Jak przygotować wodę wolną od RNAz (H2O

Projektowanie reakcji multiplexPCR
Dzięki nowoczesnym, wydajnym zestawom do PCR, amplifikacja DNA nie
jest już takim wyzwaniem, jak w latach 80-tych i 90-tych. Wraz z poprawą
metodyki, pojawiły się ciekawe pomysły na “unowocześnienie” reakcji PCR
i zwiększenie jej wydajności i rzetelności. Przykładem modyfikacji PCR,
która wprowadza cały wachlarz nowych możliwości, jest multiplex-PCR.
Czym jest multiplex?
Przez multiplex-PCR rozumiemy każdą modyfikację PCR, która polega na
zmieszaniu co najmniej trzech primerów tak, by amplifikacji naraz ulegały dwie
różne (lub więcej) matryce. “Multipleksowanie” można przetłumaczyć na polski
jako “scalanie” kilku reakcji. Poniżej przedstawiliśmy poglądową rycinę z dwoma
podstawowymi przykładami “multipleksów”.
Zalety i ograniczenia metod typu multiplex-PCR
Wiele różnych dziedzin biologii molekularnej doceniło multiplex:
* prowadzenie równocześnie kilku reakcji skraca czas i zmniejsza koszt
wykonania oznaczeń (zamiast kilku reakcji PCR wykonujemy jedną), pozwala
też na oszczędność matrycy, co może być szczególnie ważne, gdy dysponujemy
minimalnymi ilościami unikatowego materiału (tkanka nowotworowa,
mikroślady);
*kolejną zaletą reakcji w multipleksie jest możliwość zastosowania
wewnętrznej kontroli amplifikacji w reakcjach, w których stwierdzamy
obecność lub brak produktu (dodatni/ujemny). Wówczas poza właściwą
reakcją wykonujemy jednocześnie PCR dla jakiegoś fragmentu kontrolnego
DNA, który niezależnie od obecności lub braku badanego amplikonu, zawsze
będzie dawał produkt. Taka kontrola pozwoli nam odróżnić wynik fałszywie
ujemny (nie dodana matryca, nieudana reakcja) od prawdziwie ujemnego;
*podejście multiplex-PCR jest pomocne podczas wykrywania kilku wariantów
tego samego genu jednocześnie;
*dzięki scalaniu kilku reakcji możliwe stały się rzetelne pomiary metodą RealTime PCR, w których z zastosowaniem sond molekularnych możemy
monitorować ilościowo naraz kilka transkryptów lub wariantów allelicznych.
Ograniczenia podejścia multiplex są nieliczne, należą do nich:
*trudność wstępnej optymalizacji reakcji;
*problemy w doborze odpowiednich proporcji starterów reakcji*
*w niektórych przypadkach w ogóle nie ma możliwości dobrania kilku par
starterów tak, by nie tworzyły między sobą par typu primer-dimer;
*w przypadku amplifikacji z cDNA genów o bardzo różnym poziomie ekspresji
może dojść do faworyzowania amplifikacji tylko genu o wyższym poziomie
ekspresji.
Optymalizacja reakcji w multipleksie
Są 2 podejścia do tworzenia tego typu reakcji: pierwsza polega na wstępnym
doborze warunków reakcji dla odrębnych amplikonów osobno, a następnie
interpolowaniu stężeń odczynników i protokołu amplifikacji tak, by pogodzić ze
sobą obie pary starterów. Drugie podejście polega na “pójściu na żywioł”- nie
przejmujemy się wydajnością reakcji rozumianych osobno, od razu mieszamy
startery i patrzymy, co z tego wyniknie.
Podejście pierwsze jest bardziej racjonalne, jednak więcej kosztuje i jest bardziej
czasochłonne. Nie zawsze też opracowanie dobrze działającej reakcji singleplex
(pojedynczej) ma przełożenie na kinetykę reakcji multiplex.
Drugie podejście powinno być stosowane przez osoby, które mają już
doświadczenie w optymalizacji PCR i znają doskonale chemię, na której pracują.
Takie osoby mogą sobie pozwolić na ryzykowne próbowanie “na chybił trafił”
warunków reakcji zgodnie z poprzednimi doświadczeniami własnymi.
Podstawowe zasady multipleksowania reakcji
Spróbujmy zatem wypracować jakiś schemat optymalizacji zgodnie ze strategią
pierwszą.
1. Wybór amplikonów -jeżeli mamy luksus wyboru wśród kilku par starterów,
wybierzmy dwie dla każdego amplikonu tak, by teoretycznie wyliczona
temperatura topnienia była jak najbardziej zbliżona. Idealna różnica wielkości
obu amplikonów, powinna wynosić 100-200nt, chociaż nie trzeba się trzymać
bardzo rygorystycznie tego kryterium. Taka różnica wielkości amplikonów
pozwala na łatwy rozdział na żelu, nie doprowadzając do faworyzowania
krótszego produktu reakcji i jego preferencyjnej amplifikacji
2. Po otrzymaniu starterów przeprowadzamy optymalizację osobno dla każdej
z reakcji PCR, zgodnie z naszym poradnikiem. Trudność polega na dobraniu
wspólnych lub zbliżonych warunków termicznych i poziomu magnezu dla obu
naszych reakcji. Częściowo te parametry są od siebie zależne i zwiększona
ilość magnezu pozwala na podniesienie niewielkie temperatury bez straty
wydajności (lecz nie jest to regułą.)
3. “Scalamy” obie reakcje i po rozdziale żelowym analizujemy, czy
otrzymaliśmy wyraźne i specyficzne produkty, czy ich stężenie jest zbliżone,
czy występują produkty niespecyficzne.
4. Zwykle za pierwszym razem nie udaje się dobrać idealnych warunków.
Jeżeli widzimy tylko jeden z produktów, lub jest on w dużej przewadze nad
drugim, zmniejszamy o połowę stężenie starterów dla przeważającego
produktu. Alternatywnie, zwiększamy o 50% stężenie starterów dla słabszego.
5. Jeżeli otrzymujemy oba produkty, lecz poza nimi występuje produkt
niespecyficzny, wykonujemy zwykły gradient termiczny i/lub magnezu dla
multipleksu (zgodnie z Poradnikiem)
6. Jeżeli nie otrzymujemy żadnego produktu lub bardzo słabe, pierwszym
krokiem jest obniżenie temperatury amplifikacji reakcji (gradient termiczny).
Gdy nie daje to efektu, wracamy do temperatury wyjściowej i dodajemy
magnezu (o 25-50% w pojedynczej reakcji lub stopniowo w gradiencie). Jeżeli i
ten krok nie rozwiązuje naszych problemów, dodajemy 50%-100% dNTP do
wyjściowej reakcji. Możemy także zadziałać jednocześnie zwiększając magnez
i dNTP, a nawet wydłużając etap annealingu maksymalnie do minuty.
7. Może okazać się, że nie otrzymamy w ogóle produktu. Wówczas
rezygnujemy z tej pary starterów lub próbujemy innego zestawu do reakcji
PCR (czasami to wystarczy, żeby ruszyć oporną reakcję)
Multiplex-PCR wprowadza nowe możliwości
Źródło: Wikimedia Commons, autor Zephyris, licencja CC BY SA 3.0
Jeżeli szczęśliwie udało nam się otrzymać produkty, rozważmy dopracowanie
reakcji poprzez manipulację stężeniami starterów, magnezu i stężenia matrycy.
Multiplex-PCR powinien być niezawodny i powtarzalny. Dobrze działająca reakcja
wynagrodzi nam trudy i czas spędzony podczas optymalizacji!
Jak przygotować wodę wolną od
RNAz (H2O-DEPC) — protokół
Woda wolna od RNAz to podstawa wszelkich manipulacji z RNA, podatnym
na działanie wszędobylskich i bardzo stabilnych rybonukleaz. Wodę taką,
najlepszej jakości, można zakupić u dystrybutorów większych firm
sprzedających odczynniki dla biologii molekularnej. Gotowa woda
ultraczysta jest niezbędna w sytuacji, gdy jakość każdej próbki jest
niezwykle ważna (np. w diagnostyce medycznej), jednak w placówkach
naukowych i przy zastosowaniach niekomercyjnych warto pomyśleć o
własnoręcznym przygotowaniu wody do izolacji RNA. Jest to tak zwana
„woda DEPC”, nazywana tak od odczynnika, który jest używany do
degradacji RNAz.
Dlaczego akurat DEPC?
Dietylopirowęglan to silny środek alkilujący, któremu nie straszne są żadne
białka, także bardzo stabilne i powszechne w środowisku RNAzy. Zaletą DEPC jest
za to jego termolabilność i rozpad do neutralnych związków chemicznych pod
wpływem autoklawowania. DEPC rozpada się na CO2, H2O oraz etanol, który w
niewielkim stężeniu nie zagraża RNA. W temperaturze pokojowej przy dłuższym
przechowywaniu lub przy zbyt wysokim stężeniu dietylopirowęglan ulega
przekształceniu do niższych estrów, dlatego jeżeli trąci on owocowym, estrowym
zapachem, nie nadaje się już do neutralizacji nukleaz.
Przygotowanie wody wolnej od rybonukleaz:
1. Do 1 litra wody destylowanej (najlepiej zaś poddanej odwrotnej osmozie) dodaj
1ml dietylopirowęglanu (DEPC), by otrzymać roztwór 0.1% (v/v) .
2. Dobrze wymieszaj, pozwól roztworowi odstać się w temperaturze pokojowej ok.
60-90 minut
3. Autoklawuj w standardowych warunkach (121*, 15 minut, 1 Bar)
4. Voila! Woda wolna od RNAz gotowa. Przed użyciem pozwól jej ostygnąć do
temperatury pokojowej. Dobrze jest przepipetować część świeżo przygotowanej
wody na małe alikwoty np. do zakręcanych próbówek i zamrozić.
Uwagi:
* DEPC jest silnie toksyczny i kancerogenny (odczynnik alkilujący!), należy
obchodzić się z nim ostrożnie.
* Dietylopirowęglan jest niestabilny rozcieńczony w wodzie i buforach, dlatego
roztwór do autoklawowania przygotowuje się na świeżo, a przechowuje się już po
sterylizacji jako czystą wodę DEPC.
Marzena Pieronkiewicz
Multiplex-PCR wprowadza nowe możliwości
Źródło: Wikimedia Commons, autor Zephyris, licencja CC BY SA 3.0
Labowe „know-how” — bakterie
kompetentne i transformacja
plazmidowym DNA
Czy zdarzyło Ci się niepowodzenie w tak podstawowej metodzie
laboratoryjnej, jaką jest transformacja bakterii obcym DNA? Ta względnie
mało skomplikowana metoda potrafi czasem być na tyle kapryśna, by
spędzić nam sen z powiek. Wystarczy użyć „starych” lub nie do końca
kompetentnych bakterii lub zastosować zbyt wysokie ilości DNA, aby na
drugi dzień zamiast pięknych kolonii zobaczyć czyste szalki. Zaoszczędź
sobie tej frustracji i użyj sprawdzonego przepisu, który przedstawiam
poniżej:
1. 1. Przygotowanie chemicznie kompetentnych E. coli
(przed rozpoczęciem procedury przygotuj około 25 ml sterylnego 50 mM CaCl2 i
schłódź go w lodówce)
zaszczep 1 ml pożywki (LB lub BHI) odpowiednim szczepem E.coli (np.
DH5α, TOP10)
hoduj przez noc w 37 st. z wytrząsaniem (~ 16 h)
zaszczep 40 ml pożywki 1 ml kultury nocnej i hoduj w 37 st. z
wytrząsaniem (sprawdzaj regularnie OD600)
gdy OD600 = 0,2 – 0,25 zakończ hodowlę i przetrzymaj bakterie na lodzie
przez 15 min
zwiruj hodowlę (5 000 rpm, 10 min, 4 st.)
rozpuść pelet bakteryjny w 20 ml zimnego CaCl2 (50 mM)
inkubuj 20 min na lodzie
zwiruj hodowlę (5 000 rpm, 10 min, 4 st.)
rozpuść pelet bakteryjny w 1 ml zimnego CaCl2 (50 mM)
inkubuj około 30-40 min na lodzie
po tym czasie bakterie są gotowe do użycia
Uwaga! Bakterie pozostaną kompetentne przez następne 2-3 dni jeśli
przechowasz je w lodówce (nie dłużej!) Możesz również przechować je przez
dłuższy czas (2-3 miesiące) w -80 st.
1. 2. Transformacja bakterii kompetentnych metodą „heat shock”
przygotuj porcję chemicznie kompetentnych bakterii (50-100 µl)
zmieszaj bakterie z wektorem, który chcesz wprowadzić – użyj około 10-30
ng plazmidowego DNA zawieszonego w wodzie
inkubuj 30-45 min na lodzie
przełóż próbkę na 90 sek do 42 st. („heat shock”)
przełóż bakterie z powrotem na lód (5 min)
dodaj 250 µl pożywki (LB, BHI lub SOC) – możesz ją wcześniej ogrzać do
37 st.
hoduj przez 30-40 min w 37 st. z wytrząsaniem
posiej około 100 µl zawiesiny na płytki selekcyjne
hoduj przez noc w 37 st. (lub przez weekend w temperaturze pokojowej,
jeśli doświadczenie wypadło na piątek..)
— uważaj, żeby nie doprowadzić do przerośniecia kolonii, gdyż w takim wypadku
poszczególne klony mogą zrosnąć się ze sobą!
— wyrosłe kolonie powinny posiadać obce DNA; możesz sprawdzić to
metodami Colony PCR, czy Rapid Colony Screening lub wyizolować
plazmid z pojedynczej hodowli (po jej uprzednim rozhodowaniu) i
zsekwencjonować.
Uwaga! Pamiętaj, aby posiać również kontrolę negatywną (bakterie
nietransformowane), dzięki której sprawdzisz, czy antybiotyk w podłożu nie uległ
rozkładowi.
Pamiętaj również, że podłoża stałe z antybiotykiem pomimo tego, że
przechowywane są w lodówce nie nadają się do użycia po kilku miesiącach, gdyż
antybiotyk ulega rozkładowi. Jeśli w Twoich bakteriach nie ma wprowadzonego
DNA (pomimo obecnych transformantów) może być to wina „starych” szalek.
AM
Oczyszczanie oligonukleotydów:
odsalanie, elektroforeza czy HPLC?
Gdy zamawiamy oligonukleotydy, stajemy przed wyborem metody ich
oczyszczenia. Do wyboru zwykle są opcje odsalania i HPLC, chociaż
niektóre firmy oferują także mniej wydajną od HPLC chromatografię
odwróconej fazy lub sprawdzenie wydajności syntezy poprzez elektroforezę
PAGE. Najtańsze jest odsalanie, czy jednak jest ono wystarczające? Którą
opcję wobec tego wybrać?
Oligonukleotydy są syntezowane automatycznie przez syntetyzery sterowane
komputerowo. Nić DNA jest w nich „produkowana” w kierunku 3’ ⇒ 5’, każda
zasada dołączana jest poprzez serię następujących po sobie reakcji chemicznych.
Musimy wiedzieć, że jak to w chemii bywa, żadna synteza nie jest w 100%
wydajna. Dlatego otrzymany oligonukleotyd o zadanej długości to tylko jeden z
produktów końcowych- synteza powoduje też powstanie niedokończonych,
krótszych oligo.
Zwykle na każdym etapie przyłączania nukleotydu do rosnącego łańcucha ok. 1%
reakcji przebiega nieprawidłowo. W związku z tym produkt syntezy 30-merowego
oligonukleotydu w efekcie stanowi mieszaninę poprawnie zsyntezowanych
łańcuchów (54%-74%), a resztę stanowią produkty uboczne reakcji : 29-merowe,
28-merowe itd. Im dłuższy łańcuch, tym mniejsza zawartość prawidłowego
produktu syntezy.
Produkty uboczne reakcji mogą współzawodniczyć z pełnymi oligonukleotydami o
matrycę reakcji, obniżając wydajność amplifikacji lub skutkując niespecyficzną
amplifikacją. Dlatego właśnie czasami niezbędne jest dobre oczyszczenie
oligonukleotydu, jeżeli korzystamy np. z czułych metod allelospecyficznych, albo
jeżeli potrzebne nam są sondy molekularne, lub długie oligo (>40pz).
Istnieje pięć głównych metody oczyszczania: odsalanie, chromatografia
odwróconej fazy („Cartdridge”) , wysokoprężna chromatografia cieczowa
(HPLC), oczyszczanie żelowe na akrylamidzie (PAGE), oraz filtracja żelowa
*
Podczas odsalania roztwór oligonukleotydu jest przepuszczany przez prostą
kolumnę chromatograficzną, z której odpłukiwane są sole, natomiast produkty
uboczne syntezy nie są usuwane. Odsalanie jest standardowym wyborem dla
starterów tradycyjnych PCR, oraz dla większości starterów do reakcji qPCR.
*
Metoda chromatografii odwróconej fazy w kardridżu wymywa oprócz
soli także część produktów niespecyficznych, pozwalając na otrzymanie frakcji ok.
80-90% żądanego oligonukleotydu. Ustępuje skuteczności HPLC, zapewnia też
niższy odzysk oligonukleotydu więc jest dobra tylko dla małych skal syntezy.
Metoda nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt).
*
Wspomniana już wyżej technika HPLC to najwydajniejsza metoda
oczyszczania (ale też najdroższa). Pozwala ona na oczyszczenie nawet dużych
ilości oligonukleotydów w najwyższej skali syntezy, o dużej czystości (90-97%).
Metoda tak jak poprzednia, nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt).
*
Rozdział żelowy PAGE jest jedynym skutecznym sposobem oczyszczania
długich oligonukleotydów, którym nie podoła HPLC. Pozwala otrzymać bardzo
czyste (do 99% czystości) oligonukleotydy, jednakże ma poważną wadę: niski
odzysk z żelu znacząco zmniejsza ilość końcową czystego oligo. Tak oczyszcza się
aptamery i krótkie konstrukty syntetyczne.
*
Sączenie żelowe jest metodą z wyboru dla konstruktów zawierających
fofotioniany (tzw. s-oligo) w badaniach nad antysensem. Ma także zastosowanie
dla wszelkich oligonukleotydów podawanych do hodowli komórkowych, ponieważ
zapewnia najlepsze odpłukanie śladowych zanieczyszczeń chemicznych. Filtracja
żelowa pozwala podobnie jak PAGE na oczyszczenie dużych fragmentów DNA.
Jest wykorzystywana np. podczas oczyszczania sond do techniki FISH, doskonale
wymywając niezwiązany z sondą barwnik.
Marzena Wojtaszewska
Multiplex-PCR wprowadza nowe możliwości
Źródło: Wikimedia Commons, autor Zephyris, licencja CC BY SA 3.0
Źródło:
Life Technologies
SigmaAldrich
Izolacja
RNA
metodą
kolumienkową — protokół
Istnieją dwa główne sposoby izolacji RNA. Izolacja przez ekstrakcję
odczynnikiem zawierającym fenol i izotiocyjanian guanidyny oraz izolacja
wykorzystująca powinowactwo kwasu nukleinowego do odpowiednio
modyfikowanych chemicznie złóż silikonowych. Ze względu na łatwość
zastosowania, obecnie dominuje metoda kolumienkowa. Poniżej
przedstawiamy szczegółowy protokół takiej izolacji.
Cel
Szybka, pozwalająca na automatyzację, minimalizująca ryzyko kontaminacji
metoda izolacji RNA z tkanek, kultur komórkowych, płynów ustrojowych i innych
świeżych materiałów biologicznych
Konieczne zasoby
1. Mikrowirówka na próbówki typu eppendorf 1,5 i 2ml
2. Pipety o zmiennej obiętości
3. Zestawy komercyjne do izolacji RNA dostosowane do izolowanego materiału i
warunków w naszym laboratorium
4. Odczynniki lub akcesoria niedodawane do zestawu, a często niezbędne:
*alkohol etylowy (co najmniej 96%)
*woda DEPC
*próbówki typu eppendorf do ostatecznej elucji
*rękawice lateksowe
*inne, opisane w poszczególnych zestawach (bufory, odczynniki
organiczne, plastiki)
Metodyka
Każdy zestaw posiada odrębny protokół postępowania, wymaga specyficznej ilości
wirowań, odpowiednich ich parametrów, dodatku kilku różnych buforów o
nieznanym nam składzie (tajemnica producenta) itd. Poszczególne etapy mogą
wyglądać inaczej, ale odczynniki i plastiki są zawsze podobne, bo idea jest
niezmienna od lat.
Każda izolacja kolumienkowa, czy to DNA czy RNA, opiera się na kilku stałych
etapach, przedstawionych poniżej.
1. Homogenizacja tkanki i jej upłynnienie
2. Efekt chaotropowy: zniszczenie komórek i inaktywacja enzymów
3. Związanie ze złożem kwasów nukleinowych i ich wytrącenie
4. Odpłukanie ciał komórek
5. Wypłukanie związków organicznych innych niż kwasy nukleinowe
6. Odsolenie złoża kolumny, wypłukanie resztek poprzednich buforów
7. Wysuszenie złoża z alkoholu
8. Elucja złoża, czyli rozpuszczenie RNA i odwirowanie z wodą lub buforem do
świeżej próbówki.
Szczegółowa procedura
1-2. Izolacja i liza komórek odbywa się w agresywnym buforze z
rozpuszczalnikami organicznymi i/lub enzymami. W przypadku RNA nie stosuje
się za to podwyższonej temperatury. Czasami kultury zawiesinowe, krew lub inne
tkanki płynne są od razu przepuszczane przez wstępną kolumnę szatkującą (np:
Qiagen Shredder Column w zestawach QiaQuick), w innych etap wstępny
przypomina ekstrakcję fenolową (np. mirVana z Ambionu). Jeszcze inne korzystają
z homogenizacji z kulkami szklanymi lub silikonowymi czy też z sonikacji. Opcji
jest wiele.
3. Kwasy nukleinowe nie rozpuszczają się w alkoholu, za to mają powinowactwo
do silikonowych złóż modyfikowanych polikationami (DNA jest polianionem) w
wysokiej sile jonowej buforu do izolacji.
4. Teraz wykonuje się pierwsze wirowanie. Kwasy nukleinowe zostają w złożu,
bufor i zlizowane komórki lądują w przesączu na dole i są do wyrzucenia.
5. Na złożu mamy bardzo zanieczyszczone solami i związkami organicznymi RNA.
Kolejne bufory, zawierajace spadajace stężenie soli i wysokie stężenie etanolu
(kwasy nukleinowe się w nim nie rozpuszczają i zostają na kolumnie!) są
nakładane na kolumnę i przepuszczane przez nią dzięki wirowaniu. Eluaty w
dalszym ciągu wyrzucamy.
6. Ostatnie wirowania, bez dodatku buforu osuszają złoże. Kolumnę przekłada się
następnie do próbówki typu eppendorf, chwilę przetrzymuje otwartą do
dosuszenia, po czym dodaje się buforu bez etanolu, w celu uzyskania wodnego
roztworu kwasu nukleinowego. Ten eluat jest celem naszych starań. Kolumnę
wyrzucamy a na eluacie wykonujemy dalsze zabiegi po spektrofotometrycznym
sprawdzeniu ilości i jakości RNA.
Uwagi:
Ważne podczas izolacji kolumienkowej jest przede wszystkim stosowanie się do
instrukcji producenta.
Zwróćmy uwagę na: dodatek etanolu do buforów, które tego wymagają [patrz
punkt 1], uważne nakrapianie buforów i próbek na kolumnę tak, by nie zachlapać
wewnętrznej powierzchni wieczka [patrz punkt 2], wysuszenie złoża przed
ostateczną elucją [patrz punkt 3], ogólna czystość pracy z RNA [patrz punkt 4].
[1] Bardzo często popełniany błąd, zdarzający się zarówno początkującym, jak i
weteranom. Może Was kosztować sporo cennych próbek i zmarnowany zestaw do
izolacji! Zawsze sprawdzajmy, czy na pudełku świeżo otwartego KITu nie ma
informacji o dodatku alkoholu. Gdy go dodajemy, to tylko w odpowiedniej
objętości, tylko stężonego. Zawsze odhaczamy na pudełku informację o dodanym
alkoholu, by współpracownicy wiedzieli, że bufor jest gotowy do użycia.
[2] Zachlapanie wieczka pogorszy nam czystość RNA, ponieważ sole i
zanieczyszczenia organiczne mogą pozostać pod wieczkiem podczas wirowania aż
do końcowego etapu elucji i razem z eluatem zostać wymyte. Nie jest to kwestia
życia i śmierci, ale wpływa na jakość.
[3] Resztki etanolu w izolacie zmniejszają
hybrydyzację. Najczęściej nie są to wielkie
uniemożliwiają jakąkolwiek amplifikację.
przygotowywania mikromacierzy cDNA czy
wydajność reakcji opartych o PCR i
straty, ale w skrajnych przypadkach
Szczególnie ważne jest to podczas
też w diagnostyce in vitro.
[4] Mowa głównie o rękawiczkach, używaniu wody DEPC, ogólnej higienie pracy z
łatwo degradującym materiałem.
Troubleshooting, czyli kiedy coś idzie niezgodnie z planem
1. Po wymyciu kolumienki nie otrzymuję w ogóle RNA lub jest go tyle, co nic.
— sprawdź bufory. Czy dodałeś etanol do buforów przemywających (wash)? Czy
nie pomyliłeś buforu do elucji (ang. elution buffer) z buforem do przemywania?
Spróbuj użyć zamiast buforu do elucji czystej wody.
— czy używasz zestawu odpowiedniego do twojej tkanki? Tkanki lite mogą nie
strawić się w buforach do lizy przystosowanych np. do krwi
— czy używasz odpowiedniej ilości tkanki?
— czy użyto rękawiczek podczas izolacji? Czy tkanka była świeża i odpowiednio
przechowywana?
2. Kolumna się zapycha i nie da się jej zwirować.
— czy używasz zestawu odpowiedniego do twojej tkanki? Tkanki lite mogą nie
strawić się w buforach do lizy przystosowanych np. do krwi i zatykają kolumnę
— czy bufor do lizy jest dodany w odpowiedniej objętości i inkubowany zgodnie z
zaleceniami producenta?
— czy kolumny są nowe, nieużywane?
3. Kolumny się zniekształcają/wybuchają/kruszą się podczas wirowania.
— czy parametry wirowania są odpowiednie?
— czy kolumny są nowe, nieużywane i nie są przeterminowane?
4. RNA jest paskudnej jakości. Nie nadaje się do żadnych oznaczeń.
— czy bufory były uważnie nakładane na kolumnę, czy moczyły wieczko kolumny?
— czy użyto buforów w odpowiedniej kolejności?
— czy bufor do elucji był niezanieczyszczony? Spróbuj elucji wodą DEPC.
— czy użyto odpowiedniej, nie za dużej ilości tkanki?
— czy zbiorniczek kolumny był opróżniany między wirowaniami?
— czy używano rękawiczek podczas izolacji? Czy tkanka była świeża i
odpowiednio przechowywana?
— czy używasz zestawu odpowiedniego do Twojej tkanki?
Multiplex-PCR wprowadza nowe możliwości
Źródło: Wikimedia Commons, autor Zephyris, licencja CC BY SA 3.0
Jeżeli powyższe opracowanie nie dało odpowiedzi na Wasze problemy, najlepszym
wyjściem będzie kontakt z firmą, która wyprodukowała dane kolumienki. Nikt nie
powinien lepiej orientować się niż ona we własnościach swojego towaru. Zdarzają
się także wadliwe partie, które producent powinien wymienić, jeżeli zaistnieje
taka sytuacja.
Piśmiennictwo:
Własne doświadczenie zawodowe
Spektrofotometryczna analiza
jakościowa i ilościowa DNA i RNA
za pomocą urządzenia NanoDrop
— protokół
Wiele laboratoriów ma problem z izolacją RNA. Ten wstępny etap może
zaważyć na powodzeniu lub klęsce całej serii badań, ponieważ RNA
zanieczyszczone odczynnikami używanymi podczas ekstrakcji będzie
nieefektywnie odwrotnie-transkrybowane. Dlatego niezwykle ważna jest
kontrola wyizolowanego RNA przed jakąkolwiek obróbką enzymatyczną.
Idealnym narzędziem do takiej kontroli jakości jest NanoDrop.
Cel: określenie czystości DNA lub RNA po izolacji.
Wprowadzenie: po skończonej izolacji kwasów nukleinowych musimy wiedzieć
jakie jest stężenie i czystość materiału przed wykonaniem jakichkolwiek badań.
Podczas ekstrakcji kwasów nukleinowych używa się rozpuszczalników
organicznych (fenol, chloroform, alkohole) oraz soli (np. chlorek lub izotiocyjanian
guanidyny), które mogą inhibować reakcje enzymatyczne takie jak PCR, RT-PCR,
znakowanie rybonukleotydów i inne. RNA zanieczyszczone solami także szybciej
degraduje (nawet przechowywany w -80 °C!). Dlatego tak ważna jest poprawna
analiza jakościowa i ilościowa każdej próbki. Wygodną formą takiej analizy jest
pomiar absorbancji przy długości fali 230, 260 i 280nm. Obecnie większość
laboratoriów dysponuje systemami typu NanoDrop (Thermo Scientific), które
mierzą te parametry w kropli <1,5ul i automatycznie przeliczają absorbancję na
stężenie i czystość białkową oraz organiczną. Wyznaczają także wykres
absorbancji, bardzo pomocny przy ustalaniu źródła zanieczyszczeń kwasów
nukleinowych.
Wykonanie pomiaru:
*
Próbkę DNA/ RNA przed pomiarem rozmrozić i trzymać na lodzie.
Bezpośrednio przed pomiarem zvortexować lub przepipetować góra-dół aby ją
dobrze wymieszać.
*
W menu urządzenia wybrać odpowiednia opcję (w przypadku NanoDrop’a
1000 jest to “Nucleic Acids”->ds DNA/ ssDNA/ RNA. Opcje różnią się wartością
jednostkowej absorbancji przyjmowaną w przeliczeniu na stężenie, należy o tym
pamiętać!)
*
Przygotować czystą wodę (do inicjalizacji) oraz bufor, w którym
rozpuszczany był kwas nukleinowy (próba “ślepa” używana jako kalibrator).
Inicjalizację i kalibrację wykonać nakrapiając każdorazowo 1,2-1,5µl płynu.Za
każdym razem zetrzeć szmatką okienko spektrofotometru.
*
Nałożyć 1,2-1,5µl próbki na okienko, uważając na ewentualne bąbelki
powietrza, które mogą zafałszować pomiar. Po wykonaniu pomiaru okienko
przemyć wodą i przetrzeć szmatką.
*
Jeżeli musimy zbierać próbkę z powrotem z okienka, dbajmy o jakość wody i
dokładnie przemywajmy okienko pomiędzy pomiarami kolejnych próbek!
Ryc. 1: Czyste RNA w zakresie stężeń od 1000 ng/µl (granatowa krzywa) do 3800
ng/µl (ceglasta). Widzimy, że stężenia powyżej 3000 ng/µl (żółta i ceglasta krzywa)
są zbyt wysokie, by można było poprawnie oszacować A260. Charakterystyczne
jest to, że w przypadku każdej z krzywych absorbancja A230 jest około 2x
mniejsza niż A260 jest to wyznacznik dobrej jakości RNA
Analiza i interpretacja wyniku:
*
Analiza ilościowa: Ilość kwasu nukleinowego jest określana jako stężenie w
1 µl. Zakres stężeń, w którym oznaczenie jest wiarygodne to ok. 10-3000 ng/µl .
Powyżej tej wartości DNA lub RNA jest zbyt stężone, by prawidłowo określić jego
ilość i wyznaczyć krzywą absorbancji (ryc. 1). Poniżej wartości 10ul znacząca
absorbancja tła powoduje przeszacowanie wyniku. Próbkę o zbyt wysokiej
wartości absorbancji rozcieńczamy tym samym buforem, którego używaliśmy
podczas izolacji i którym kalibrowaliśmy urządzenie. Przy zbyt niskiej ilości kwasu
nukleinowego próbkę zagęszczamy lub przyjmujemy że ma ona stężenie niższe niż
wyliczone przez urządzenie.
*
Analiza jakościowa: maksimum absorbancji białek, częstego
zanieczyszczenia DNA przy izolacji manualnej, wynosi 280 nm, zaś
zanieczyszczenia organiczne posiadają najwyższą absorbancję poniżej 240 nm.
Przyjęto więc arbitralnie 230nm jako długość fali dobrze określającą stopień
zanieczyszczeń rozpuszczalnikami.organicznymi.
*
Miarą stopnia czystości kwasów nukleinowych jest stosunek A260/230
oraz A260/280. Przyjmuje się, że czyste DNA lub RNA ma A260/280>1,8 i
A260/230>1,8. Idealnie czyste RNA rozpuszczone w wodzie DEPC może mieć
A260/230 nawet ok. 2,20.Na dokładną wartość tego parametru nieznacznie
wpływa użyty bufor, ale generalnie parametry dobrze wyizolowanego DNA lub
RNA oscylują wokół 1,8 – 2,05.Najprościej rzecz ujmując oznacza to, że
absorbancja przy maksimum dla kwasów nukleinowych (A260) jest 2x większa niż
absorbancja tła i zanieczyszczeń.
*
Krytyczne dla reakcji enzymatycznych są wartości A260/280 i
A260/230<1,4. Niższe wartości mogą spowodować bardzo kiepskie wyniki
amplifikacji np. metodą Real-Time PCR czy też słabe znakowanie sond do
mikromacierzy. Przy A260/230<1 nawet zwykły RT-PCR może okazać się
problemem. Dlatego w przypadku kiepskiej czystości należy powtórzyć ekstrakcję
alkoholem.
Rodzaje zanieczyszczeń
*
Zanieczyszczenie fenolem powodują wzrost absorbancji w zakresie
200-230 nm i rozszerzenie krzywej w zakresie 250-280 nm. Obraz (w przypadku
ryciny 3 dotyczy próbek znaczonych strzałką, oprócz jasnoniebieskiej) jest
podobny jak w przypadku zanieczyszczenia solami chaotropowymi. Takie
DNA/RNA nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych. A260/230 i A260/280
mogą przyjmować zaskakujące wartości (>2. lub <1,4 w zależności od stężenia
fenolu i towarzyszących zanieczyszczeń, np. chloroformu i alkoholu
izoamylowego)
Ryc. 2: Zanieczyszczenie fenolem (czerwona strzałka) oraz niepoprawna aplikacja
próbki na okienko (oznaczone czarnymi strzałkami)
*
Zanieczyszczenie izotiocyjanianem lub chlorkiem guanidyny –
widoczne na ryc. 2 (krzywa czarna i jasnozielona). Wydatny pik przy długości fali
230nm i towarzyszące mu przesunięcie absorbancji DNA/RNA w prawo w
kierunku 270nm to cechy charakterystyczne tej kontaminacji. Taka próbka w
żadnym wypadku nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych, sole
izotiocyjanianu są silnymi zwiazkami chaotropowymi i unieczynniają eznymy!
Najczęściej oba parametry A260/A280 i A260/A230 <1,4.
Ryc. 3: Zanieczyszczenie solami chaotropowymi. Charakterystyczna „skocznia
mamucia” na wykresie absorbancji.
*
Zanieczyszczenie białkami – powodują wzrost absorbancji w zakresie
200-230 nm i rozszerzenie krzywej w zakresie 250-280 nm. Przy niewielkim
zanieczyszczeniu (<0,1% ) możemy nie obserwować „górki” z prawej strony
wykresu, a jedynie niewielki spadek A260/280.
Ryc 4. Wysokie zanieczyszczenie białkowe DNA we wszystkich próbkach.
*
Zanieczyszczenie etanolem i/lub izopropanolem – nie obserwuje się
znaczącej zmiany absorbancji, szczególnie w roztworach zbuforowanych. W
wodzie parametr A260/230 może być nieznacznie obniżony. Przy niewielkiej
domieszce etanolu reakcje enzymatyczne nie są mocno zakłocóne, warto jednak
przywiązywać wagę do dokłądnego wysuszenia pelletu przd rozpuszczeniem,
ponieważ zanieczyszczenia etanolem i izopropanolem są niewykrywalne
spektrofotometrycznie!
*
Zanieczyszczenie DNA przez RNA (i vice versa)– oba kwasy
nukleinowe są koekstragowane i zazwyczaj występują razem po izolacji. Mają
także bardzo zbliżoną pochłanialność i emisję światła, więc są nirozróżnialne
spektrofotometrycznie. W przypadku konieczności pozbycia się DNA z RNA
musimy wykonać trawienie próbek DNAzą.
Troubleshooting
*
A260/230 jest >2,3
Powodem może być kalibracja urządzenia innym buform niż użyty do
rozpuszczenia próbek (np.woda vs TRIS-HCl). Inna możliwość to nieprawidłowe
nakropienie próbki na okienko i pomiar powietrza zamiast kropli przez
spektrofotometr. Objawia się to poszarpaną krzywą (ryc. 2)
*
Absorbancja A260 jest ujemna.
Powodem może być kalibracja urządzenia innym buform niż użyty do
rozpuszczenia próbek (np.woda vs TRIS-HCl). Inna możliwość to nieprawidłowe
nakropienie próbki na okienko i pomiar powietrza zamiast kropli przez
spektrofotometr. (ryc. 2)
*
Urządzenie nie potrafi wyznaczyć absorbancji
Próbka zawieszona jest w pieniącym się bądź lepkim buforze, nakropiono zbyt
mało próbki bądź poza strefą pomiaru (okienko jest puste).
Przygotowanie
liniowych
standardów do reakcji Real-Time
PCR (protokół)
Niejednokrotnie zdarza się, że projektujemy własną metodykę opartą o
technikę Real-Time PCR. Największym problemem przy optymalizacji
gotowej metody, zarówno na etapie badań naukowych, jak i standaryzacji
oraz komercjalizacji, jest przygotowanie odpowiednich standardów.
Jak zrobić to najprościej?
Krzywe standardowe przygotowuje się zwykle na bazie plazmidów- kolistych lub
linearyzowanych (poprzez cięcie restrykcyjne). Pokutuje teoria, że takie
cząsteczki zachowują się podczas Real-Time PCRu tak samo jak mieszanina
różnych cząsteczek we właściwej reakcji z cDNA, podczas gdy reamplifikacja
produktu PCR ma inną kinetykę niż właściwego cDNA, przez co ilościowanie jest
zafałszowane.
Niewielu zdaje sobie sprawę, że jest to mit. Zamiast linearyzowanych cząsteczek
plazmidu wystarczy użyć produktu PCR namnożonego na „szerszych” starterach,
niż startery używane podczas właściwej reakcji ilościowej.
Oto prosty przepis na standardy:
*
Zaprojektuj specyficzny, dobrze działający PCR na starterach zewnętrznych
względem starterów użytych do Real-Time’u o ok. 100-200nt z każdej strony
(patrz rycina)
* Zamplifikuj dużą ilość matrycy na zewnętrznych starterach. Oczyść produkt na
kolumienkach, pozbywając się zanieczyszczeń i buforu reakcyjnego. (KITy do
oczyszczania produktu PCR oferowane są na polskim rynku przez wiele firm)
*
Zmierz przy pomocy Nanodropa lub innego spektrofotometru stężenie matrycy
wobec buforu użytego do elucji produktu PCR.
* Przelicz stężenie według poniższego wzoru:
Liczba kopii w 1ul Lk =(x * 6.022×1023)/(długość matrycy w pz*1×109 *
650), gdzie x to wartość stężenia wyrażona w ng/ul. Żeby zrobić to szybko i bez
pomyłek, użyj gotowego kalkulatora
* Rozcieńcz standard w dowolny sposób. Pierwszego stężenia przygotuj tyle,
żeby starczyło go na wszystkie eksperymenty, jeżeli zabraknie go, należy kolejny
batch pierwszego standardu wywzorcować w Real-Time PCR z uwzglęnieniem
standardu używanego wcześniej!
Przykład:
* Produkt Real-Time PCRu ma 223 pz. Zewnętrzne względem nich startery mają
580pz.
* Po amplifikacji i sprawdzeniu na żelu agarozowym jakości i wysokości prążka
(silny, wąski prążek produktu o wielkości ~580pz) oczyszczamy próbkę na żelu.
*
Zmierzone stężenie wynosi 26ng/ul.
* Wstawiamy wartości 26 i 580 w odpowiednie miejsca kalkulatora (lub liczymy
ręcznie).
Wyliczona wartość to 4,15×10^10
* Żeby przygotować kolejne rozcieńczenia pipetujemy np. po 90ul H2O (lub
buforu do elucji, zależy czym eluowaliśmy) do kolejnych próbówek, po czym do
pierwszego rozcieńczenia dodajemy 10ul. Przygotowanego standardu,
vortexujemy, następnie do 2-go standardu 10ul pierwszego itd. Podczas RealTime’u definiujemy kolejne stężenia jako 4,15×10^10, 4,15×10^9, 4,15×10^8
itd.
Uwagi dotyczące metody:
Metoda obliczenia opiera się na założeniu, że średnio mol 1 pary zasad waży 650g
(czyli 1 para zasad 650 Daltonów). Oczywiście można obliczyć dokładną wagę
naszej matrycy, używając skryptu zliczającego ilość par GC i AT, mnożąc to
następnie przez ich wagę, ale doświadczenie podpowiada, że jest to niepotrzebne.
Stężenie oczyszczonego produktu PCR mierzone spektrofotometrycznie także nie
jest bardzo dokładne, ale jeżeli amplifikacja poszła dobrze, taka dokładność
wystarcza. Jeżeli zmierzone stężenie produktu jest mniejsze niż 10ng/ul (czyli
mocno zawyżone z powodu bliskiego poziomu tła), polecam powtórzyć
amplifikację, to na pewno lepsze niż powtarzanie całej procedury przygotowania
standardów, jeżeli okazałoby się że ilościowy PCR nie chodzi przy 10 czy też 100
kopiach na reakcję.
Multiplex-PCR wprowadza nowe możliwości
Źródło: Wikimedia Commons, autor Zephyris, licencja CC BY SA 3.0
Western
poradnik.
Blot.
Praktyczny
Western Blot jest techniką powszechnie stosowaną w biologii
molekularnej w różnych laboratoriach na całym świecie. W
przeciwieństwie do hybrydyzacji Southern i Northern, które służą
identyfikacji odpowiednio DNA i RNA, Western Blot pozwala na jakościowe
wykrycie konkretnego białka z bardzo kompleksowej mieszaniny białek
izolowanych z ekstraktu komórkowego.
Jak przebiega WB?
Hybrydyzacja Western Blot, określana także jako immunoblotting, obejmuje trzy
etapy. W pierwszej kolejności zdenaturowane białka rozdziela się na podstawie
ich mas przy wykorzystaniu elektroforezy na żelu poliakrylamidowym. Następnie,
białka są przenoszone na membranę (nitrocelulozową lub PVDF) na drodze
elektrotransferu, aż w końcu następuje identyfikacja konkretnego białka poprzez
inkubację membrany przeciwciałami pierwszo- i drugorzędowymi
(immunodetekcja).
Elektroforeza
Rozdział białek podczas elektroforezy następuje na żelu składającym się z dwóch
części: żelu zagęszczającego (górna warstwa) i żelu rozdzielającego (dolna
warstwa). Próbki białka, uprzednio przygotowane w buforze o niskim
przewodnictwie (ang. loading buffer), są aplikowane do studzienek żelu
zagęszczającego. Zagęszczanie białek odbywa się w wyniku obustronnego
kontaktu z buforami o wysokim przewodnictwie i następuje ono na granicy z
żelem rozdzielającym [1].
Żele poliakrylamidowe używane w elektroforezie są polimerami akrylamidu i
bisakrylamidu. Od proporcji i od ilości tego ostatniego składnika zależy
usieciowanie żelu. Polimeryzacja katalizowana jest przez wolne rodniki, których
źródłem jest nadsiarczan amonu (ang. ammonium persulfate, APS), a ich
uwalnianie przyspiesza dodanie N,N,N’-Tetramethylethylenediaminy (TEMED).
Stężenie żelu poliakrylamidowego decyduje o rozdziale białek i jest ono odwrotnie
proporcjonalnie do wielkości białka: im większe białko chcemy oznaczyć, tym
mniejsze stężenie żelu powinno być wykonane.
Elektrotransfer
Elektrotransfer to przeniesienie rozdzielonych białek na membranę. Bardzo ważne
jest ułożenie w odpowiedniej kolejności elementów tzw. „kanapki”, aby zapewnić
prawidłowy transfer. Ujemnie naładowane białka migrują w kierunku dodatniej
elektrody i zostają zatrzymane na membranie umieszczonej między żelem a
anodą. W ten sposób białka w formie prążków znajdujących się na różnych
poziomach są przeniesione na membranę i dają lustrzany obraz rozdzielonych w
żelu polipeptydów [1].
Tutaj warto podać kilka informacji na temat membran. Istnieją dwa typy membran
powszechnie stosowanych w Western Blot: nitrocelulozowa i poliwinylidenowa
(ang. polyvinylidene fluoride, PVDF). Różnią się one zasadniczo. Membrana
nitrocelulozowa cechuje się wysokim powinowactwem do białek. Jest ona
jednak bardzo krucha w strukturze, a hybrydyzację na niej można wykonać tylko
jeden raz. Z kolei membrana PVDF odznacza się bardzo dobrymi właściwościami
mechanicznymi, jest bardziej wytrzymała, a hybrydyzację na niej można wykonać
wielokrotnie. W przypadku membran PVDF bardzo istotne jest płukanie
membrany przy technice Western Blot, aby ograniczyć sygnał tła [2].
Immunodetekcja
Jednym z jej typów immunodetekcji jest inkubacja dwoma rodzajami przeciwciał:
pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Pomiędzy tymi inkubacjami przeprowadza
się etapy płukania membrany w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.
Przeciwciała pierwszorzędowe bezpośrednio reagują z antygenem (czyli białkiem,
które chcemy wykryć). Z kolei przeciwciała drugorzędowe zazwyczaj są
znakowane, radioaktywnie albo przyłączonym enzymem np. peroksydazy
chrzanowej (ang. horseradish peroxidase, HRP). Membranę pokrywa się
substratem dla HRP, np. luminolem. Na rynku dostępnych jest kilka komercyjnych
zestawów z przygotowanym roztworami substratów. HRP katalizuje utlenienie
luminolu w obecności nadtlenku wodoru. Luminol, który przeszedł w stan
wzbudzenia, emituje promieniowanie świetlne. Obraz doświadczenia uzyskuje się
poprzez ekspozycję membrany na kliszę, następnie ją wywołując [3].
Przejdźmy teraz do praktycznego i technicznego spojrzenia na procedurę
Western Blot.
SDS PAGE przygotowanie i elektroforeza
1. Przygotowanie aparatury i żeli
Do przeprowadzenia elektroforezy SDS PAGE niezbędnym elementem są żele
poliakrylamidowe. Jeżeli nie możemy sobie pozwolić na zakup gotowych żeli,
musimy je własnoręcznie przygotować. Przy dobrej organizacji nie jest to jednak
żmudna i czasochłonna praca. Poniżej przedstawiona jest lista wszystkich
odczynników i buforów potrzebnych do elektroforezy SDS PAGE i
elektrotransferu:
3x Gel Buffer (bufor do przygotowania żeli poliakrylamidowych,
przechowywać w temperaturze 4 st.C):
3M Tris-HCl
0.3% SDS
pH 8,45
Bufory do elektroforezy:
a) Bufor anodowy:
0,2 M Tris
pH 8,9
b) Bufor katodowy:
0,1 M Tris
0,1 M Tricine
0,1 % SDS
pH 8,25
Bufor do elektrotransferu:
192 mM roztwór glicyny
25 mM Tris
20% metanol
2x bufor do przygotowania próbek białka:
100 mM Tris HCl pH 6,8
20% glicerol
5% SDS
0,02% błękit bromofenolowy
(opcjonalnie 10% 2-merkaptoetanol)
TBS-T (2 L)
40 mL 1M Tris pH 8
100 mL 3 M NaCl
2 mL TWEEN 20 (0.1%)
Zanim zaczniemy przygotowywać mieszaniny żeli, pierwszym krokiem jest
przygotowanie całej aparatury zgodnie z wytycznymi producenta. Składamy
kasetę żelową, umieszczamy w niej grzebień i zaznaczamy markerem miejsce ok.
1-1.5 cm poniżej końca ząbków grzebienia – jest to górna granica żelu
rozdzielającego. Przykładowa kaseta żelowa przedstawiona jest na Ryc. 1.
Ryc. 1. Przykładowa kaseta żelowa. Źródło: Wikimedia Commons, autor: Lilly_M,
licencja: CC BY-SA 2.5
Aby przygotować wystarczającą ilość żelu, obliczamy objętość kasety żelowej
(Objętość = szerokość x wysokość x głębokość). Przykładowo, objętość kasety
wynosi 8.2 cm3 (V = 6.8 cm x 8 cm x 0.15 cm) i z praktycznego punktu widzenia
potrzeba w tym przypadku 6-7 ml żelu rozdzielającego, jednak lepiej przygotować
mały zapas np. 10 ml dla jednego żelu.
Stężenia akrylamidu w żelach różnią się w zależności od wykonywanego rozdziału.
Stężenie akrylamidu w żelu zagęszczającym (ang. stacking gel) waha się
zazwyczaj pomiędzy 4-5%, podczas gdy w żelu rozdzielającym (ang. separating
gel) jego stężenie różni się w zależności od masy cząsteczkowej danego białka.
Odpowiednie stężenia dla obydwóch żeli dla białka o znanej masie cząsteczkowej,
które poddajemy elektroforezie, można znaleźć na stronach różnych producentów.
Poniżej przedstawiony skład można użyć do przygotowania kilku żeli (około 3) do
rozdziału białek, o masie cząsteczkowej w przedziale 20-300 kDa.
Tabela 1. Skład żelu zagęszczającego i rozdzielającego dla elektroforezy białek o
masie cząsteczkowej 20-300 kDa. Źródło: własne
Żele przygotowujemy pod wyciągiem, ponieważ niespolimeryzowany
akrylamid jest neurotoksyczny. Odpowiednio wcześnie organizujemy wszystkie
potrzebne narzędzia i odczynniki. W 50 ml probówkach typu Falcon mieszamy
wszystkie składniki żelu rozdzielającego, pamiętając o tym, że TEMED dodajemy
na sam koniec, gdyż inicjuje on polimeryzację żelu. Tak przygotowany roztwór
przenosimy pipetą do kasety żelowej do wcześniej zaznaczonej linii 1-1.5 cm
(wcześniej wyjmujemy grzebyk). Nałożony żel rozdzielający pokrywamy cienką
warstwą n-butanolu (około 500 µL) i upewniamy się, że jest on równomiernie
rozmieszczony na górnej linii żelu. Pozostawiamy tak przygotowany żel na 30-40
minut, aby spolimeryzował. Proces ten możemy także obserwować na
pozostałościach roztworu w 50 ml tubce Falcon. Poliakrylamid (który uległ
polimeryzacji) nie jest już silnie neurotoksyczny.
Gdy żel rozdzielający ulegnie polimeryzacji, usuwamy n-butanol z powierzchni
żelu, a jego nadmiar osuszamy delikatnie bibułą. Następnie przygotowujemy żel
zagęszczający poprzez zmieszanie komponentów z APS, dodając na koniec
TEMED. Nakładamy pipetą mieszaninę, szybko umieszczając grzebień pomiędzy
krawędzie płytek szklanych w ten sposób, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.
Pozostawiamy żel do polimeryzacji.
Warto pamiętać, że jeżeli planujemy przeprowadzenie dużej ilości elektroforez w
krótkim czasie, można za jednym razem przygotować więcej żeli i przechować je
kasetach żelowych z umieszczonym grzebykiem, owinięte w nasączony w buforze
katodowym kawałek ręcznika papierowego w temperaturze 4 stC.
2. Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym
W przypadku, gdy elektroforezę przeprowadzamy tego samego dnia, ostrożnie
wyjmujemy grzebień z żelu i przemywamy studzienki wodą destylowaną.
Przygotowaną kasetę z żelem umieszczamy w module i mocujemy za pomocą
uszczelek do ramki mocującej. Następnie cały moduł umieszczamy wewnątrz
zbiornika elektroforezy. Górną komorę wypełniamy buforem katodowym do
krawędzi górnej, upewniając się, że cały żel jest zanurzony w buforze. Dolną
komorę wypełniamy buforem anodowym. Przykładowy dobrze zmontowany moduł
do elektroforezy jest przedstawiony na Ryc. 2.
Ryc. 2. Zmontowany moduł do elektroforezy. Źródło: Wikimedia Commons, autor:
Jean-Eitenne Poirrier , licencja: CC BY-SA 2.0
Następnie zamykamy pokrywą zbiornik i podłączamy do zasilacza. Przy żelach
własnoręcznie wylewanych ważne jest przeprowadzenie tzw. pre-run w celu
usunięcia zanieczyszczeń z żelu. Proces Pre-run przeprowadzamy przez 20 minut
przy napięciu 100-120 V podczas przygotowywania próbek na rozdział. Oznaką
dobrze zmontowanej aparatury do elektroforezy i poprawnie działającego systemu
jest pojawienie się piany przy górnej krawędzi żelu. Ryc. 3 poniżej przedstawia
przykładowy zestaw do elektroforezy na żelu poliakrylamidowym.
Ryc. 3. SDS PAGE. Źródło: FLICKR, autor: Jean-Eitenne Poirrier , licencja: CC BYSA 2.0
Równocześnie z pre-run przygotowujemy próbki białka, których stężenie
oznaczyliśmy wcześniej np. metodą Bradforda. Odpowiednią obliczoną ilość
próbki mieszamy z 2x buforem do próbek (ang. loading buffer) i inkubujemy przez
5 minut w temperaturze 95 stC w celu denaturacji białka. Następnie odpowiednią
ilość próbki nanosimy do poszczególnych studzienek. Pamiętamy także o
zaaplikowaniu 5 µL markera.
Elektroforezę przeprowadzamy w następujących warunkach. Przy napięciu 80 V
załadowane próbki zagęszczają się, następnie przy wyższym napięciu 100-110 V
następuje ich rozdział. Elektroforezę prowadzimy do momentu, gdy linia
wędrujących w żelu prążków znajdzie się przy dolnej krawędzi żelu. Po
zakończeniu elektroforezy bufor katodowy zlewamy, natomiast bufor anodowy
możemy użyć do następnej elektroforezy. Kasetę żelową wyjmujemy ostrożnie z
modułu, następnie rozdzielamy za pomocą szpatułki płytki, pomiędzy którymi
znajduje się żel. Skalpelem lub żyletką odcinamy żel zagęszczający i tak
przygotowany żel umieszczamy w buforze do elektrotransferu.
Transfer półsuchy
W trakcie prowadzenia elektroforezy przygotowujemy wszystkie potrzebne
czynniki do transferu rozdzielonych białek na membranę.
Wycinamy membranę PVDF w rozmiarze odpowiadającym żelowi rozdzielającemu
i aktywujemy ją (zmniejszamy jej hydrofobowość) w 100% metanolu przez 10
sekund, następnie obmywając membranę 5 minut w wodzie MQ i przenosząc do
buforu do elektrotransferu (ang. Western buffer). W ten sam sposób traktujemy
złożone po 3 bibuły Whatmann.
Składamy „kanapkę” w kasecie do elektrotransferu w następującej kolejności:
– 3 x nasączone bibuły Whatmann
– aktywowana membrana PVDF
– żel nasączony także buforem do elektrotransferu
– 3 x nasączone bibuły Whatmann.
Przedstawiona poniżej Ryc. 4 przedstawia schemat układania “kanapki” do
Western Blot.
Ryc. 4. Elektrotransfer. Źródło: Wikimedia Commons, autor: Bensaccount ,
licencja: CC-BY-SA 3.0
Praktyczna rada: Dla ułatwienia orientacji membrany i żelu odcinamy żyletką
mały górny lewy róg na membranie i żelu. Upewniamy się także, czy żadne
pęcherzyki powietrza nie dostały się pomiędzy warstwy. Poprzez delikatne
rolowanie na powierzchni „kanapki” probówką typu Falcon możemy zapewnić
dokładne przyleganie poszczególnych warstw.
Następnie, nakładamy górną pokrywę kasety Western Blot i przeprowadzamy
elektrotransfer przez 1 h i 10 minut. Natężenie potrzebnego prądu obliczamy z
następującego wzoru:
I = S x 1,1 x N [mA]
N – ilość membran jaką poddajemy Western Blot
S – powierzchnia membrany.
Napięcie ustawiamy w granicach 25-30 V. O sukcesie przeprowadzonego
elektrotransferu upewniamy się, jeżeli zaobserwujemy przeniesiony marker na
membranę.
Przykładowa kaseta do Western Blot przedstawiona jest na Ryc. 5.
Ryc. 5. Kaseta do elektrotransferu. Źródło: Wikimedia Commons, autor: Lilly_M ,
licencja: CC BY-SA 3.0
W trakcie trwania elektrotransferu przygotowujemy roztwór blokujący: 4% mleka
odtłuszczonego w proszku, 1% BSA w 100 ml roztworu TBS-T.
Po wykonanym elektrotransferze membranę zanurzamy w przygotowanym
roztworze blokującym i pozostawiamy w temperaturze 4 stC przez noc na wolnym
kołysaniu. Roztwór ten ma na celu zablokować niespecyficzne wiązania.
Immunodetekcja
Inkubacja membrany przeciwciałami pierwszorzędowymi
Wykonujemy odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych w TBS-T,
zgodnie z zaleceniami producenta. Rozcieńczenia zazwyczaj wahają się w
granicach 1:500 – 1:5000. Dla przykładu przeciwciała anty-CD4 zgodnie ze
wskazówkami powinny być rozcieńczone 1:500. W związku z tym, 8 µL z próbki
przeciwciał rozcieńczamy w 4 ml TBS-T. Jest to wystarczająca objętość na
inkubację przeciwciałami pierwszorzędowymi. Praktycznym sposobem na
inkubację jest umieszczenie membrany w 50 ml probówce typu Falcon (do
wewnątrz stroną, na której znajdują się białka) tak, aby strony membrany na
siebie się nie nakładały. Następnie układamy 50 ml probówkę poziomo na
urządzeniu rotującym, tak aby zapewnić równomiernie rozłożenie roztworu z
przeciwciałami na całą membranę. Inkubację prowadzimy przez 1 godzinę w
temperaturze pokojowej.
Płukanie membrany.
Membranę płuczemy w TBS-T w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Proces
ten prowadzimy 5 razy przez 5 minut upewniając się, aby za każdym razem cała
membrana była zanurzona w roztworze.
Inkubacja przeciwciałami drugorzędowymi
Prowadzimy ją w ten sam sposób jak w przypadku inkubacji przeciwciałami
pierwszorzędowymi. Rozcieńczenie przeciwciał w tym wypadku jest zazwyczaj
wyższe, np. 1:10 000 (rozcieńczenie wykonujemy zgodnie ze wskazówkami
producenta.)
Płukanie membrany
Pięciokrotnie płuczemy membranę w roztworze TBS-T. Ostatnie płukanie
wykonujemy w roztworze TBS bez Tween, aby wypłukać i usunąć detergent.
Nałożenie czynnika detekcji
Po drugim płukaniu membranę lekko osuszamy z nadmiaru TBS poprzez
dotknięcie jednego jej końca o papierowy ręcznik, który wsiąknie nadmiar buforu.
Następnie pokrywamy membranę czynnikiem detekcji, który wiąże się z
drugorzędowymi przeciwciałami. Nakładamy reagent równomiernie pipetą na
powierzchnię membrany i inkubujemy przez 1 minutę. Usuwamy nadmiar
substratu i umieszczamy membranę w kasecie X ray. Membrana jest dodatkowo
zabezpieczona, tj. włożona w zwykłą folię biurową. Białka do detekcji znajdują się
po wierzchniej stronie. Przed wystawieniem membrany na ekspozycję, upewniamy
się, że w pomieszczeniu, gdzie będziemy wywoływać film jest ciemno, a jedynym
dozwolonym światłem jest światło czerwone. Następnie umieszczamy jeden film
na powierzchni folii, zamykamy X ray kasetę i poddajemy ekspozycji w różnym
czasie. Ekspozycja może trwać, np. 10 sec, 1 min 10 minut, ale czasem potrzeba i
paru godzin [4].
Interpretacja wyniku.
Przykładowy wynik Western Blot przedstawiony jest na Ryc. 6.
Ryc. 6. Przykładowy wynik Western Blot. Pierwszy rząd z lewej strony
reprezentuje marker ze zdefiniowanymi rozmiarami białka, które miało być
zidentyfikowane. Na górnej rycinie obserwujemy wyraźnie zarysowane prążki
pochodzące od białka beta-ACTIN o masie cząsteczkowej 42 kDa. Na dolnej
rycinie zostało zidentyfikowane białko PCP4 o masie cząsteczkowej 7.6 kDa.
Źródło: Wikimedia Commons, autor: Herizora , licencja: CC BY-SA 3.0
Multiplex-PCR wprowadza nowe możliwości
Źródło: Wikimedia Commons, autor Zephyris, licencja CC BY SA 3.0
Western Blot jest techniką popularną w biologii molekularnej. Ze względu na
swoją czułość i jednoznaczność wyniku jest jedną z najczęściej wybieranych przez
naukowców metod. Pomimo faktu, iż trwa ona aż dwa dni, to przy optymalizacji
testu oraz doborze odpowiednich przeciwciał mamy pewność, że otrzymamy
wyniki wysokiej jakości.
Piśmiennictwo:
1. Opiela J. Analiza ekspresji genów na poziomie białek przy użyciu techniki
western-blot. Wiadomości Zootechniczne, 2006; R. XLIV; 1: 11-13.
2. Mahmood T., Yang P-C. Western Blot: Technique, Theory, and Trouble
Shooting. N Am J Med Sci, 2012; 4(9): 429–434.
3. Kurien B., Scofield R. Western blotting. Methods; 2006; 38: 283-293
4. Doświadczenia własne.
Zapisywanie
mutacji
polimorfizmów (II) – DNA
i
Jak zapisać koordynaty sekwencji nukleotydowej? Jak zawrzeć informację
o długości i charakterze delecji lub insercji tak, by inni badacze poprawnie
ją zinterpretowali? Przedstawiamy drugi z serii artykułów o poprawnej
nomenklaturze mutacji i polimorfizmów. Dziś zajmiemy się sekwencją
DNA.
Zapisywanie zmian na poziomie DNA
* substytucje oznaczamy zawsze nawiasem trójkątnym, skierowanym w
prawo, t.j. „>” Kierunek zapisu biegnie od nukleotydu pierwotnie
znajdującego się w sekwencji referencyjnej, do nukleotydu zmienionego.
– np. 76A>C oznacza zmianę w pozycji 76 nukleotydu z adeniny na
cytozynę.
– 88+1G>T (lub w innym zapisie IVS2+1G>T) opisuje substytucję G na T
w pierwszym nukleotydzie drugiego intronu, intron znajduje się w naszym
przykładzie pomiędzy nukleotydami 88 i 89 względem sekwencji cDNA. W
przypadku, gdy dochodzi do alternatywnego splicingu zawsze
zaznaczajmy, którego wariantu transkryptu dotyczy zapis.
– 89-2A>C (lub IVS2-2A>C) analogicznie jak w poprzednim przykładzie
symbolizuje substytucje A>C w drugim od końca kodonie intronu
drugiego, znajdującego się pomiędzy 88 a 89 nukleotydem cDNA.
-Notacja „76A/C” czasami stosowana jest zamiast A>C, ale jest to
odrzucany przez Human Genome Variation Society sposób zapisu.
* delecje oznaczamy skrótem „del” poprzedzonym przez numery nukleotydów
flankujących delecję (wchodzących w jej skład!), oddzielone podkreślnikiem (”
_ „).
– np. 76_78del (lub zamiennie 76_78delACT) symbolizuje delecję trzech
nukleotydów, ACT począwszy od nukleotydu 76, kończąc na 78
– 82_83del (lub 82_83delTG) oznacza, że np. gdy mamy delecję w
sekwencji ACTTTGTGCC (pierwsza adenina od 5′ końca to 76) to
sekwencja ta przyjmie postać ACTTTGCC.
– IVS2_IVS5del (inaczej 88+?_923+? or EX3_5del) to forma zapisu dużych
delecji obejmujących granice intron/egzon. Delecja zaczyna się w
nieznanej pozycji intronu 2 (po pozycji 88 oznaczającej koniec
poprzedzającego egzonu drugiego) i kończy się gdzieś w intronie piątym,
konkretna pozycja jednak jest nieznana (jednak po ostatnim nukleotydzie
egzonu piątego o numerze 923)
* insercje oznaczamy poprzez dodanie skrótu „ins” po koordynatach
nukleotydów flankujących, analogicznie jak w przypadku delecji oddzielonych
od siebie podkreślnikiem (” _ „).
– dla przykładu 76_77insT oznacza wstawienie tyminy pomiędzy
nukelotydy 76 i 77
-zapis insercji, np. 83_84insTG może by wymiennie stosowany z zapisem
duplikacji 82_83dupTG jeżeli insercja wystąpi w tandemie: mając
sekwencję referencyjną ACTTTGTGCC (A to 76 nukleotyd) i insercję TG w
miejsce oznaczone pogrubieniem ACTTTGTGTGCC można drugie z kolei
TG traktować jako duplikację (więcej o notacji duplikacji poniżej)
-w kontekście zmiennej ilości tandemowych powtórzeń (polimorfizm STR)
można stosować zapis np. 993(TG)3-6, oznacza to nukleotydy 992-993
zawierają pierwszą parę TG, która jest następnie powtórzona od 3 do 6
razy w populacji.
-czasami zamiast podkreślnika używa się daszku” ^” jako łącznika
pomiędzy numerami nukleotydów przy notacji insercji (czyli np.
83^84insTG)ale jest to zapis nierekomendowany
*indele (czyli kombinacja insercji i delecji w danej pozycji nukleotydowej)
oznaczamy poprzez podanie numerów nukleotydów, pomiędzy którymi
nastąpiła zmiana sekwencji (analogicznie jak w poprzednich przykładach) z
dodatkiem „indel” i symbolami nukleotydów które uległy insercji. Można też
wymienić całą sekwencję, która uległa delecji i insercji.
-np. 112_117delinsTG (lub 112_117delAGGTCAinsTG) określa zamianę
112 to 117 ciągu nukleotydów AGGTCA na TG.
-krótsza notacja poprzedniego przykładu może wyglądać tak: 112_117>TG
ale nie jest rekomendowana
*duplikacje oznaczamy symbolem „dup”, poprzedzonym koordynatami
sekwencji flankujące
-np. 77_79dupCTG oznacza dodatkowe powtórzenie nukleotydów o
koordynatach 77 do 79
*inwersje opisuje skrót „inv” poprzedzony koordynatami sekwencji
flankującej
-np. 203_506inv (albo 203_506inv304) wskazuje, że w sekwencję zostały
włączone 304 nukleotydy począwszy od pozycji 203 (włącznie), a
skończywszy na 506.
*translokacje: wytyczne co do określania koordynatów translokacji wciąż
ewoluują. Problem nie jest trywialny, ponieważ mamy tu do czynienia w
najprostszym modelu ze „sklejeniem się” dwóch zupełnie różnych fragmentów
DNA, a więc z sekwencjami o różnych numerach akcesyjnych. Zdarzają się
jednak aberracje bardzo złożone, które trudno jest opisać w notacji
nukleotydowej.
Translokacje tradycyjnie opisuje się przez podanie typu translokacji, numerów
chromosomów, typu ramion i prążków, w obrębie których doszło do złamania
chromosomowego. Szczegółową notację zawierają rekomendacje „ISCN 2009:
An International System for Human Cytogenetic Nomenclature”. Na poziomie
sekwencji DNA postanowiono po prostu za notacją chromosomową w kolejnym
nawiasie podać koordynaty wg zamieszczonych tu wcześniej zasad. Ważne
jest, by dokładnie określić numery akcesyjne sekwencji, których koordynaty
podajemy.
– dla przykładu t(X;4)(p21.2;q35)(857+101_857+102) określa translokację
pomiędzy ramieniem p heterochromosomu X a ramieniem q chromosomu
pary 4. Breakpoint leży pomiędzy 101 a 102 nukleotydem od końca
intronu, łącząc Xp21.2 i
4q34. Uwaga! Numeracja ma zastosowanie
tylko w odniesieniu do chromosomu X, bo odnosi się do pęknięcia
tego chromosomu. W odniesieniu do chromosomu 4 koordynaty
byłyby inne!
*zmiany w dwóch różnych allelach tego samego locus genowego, tzw
zmiany bialleliczne (np. u chorych na choroby dziedziczne) zapisywane są w
osobnych nawiasach kwadratowych powiązanych znakiem dodawania, czyli
[zmiana 1]+[zmiana 2]
-np. [76A>C] + [76A>C] oznacza homozygotyczną substytucję w 76
-[76A>C] + [?] symbolizuje znaną substytucję A>C w jednym allelu i
nieznaną zmianę w drugim allelu.
*dwa warianty w jednym allelu (mutacje monoalleliczne): zapisywane są
jak powyżej, z tym że w pojedynczym nawiasie kwadratowym, tj.
[mutacja1+mutacja2]
-np. [76A>C + 83G>C] oznacza wystąpienie dwóch substytucji: w pozycji
76 i w pozycji 83
Obecnie dopuszcza się drugi wariant tego zapisu, z separatorem „;”
zamiast „+”. W tej notacji [powyższy przykład przybiera formę [76A>C;
83G>C]
Opracowano na podstawie: Nomenclature for the description of sequence
variations
<p style=”padding-left: 30px;”>* <strong>substytucje</strong> oznaczamy
zawsze nawiasem
Tęcza w próbówce: jak dobierać
barwniki sond w reakcjach
multiplex?
Jeżeli projektujecie reakcje Real-Time PCR (szczególnie pośredniego
ilościowania), warto zastanowić się nad wersją multiplex: zastosowanie
kilku par starterów i sond jest najwygodniejszym, najszybszym i
najbardziej precyzyjnym sposobem na ilościową ocenę kilku transkryptów.
Pojawia się jednak istotny problem: jakie barwniki do sond będą
najbardziej odpowiednie?
Każdy z barwników posiada specyficzne spektrum absorpcji i emisji fali
świetlnej. Fluorescencja jest skutkiem wybicia niosącego wysoką energię
elektronu z cząsteczki barwnika i emisji części pochłoniętej podczas tego procesu
energii. Cząsteczka barwnika pochłania odpowiedni kwant światła o wyższej
energii (absorpcja), a po wybiciu elektronu emituje kwant o niższej energii
(emisja). Od struktury cząsteczki i rozkładu powłok elektronowych zależy, jak
duża porcja energii musi być dostarczona- dlatego różne barwniki wymagają
odmiennych długości fali świetlnej (niosących różną energię) do wzbudzenia.
Dobór odpowiedniego zestawu barwników, których spektra emisji i absorpcji jak
najmniej się pokrywają, jest bardzo istotny: pozwala na minimalizację tła i nie
prowadzi do niespecyficznego odczytu fluorescencji. W sieci dostępne jest kilka
zestawień, które ułatwiają dokonanie wyboru, jednak w żadnym z nich nie ma
pełnej gamy barwników, oferowanej obecnie na rynku. Poniżej przedstawiam kilka
takich zestawień.
1. Multiplexing qPCR recomendations, Biosearch Technologies
Moja ulubiona aplikacja do wyboru sond. Z jednej strony mamy możliwość
przejrzenia tabeli sond oferowanych przez BT, idealnych dla danego
termocyklera, z drugiej możemy sami zestawić niemal dowolnie spektra absorpcji
i emisji dwudziestu barwników, które zostały wprowadzone do bazy aplikacji
„Spectral Overlay Chart„.
2. Qiagen Multiplex Real-Time PCR Resource Center
Qiagen opublikował na swojej stronie ciekawe poradniki dot. multiplex RQ-PCRu,
jednak najprzydatniejsza jest tabela zestawień barwników w kombinacjach pod
dany termocykler. Mamy tu większy wybór niż w przypadku tabeli BT.
3. Zestawienie sond Genomedu
Ciekawe zestawienie 74 kombinacji barwnik-quencher, porównujące chyba
wszystkie potrzebne nam parametry. Wygodna zakładka w lewym górnym rogu
pozwala „odsiać” tylko te sondy, które zawierają interesujący nas barwnik lub
quencher. Estetycznie i kolorowo.
Wybór sondy
do qPCR może być nie lada wyzwaniem, zważywszy na szeroki ich wybór na
rynku.
Jakie znaczenie ma wybór odpowiednich barwników?
Pytanie na pozór proste, wcale takie nie jest. Przede wszystkim musimy wiedzieć,
jakie kanały fluorescencji odczytuje nasz termocykler. Ta podstawowa informacja
powinna znajdować się w opcjach oprogramowania oraz w instrukcji urządzenia.
W starszych termocyklerach mieliśmy do wyboru np. tylko 2 kanały (zielony pod
FAM i SYBR i żółty pod JOE). Obecnie większość cyklerów ma możliwość odczytu
co najmniej 5 kanałów, co daje nam prawie nieograniczoną dowolność w doborze
kolorów.
Ważne są także długości fali wzbudzenia i emisji lasera naszego urządzenia.
Warto wybierać takie barwniki, których maksima absorpcji/emisji są zbliżone do
wartości zdefiniowanych w cyklerze. W tej materii przychodzą nam z pomocą
wspomniane wcześniej tabele.
Pozostaje jeszcze kwestia quencherów: skąd mamy wiedzieć, jaki „wyciszacz”
będzie najlepszy dla sond typu FRET, jeżeli mamy do wyboru kilka z nich? Żeby
odpowiedzieć sobie na to pytanie zapoznajmy się ze spektrum absorpcji
quenchera i spektrum emisji barwnika fluorescencyjnego. Idealny quencher
absorbuje na tych samych długościach fali, na których barwnik emituje.
Ostatnia z uwag dotyczących barwników: nie wszystkie barwniki są tak samo
wydajne jeśli chodzi o fluorescencję. Np. sondy oparte o FAM w porównaniu z
większością „nowoczesnych” barwników (w sondzie o tej samej sekwencji i
stęzeniu) mają ponad dwukrotnie niższą fluorescencję. Nie jest to problemem,
musimy jednak zoptymalizować tzw. „gain” w opcjach oprogramowania cyklera
(dla danego barwnika i dla danej reakcji) który pozwoli nam do pewnego stopnia
znormalizować różnice we fluorescencji różnych barwników.