzymane fragmenty analizy restrykcyjnej analizowano
następnie z wykorzystaniem programu UVI-DocMW.
MSSCP
Analizę wielotemperaturowego SSCP przeprowadzono
dla produktu reakcji ITS PCR. Do analizy MSSCP pobrano
4μl produktu PCR i zmieszano z 8μl buforu denaturującego,
a następnie inkubowano przez 5 min w 95°C i schłodzono w lodzie. Fragmenty DNA z dodatkiem 3 μl buforu obciążającego były nanoszone na 8% żel poliakrylamidowy
z dodatkiem 5% glicerolu w buforze 1 x TBE. Elektroforezę
prowadzono w aparacie DNA Pointer System (Kucharczyk,
T.E.) przy stałym napięciu 1500 V w trzech wariantach temperaturowych: 350C, 150C, 50C. Otrzymane żele barwiono
metodą srebrową z użyciem zestawu Silver Stain (Kucharczyk, T.E.) zgodnie z dołączoną procedurą. Następnie żele
skanowano i poddawano analizie.
Wyniki badań
W wyniku amplifikacji DNA z parą starterów dla fragmentu genu 16S rRNA we wszystkich przypadkach uzy-
Ryc. 2. Analiza restrykcyjna produktu amplifikacji fragmentu genu 16S rRNA z użyciem enzymu HindIII.
skano jednorodne wzory amplimerów (1 prążek). Następnie przeprowadzono analizę restrykcyjną produktu amplifikacji z enzymami MspI i Hind III. Po przeprowadzeniu
analizy restrykcyjnej z użyciem enzymu MspI otrzymano
6 różnych fragmentów (ryc.1.), a zakres ich mas molekularnych po analizie w programie UVI DocMW wynosił
od 51 pz do 647 pz. Analiza restrykcyjna produktu PCR
z użyciem tego enzymu wykazała obecność takich samych profili elektroforetycznych dla wszystkich badanych szczepów.
Po trawieniu enzymem HindIII produktu amplifikacji
fragmentu 16S rRNA otrzymano 4 różne fragmenty (Ryc.2).
Zakres otrzymanych wielkości tych fragmentów wynosił od
351 pz do 1193 pz. W zależności od szczepu profil składał
się z 2 lub 3 charakterystycznych prążków. W wyniku tej
analizy podzielono wyizolowane szczepy na 3 grupy pod
względem podobieństwa ich profili elektroforetycznych.
W kolejnym etapie badań przeanalizowano otrzymane
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
nicowanie zarówno w liczbie jak i w wielkości otrzymanych
fragmentów.
W badaniach z użyciem techniki MSSCP otrzymano
wieloprążkowy wzór elektroforetyczny (Ryc.4). Otrzymane
wyniki uwidoczniły do kilkudziesięciu różnych fragmentów.
Z uwagi na tak dużą liczbę fragmentów analiza z użyciem
programu UVI DocMW stała się niemożliwa. Jednocześnie analizując otrzymany elektroforegram nie znaleziono
podobnych wzorów prążkowych w badanych szczepach co
może świadczyć o ich dużym zróżnicowaniu.
Dyskusja wyników
Ryc. 3. Elektroforeza produktów amplifikacji obszaru
zmiennego pomiędzy genami kodującymi 16S rRNA i 23S
rRNA.
Ryc. 4. Żel poliakrylamidowy analizy MSSCP fragmentu
pomiędzy genami 16S rRNA i 23S rRNA.
szczepy pod względem różnic w obszarze pomiędzy genami 16S rRNA – 23S rRNA.
Po amplifikacji regionu zmiennego ITS w wyniku elektroforezy otrzymano wieloprążkowy profil elektroforetyczny (Ryc.3). W zależności od szczepu profil składał się z 2, 3,
4 lub 5 głównych prążków. Wielkość otrzymanych fragmentów po analizie w programie UVI DocMW wynosiła od 317
pz do 701 pz. Duże podobieństwo wykazano w przypadku szczepów oznaczonych numerami 3 i 5 oraz szczepów
o numerach 8 i 10. Pozostałe szczepy wykazały duże zróż-
Wiele badań wykazało, że sekwencje obszaru zmiennego 16S rRNA mogą być przydatne do identyfikacji pojedynczych gatunków bakterii czy uwidaczniania różnic pomiędzy
ograniczoną liczbą gatunków i rodzajów. W powszechnym
użyciu są już szybkie metody, które wykrywają gatunkowo
specyficzne sekwencje w obrębie pojedynczych wysokozmiennych obszarów [2]. Otrzymane w badaniach wzory
prążkowe dla produktu amplifikacji genu 16S rRNA, nie
wykazują jednak polimorfizmu, który umożliwiłyby różnicowanie szczepów, a fragment 16S rRNA charakteryzował
się dużą konserwatywnością. W otrzymanych przez nas wynikach badań analiza restrykcyjna obszaru 16S rRNA z użyciem enzymów MspI i Hind III nie wykazała swojej mocy
różnicującej a zarazem i przydatności do badań pokrewieństwa wyizolowanych szczepów Staphylococcus spp. Słabe właściwości różnicujące tego genu przedstawiają także
w swoich badaniach Dewhirst F. i wsp., którzy próbowali
zastosować go do różnicowania szczepów z rodzaju Helicobacter [7]. W badaniach Heikens E. i wsp. stwierdzono, że
identyfikacja genotypowa oparta na fragmencie 16S rRNA
jest ograniczona przez ścisłe powiązanie gatunkowe szczepów Staphylococcus spp. [8].
Z przeprowadzonych analiz wynika, że większe zdolności różnicujące otrzymano poprzez analizę, nawet bez zastosowania enzymów restrykcyjnych, odcinka znajdującego
się pomiędzy genami kodującymi 16S rRNA i 23S rRNA,
który cechował się dużym polimorfizmem.
Otrzymane wyniki badań wykazują, że polimorfizm długości fragmentu znajdującego się pomiędzy 16S i 23S rRNA
pozwala na wstępną identyfikację i analizę filogenetyczną
szczepów bakterii z rodzaju Staphylococcus. Przydatność
techniki ITS PCR do badań wewnątrzgatunkowych potwierdzili w swoich badaniach Roth i wsp., którzy wykorzystali
tą technikę do badań wewnątrzgatunkowych i międzygatunkowych szczepów Mycobacterium spp. [9].
Po amplifikacji regionu zmiennego ITS w wyniku elektroforezy otrzymano wieloprążkowy profil elektroforetyczny
pozwalający na odróżnienie szczepów bez przeprowadzania
analizy restrykcyjnej, jednak w przypadku szczepów o numerach 8 i 10 oraz 3 i 5 zaobserwowano ich podobieństwo.
Wszystkie te szczepy należały do gatunku Staphylococcus
epidermidis. Przydatność analizy rejonu zmiennego do analizy próbek środowiskowych potwierdzają także w swoich
badaniach Sadeghifard i wsp. [10]. W badaniach Kretowa M. i Grones J., przedstawili także zdolności różnicujące
pomiędzy szczepami Acetobacter z zastosowaniem analizy
rejonu zmiennego pomiędzy 16S rRNA i 23S rRNA [11],
&ARM0RZEGL.AUK
a Traček J i Teuber M. wykazali możliwość zastosowania
tego fragmentu do analizy polimorfizmu 57 badanych szczepów bakterii kwasu octowego [12].
Analiza rejonu polimorficznego pomiędzy 16S rRNA
a 23S rRNA za pomocą techniki wielotemperaturowego
SSCP (MSSCP) wykazała całkowite zróżnicowanie wyizolowanych szczepów, jednak otrzymany wzór prążkowy
z uwagi na zbyt dużą liczbę prążków znacznie utrudnił ich
interpretację.
W przeprowadzonych badaniach wykazano potrzebę
właściwego doboru techniki w zależności od zróżnicowania
badanych szczepów i ich pochodzenia.
Przeprowadzone badania wykazują ponadto konieczność
optymalizacji wykorzystanych technik w celu uzyskiwania
powtarzalności otrzymanych wyników. Brak optymalizacji
badań genetycznych może prowadzić do błędnych ich interpretacji, a jednocześnie ograniczać ich zastosowanie do
badań środowiska szpitalnego.
Wnioski
1.
Zastosowana technika PCR RFLP z użyciem fragmentu genu 16S rRNA nie wykazała przydatności do
analizy szczepów Staphylococcus spp. wyizolowanych ze środowiska szpitalnego.
2. Technika ITS – PCR wykazała dużą przydatność do
analizy pokrewieństwa wyizolowanych szczepów
środowiskowych Staphylococcus spp.
3. Technika MSSCP jest najczulszą z badanych metod
analizy polimorfizmu szczepów, jednak z uwagi na
dużą liczbę otrzymanych prążków wymaga zastosowania do tej analizy krótszych fragmentów amplifikowanego fragmentu DNA.
Badania finansowano z tematu KNW – 1-052/08 i KNW
– 2-069/09
Piśmiennictwo
1. Fiedotow M, Denys A. Wybrana aspekty zakażeń szpitalnych. Pol Merk Lek 2006; 125: 484 – 488.
2. Krawczyk B. Diagnostyka molekularna w zakażeniach
szpitalnych. Post Microbiol 2007; 46: 367 – 378.
3. Chakravorty S, Helb D, Burday M, Connell N, Alland
DA. Detailed Analysis of 16S Ribosomal RNA Gene
Segments for the Diagnosis of Pathogenic Bacteria. J
Microbiol Methods 2007; 69: 330-339.
4. Daffonchio D, Cherif A, Brusetti L, Rizzi A, Mora D,
Boudabous A, Borin S. Nature of Polymorphisms in
16S-23S rRNA Gene Intergenic Transcribed Spacer Fingerprinting of Bacillus and Related Genera. Appl Environ Microbiol 2003; 69: 5128 – 5137.
5. Krawczyk B, Kur J. Diagnostyka molekularna w mikrobiologii. Wyd Politechniki Gdańskiej 2008, 85-91.
6. Kaczanowski R, Trzeciak L, Kucharczyk K. Multitemperature single stand conformation polymorphism. Electrophoresis 2001; 22: 3539 – 3535.
7. Dewhirst FE, Shen Z, Scimeca MS, Stokes LN, Boumenna T, Chen T, Paster BJ, Fox JG Discordant 16S
and 23S rRNA Gene Phylogenies for the Genus Helicobacter: Implications for Phylogenetic Inference and
Systematics. J Bacteriol 2005; 187: 6106-6118.
8. Heikens E, Fleer A, Paauw A, Florijn A, Fluit AC. Comparison of Genotypic and Phenotypic Methods for Species-Level Identification of Clinical Isolates of Coagulase-Negative Staphylococci. J Clin Microbiol 2005; 43:
2286-2290.
9. Roth A, Fischer M, Hamid ME, Michalke S, Ludwig W,
Mauch H. Differentiation of Phylogenetically Related
Slowly Growing Mycobacteria Based on 16S-23S rRNA
Gene Internal Transcribed Spacer Sequences. J Clin Microbiol 1998; 36: 139-147.
10. Sadeghifard N, GürtlerV, Beer M, Seviour RJ. The
Mosaic Nature of Intergenic 16S-23S rRNA Spacer Regions Suggests rRNA Operon Copy Number Variation in
Clostridium difficile Strains. Appl Environ Microbiol
2006; 72: 7311-7323.
11. Kretowa M, Grones J. Molecular Analysis of 16S – 23S
Spacer Regions of Acetobacter Species. Folia Microbiol
2005; 50: 288-292.
12. Traček J, Teuber M. Genetic and Restriction Analysis
of the 16S – 23S rDNA Internal Transcribed Spacer Regions of the Acetic Acid Bacteria. FEMS Microbiol Lett
2002; 208: 69-75.
data otrzymania pracy: 19.11.2009 r.
data akceptacji do druku: 22.02.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr n. med. Robert D. Wojtyczka
Katedra i Zakład Mikrobiologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
41-200 Sosnowiec, ul. Jagiellońska 4,
tel: 32 364 16 22,
e-mail: [email protected]