Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transkrypt

Farmaceutyczny
copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073
Miesięcznik
www.fpn.sum.edu.pl
Cena 24,50 zł
Przegląd Naukowy
IC Value - Current 4,55
MNiSW 6
ROK VII (XI)
Nr 7/2010 (66)
Scientific Review in Pharmacy
Czynniki ryzyka niekorzystnych zdarzeń sercowych
u chorych z przewlekłą skurczową
niewydolnością serca
Proleki w terapii nowotworów.
Część IV. Proleki aktywowane hipoksją
0
Metylacja DNA – główny znacznik epigenetyczny komórki
Porost islandzki – związki czynne, aktywność biologiczna
Porównanie skuteczności czynników silanizujących
w analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnych
techniką GC/MS
21
lat
ISSN 1425-5073
Czynnik NF-κB w fibroblastach skóry ludzkiej
poddanych działaniu kamptotecyny
Substancje biologicznie aktywne i lecznicze
obecne w wybranych gatunkach koniczyn
1
Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
Adres redakcji / Editorial Adress:
ul. Jedności 8 , 41-200 Sosnowiec, Polska / Poland
Tel. +48 32 364 11 50, +48 514 342 345
Fax. + 48 32 364 11 58
E-mail: [email protected]
6
Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board
Przewodniczący / Head:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec
Członkowie / Members:
Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok
Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja
Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków
Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa
Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź
Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania
Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja
Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin
Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań
Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja
Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia
Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria
Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków
Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin
Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec
Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice
Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia
Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa
Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok
Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław
Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin
Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia
Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja
Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk
Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia
Sekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary:
Dr n. med. Robert D. Wojtyczka
Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board:
Dr n. farm. Paweł Olczyk
Dr n. biol. Małgorzata Kępa
Mgr Anna Szeremeta
Mgr Agnieszka Jura – Półtorak
Dr n. hum. Anna Kierczak
Mgr inż. Marcin Chabior
Przemysław Jędrusik
Wydawca / Publisher:
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego
21
lat
Adres Wydawcy / Publisher Adress:
ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Poland
tel. +48 33 817 28 79, fax +48 33 817 36 31
Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.)
Marketing Manager:
Opracowanie graficzne / Graphics:
Agnieszka Romańska
Robert Cyganik
Nakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copies
Skład / Technical Editor:
Jerzy Partyka
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.
Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education.
Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach
z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania
nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą
wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja
nie odpowiada.
All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright
laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the
rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints
are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for
advertisements and reader letters.
Zdj. Zygmunt Wieczorek
Szanowni Państwo,
Koleżanki i Koledzy,
Drodzy Czytelnicy
Nadeszły długo oczekiwane wakacje, za oknem bezchmurne niebo i upały, a do Farmaceutycznego Przeglą‑
du Naukowego napływają kolejne publikacje, co świadczy
o zainteresowaniu Autorów i Czytelników naszym czasopismem, dając także nadzieję na dalszy jego rozwój
i umocnienie na rynku wydawniczym. Również i Kolegium
Redakcyjne intensywnie pracuje, nie ustając w działaniach
na rzecz podwyższania jakości procedur redakcyjnych i wydawniczych. Nasi wspaniali Informatycy opracowali system
elektronicznej rejestracji Autorów przesyłanych publikacji,
umożliwiający zarazem Autorom ciągłą weryfikację statusu
przedłożonych prac. Już niebawem, po niezbędnym przetestowaniu, system zostanie wprowadzony, a konieczne informacje, wraz z instrukcją, znajdą Państwo na stronie internetowej czasopisma.
W bieżącym numerze Farmaceutycznego Przeglądu Na‑
ukowego znajdą Państwo artykuły o zróżnicowanej tematyce badawczej, począwszy od prac o charakterze klinicznym
do tych z zakresu farmakologii, biochemii farmaceutycznej,
analizy instrumentalnej i terapii monitorowanej czy farma-
kognozji. To bogactwo tematyki przedstawianej na łamach
naszego czasopisma stanowi o jego wartości, tak bardzo
cennej dla szerokiego grona adresatów tych prac.
Tradycyjnie anonsujemy także nadchodzącą konferencję. Tym razem informujemy o Europejskim Sympozjum
p.t.: “Central European Symposium on Pharmaceutical
Technology – the Most Exciting European Scientific Event
in Fall 2010”, którego miejscem jest Graz (Austria), a które
odbędzie się w dniach 16 – 18 wrzesień br. Szanowni Państwo, polecam lekturę zamieszczonych w niniejszym numerze prac i polecam nasze czasopismo jako źródło wiedzy
o Państwa osiągnięciach, oraz jako platformę integrującą
całe nasze środowisko.
Życzę pełni wakacyjnego relaksu, dołączając jak zawsze
serdeczne pozdrowienia,
Redaktor Naczelny
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
6
Nr 7 / 2010
Spis treści
Risk factors of adverse cardiac events
in patients with chronic systolic heart failure0
u chorych z przewlekłą skurczową niewydolnością serca0
Część IV. Proleki aktywowane hipoksją0
Prodrugs in cancer therapy.
Part IV. Hypoxia activated prodrugs0
10
15
Metylacja DNA – główny znacznik epigenetyczny komórki0
DNA Methylation – a major epigenetic marker of the cell0
20
Iceland Moss – active compounds, biological properties
23
Porównanie skuteczności czynników silanizujących
w analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnych techniką GC/MS0
Comparison of the Efficiency of Silylating Agents in GC/MS Analysis
of Non-steroidal Anti-inflammatory Drugs
28
poddanych działaniu kamptotecyny0
NF-κB factor in human skin fibroblasts treated with camptothecin
33
Substancje biologicznie aktywne i lecznicze
obecne w wybranych gatunkach koniczyn
Biologically active and therapeutic substances from Trifolium species
39
TU
Graz
© Graz Tourismus
2nd Announcement
Call for Papers
Karl-Franzens-University,
Graz University of Technology and
Research Center Pharmaceutical Engineering
are organising the:
8th Central European Symposium
on Pharmaceutical Technology
Satellite Symposium:
4th International Graz Congress
for Pharmaceutical Engineering
September 16-18, 2010
Graz, Austria
www.cespt2010.org
Central European Symposium on
Pharmaceutical Technology - the Most
Exciting European Scientific Event in Fall 2010
Graz
The Conference City
With�a�well�established�reputation�for�being�a�lively�place�of�culture,�Graz became�
the� first� city� in� Austria� to� gain� the� accolade� of� being� the� European� Capital� of�
Culture� in� 2003.� The� unique� flair� of� the� metropolis� by� the� river Mur� was�
instrumental�in�assuring�the�success�of�the�Cultural�Capital�project�– which�is�why�
Graz�continues�to�refer�to�itself�today�as�the�‘cultural�capital’.�An�understandable�
title�in�view�of�its�unique�programme of�events.
© Graz Tourismus
The History of CESPT
In�the�late�1980s,�the�initiative�for�Central�European�scientific�meetings�dealing�with�pharmaceutical�technology�arose�
as�a�result�of�the�long�standing�collaboration�between�the�laboratories�for�pharmaceutical�technology�of�the�faculties�of�
pharmacy�in�Trieste,�Italy�and�Ljubljana,�Slovenia.�Three�round�table�meetings,�entitled�Alpe Adria Seminars�on�
Pharmaceutical�Technology,�were�held.
As�a�result�of�this�initiative�the�1st Central�European�Symposium�on�Pharmaceutical�Technology�(CESPT) was�held�in�
October�1995�in�Bled,�Slovenia�under�the�patronage�of�EUFEPS.�Two�subsequent�events,�in�1997�and�1999�were�
successfully�organized�in�Portoroz,��Slovenia.
Later�CESPT�conferences�followed�in�Hungary�and�Austria,�the�last�meeting�in�2008�was�located�in�Ljubljana,�the�capital�
city�of�Slovenia.�More�than�200�contributions�were�presented�and the�conference�was
accompanied�by�a�Satellite�Symposium�entitled�Challenges�and�Opportunities�in�Multiparticulate Drug�Delivery.
A�special�issue�of�International�Journal�of�Pharmaceutics�was�published�from�this�great�event.
Satellite Symposium:
th
4
International Graz Congress for Pharmaceutical Engineering
For�the�forth�time,�the�International�Graz�Congress�for�Pharmaceutical�Engineering�will�focus�on�recent�
developments�in�the�areas�of�Quality�by�Design,�continuous�processing,�process�understanding,�modelling,�
pharmaceutical�nanotechnology�and�new�process�analytical�technology�(PAT).�Together�with�CESPT�the�Satellite�
Symposium�functions�not�only�as�a�platform�to�present�research�results,�but�also�to�initiate�cooperations on�an�
international�level.��
Key Note Speakers:
More Information:
www.cespt2010.org
Iztok�Grabnar,�Ljubljana,�Slovenia
Peter�Kleinebudde,�Düsseldorf,�Germany
Steve�Hammond,�Pfizer,�USA
Klaus�Langer,�Münster,�Germany
Claus�Michael�Lehr,�Saarbrücken,�Germany
Wolfgang�G.�Kreyling,�Helmholtz�Zentrum�München,�Germany
Thomas�Rades,�Dunedin,�New�Zealand
Geza�Regdon,�Szeged,�Hungary
Barbara�Rothen�Rutishauser,�Bern�Switzerland
Jonathan�PK�Seville,�Coventry,�UK�
Frantisek�Stepanek, London,�UK
Werner�Weitschies,�Greifswald,�Germany
Alexander�Yarin,�Chicago,�USA
We�look�forward�to�meeting�you�in�Graz�in�2010�!
Call for Papers
We cordially invite you to submit papers on the following topics:
• Continuous�Manufacturing�
• Materials,�Constitutive�Behavior,�
Structuring�Methods,�Structure�
Functionality�Relations�
• Quality�by�Design�Strategies�and�
Their�Impact�on�the�Approval�Process�
• New�Process�Analytical�Technology�
• Advances�in�Powder�Processing�
• Rational�Design�of�Novel�
Formulations�
• Biopharmaceuticals�Manufacturing�
Nano� and�Micro�Delivery�Systems
Safety�of�Nanomaterials
Gene�and�Protein�Delivery�Systems
Biomaterials
Novel�Dosage�Forms
Modified�Drug�Release
Drug�Targeting
Drug�Dissolution,�Absorption,�Metabolism�and�Membrane�
Transport
• Bioavailability,�Bioequivalence,�Biosimilarity
• Pharmacokinetics,�Pharmacodynamics and�Efficacy�of�
Drug�Delivery�Systems�
•
•
•
•
•
•
•
•
Participants�are�invited�to�submit�abstracts�online�for�oral�or�poster�presentations�before�April�30,�2010.�Abstracts
must conform to�the template (http://www.cespt2010.org/kongress_en/documents/TemplateCESPT.doc),�they have
to�be written in�English�and�must be submitted online.�All�accepted�abstracts�will�be�published�in�a�special�issue�of�
Scientia Pharmaceutica.�
Notification of acceptance:
Authors will�be notified about the acceptance of�their abstract and�the type of�presentation (oral�or poster)�by June 30,�
2010.�Acceptance of�your abstract constitutes your commitment to�attend and�present your work.
Presentations:
Oral�presentations will�be held after the plenary lectures.�The time�limit for oral�contribution will�be 20�minutes
including discussion.�
Posters�will�be exhibited during the Symposium.�The panels for the poster presentation are of�the following size:�height
150cm,�width 90cm.
Registration:
Early�Registration��
Late�Registration
(until�30th�June,�2010)� (after�30th�June,�2010)�
Academic,�Industry�
Students*
Social�Program�
€ 390
€ 170
€ 40
€ 440
€ 220
€ 40
*Students�are�requested�to�send�a�scanned�copy�of�the�confirmation�letter�of�their�student�status�signed�
by�the�head�of�the�institute�/�dean.
Fees�include�admission�to�the�scientific�/�exhibition,�coffee�breaks,�lunches,�conference�reception�and�
symposium�documentation�consisting�of�a�detailed�printed�program and�an�USB�Stick�containing�all�
abstracts.�The�social�program�includes�a�conference�dinner.
Payment�can�be�made�by�credit�card�only.
Scientific Committee:
Prof.�Dr.�István�Antal,�Budapest,�Hungary
Prof.�Dr.�Ubaldo Conte,�Pavia,�Italy
Prof.�Dr.�Dominique�Duchene,�France
Prof.�Dr.�Alexander�T.�Florence,�United�Kingdom
Prof.�Dr.�Jelena�Filipovi��Gr�i�,�Zagreb,�Croatia
Prof.�Dr.�Peter�Kleinebudde,�Düsseldorf,�Germany
Prof.�Dr.�Jörg�Kreuter,�Frankfurt,�Germany
Prof.�Dr.�Julijana Kristl,�Ljubljana,�Slovenia
Prof.�Dr.�Miloslava�Rabišková,�Brno,�Czech�Republic
Prof.�Dr.�Stane�Sr�i�,�Ljubljana,�Slovenia
Prof.�Dr.�Helmut�Viernstein,�Vienna,�Austria
Prof.�Dr.�Zuzana�Vitková,�Bratislava,�Slovakia
Exhibition:
The�Symposium�will�be�accompanied�by�an�industrial�exhibition�of products�and�technologies.�We�
invite�you�to�take�the�opportunity�to�present�your�company�and�development�achievements.�For�
further�Information,�please�contact�[email protected]
More Information:
www.cespt2010.org
Location:
The�Karl�Franzens�University,�located�in�Graz,�Austria,��
is�the�second�largest�and�second�oldest�university�in�
Austria.
Address:
WWW
Universitätsplatz 3
A�8010�Graz
http://www.uni�graz.at
Accomodation:
For�hotels,�rooms�and�highlights�of�the�City�of�
Graz,�which�is�located�close�to�one�of�the�most�
beautiful�wine�regions�in�Europe,�please�visit:
http://www.graztourismus.at/
Important dates:
Registration:
Symposium�dates:
16.�18.�9.�2010
Satellite�Symposium: 16.�17.�9.�2010
Abstract�Submission:
Abstract�Acceptance:
30.4.2010
30.6.2010
Available�online
http://www.cespt2010.org
Important addresses:
President�of�the�Symposium
Univ.�Prof.�Dr.�Andreas�Zimmer
Karl�Franzens�University�Graz
E�mail:�Andreas.Zimmer@uni�graz.at
Co�President�of�the�Symposium
Univ.�Prof.�Dr.�Aleš Mrhar
University�of�Ljubljana
E�mail:�[email protected]�lj.si
President�of�the�Satellite�Symposium
Univ.�Prof.�Dr.�Johannes�Khinast
Graz�University�of�Technology
Inst.�for�Process�and�Particle�Engineering
Secretary�of�the�Symposium
Dr.�Eva�Roblegg
Karl�Franzens�University�Graz
Inst.�of�Pharmaceutical�Sciences
Phone:�+�43�(316)�873�7464
FAX:�+�43�(316)�873�7963
Phone:�+43�(316)�380�8889
FAX:�+43�(316)�380�9100
E�mail:�[email protected]
E�mail:�Eva.Roblegg@uni�graz.at
Organising Institutions:
Karl�Franzens�University
Graz
TU
Graz
Graz�University
of�Technology
Research�Center
Pharmaceutical
Engineering
Co-sponsoring and supporting Organisations & Societies:
APV,�International�Association�for
Pharmaceutical Technology,�Germany
HSPS,�Hungarian Society�for Pharmaceutical Sciences
Hungaria
A.D.R.I.T.E.L.F.�Associazione Docenti e�
Ricercatori Italiani di�Tecnologie e�
Legislazione Farmaceutiche,�Italy
ÖPhG,�Österreichische�Pharmazeutische�Gesellschaft
Austria
BioNanoNet Research�Association
Austria
Controlled Release�Society
German�Loacal Chapter
Czech�Pharmaceutical Society
Czech�Republic
European�Federation for
Pharmaceutical Sciences
HFD,�Croatian Pharmaceutical Society
Croatia
SFD,�Slovenian Pharmaceutical Society
Slovenia
MFD,�Macedonian Pharmaceutical Assiciation
Macedonia
SFS,�Slovak Pharmaceutical Society
Slovakia
Pharmaceutical Society�of�Serbia
Serbia
Polish Pharmaceutical Society
Poland
Association�of�Pharmacists of�the Federation of
Bosnia and�Herzegovina
For more information please visit our website
www.cespt2010.org
Farm Przegl Nauk, 2010,7,10-14
Risk factors of adverse cardiac events
in patients with chronic systolic heart failure
u chorych z przewlekłą skurczową niewydolnością serca
Aleksander Owczarek 1, Bożena Szyguła-Jurkiewicz 2, Krzysztof Helewski 3,
Karolina Klimaszewska 4, Romuald Wojnicz 3
Division of Statistics in Sosnowiec, Medical University of Silesia, Katowice, Poland
III Department of Cardiology in Zabrze, Medical University of Silesia, Katowice, Poland
3
Department of Histology & Cardiology in Zabrze, Medical University of Silesia, Katowice, Poland
4
Student Scientific Society, III Department of Cardiology in Zabrze, Medical University of Silesia, Katowice, Poland
1
2
Abstract
Streszczenie
Chronic heart failure (HF) is an arising important medical problem. Apart from neuroendocrine system activation,
it is also characterized by an inflammatory component.
Pro-inflammatory cytokines exacerbate haemodynamic
abnormalities, exert direct toxic effects on the heart and
contribute to cachexia. A prospective study has been accomplished in the group of 164 patients with stable systolic
heart failure in order to investigate the association between
hypercoagulability, inflammation, NT-pro BNP and the
clinical outcome. Major adverse cardiac event (MACE)
experienced 43.3% of patients. Independent inflammatoryrelated risk factors of MACE in patients with HF are plasma levels of: high sensitivity C-reactive protein, fibrinogen, D-dimers and NT-pro BNP.
Przewlekła niewydolność serca (HF) stanowi istotny problem medyczny. Oprócz aktywacji układu współczulnego, niewydolność serca charakteryzuje się również zwiększoną aktywnością układu odpornościowego. Krążące we
krwi cytokiny prozapalne nasilają zaburzenia hemodynamiczne, wywierają bezpośredni toksyczny wpływ na serce i wtórnie przyczyniają się do wyniszczenia organizmu
pacjenta. W celu oceny związku między czynnikami odzwierciedlającymi aktywność układu immunologicznego,
krzepnięcia oraz NT-pro BNP a rokowaniem odległym,
przeprowadzono badanie prospektywne w grupie 164
pacjentów ze stabilną skurczową niewydolnością serca.
U 43.3% pacjentów wystąpiło niekorzystne zdarzenie
sercowe (MACE). Niezależnymi czynnikami związanymi ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia MACE
u tych chorych okazały się stężenia w surowicy: białka C-reaktywnego wysokiej czułości, fibrynogenu,
D-dimerów i NT-pro BNP.
Key words: high sensitivity C-reactive protein, heart failure, risk factors, MACE
Słowa kluczowe: białko C-reaktywne wysokiej czułości,
niewydolność serca, czynniki ryzyka, niekorzystne zdarzenie sercowo-naczyniowe (MACE)
Introduction
Cardiovascular diseases are the leading cause of morbidity, disability and premature mortality in developed
countries. Chronic heart failure (HF) is an arising important
medical problem. It accounts for at least 5% of admissions
to general medical and geriatric wards and for almost 2% of
the total healthcare expenditure (dependent on the country)
[1]. It has been estimated that only in Europe HF affects 10
million people [2]. Most common causes of HF are: coronary artery disease leading to myocardial infarction (systolic
dysfunction), hypertension and valvular heart disease, infections, ‘idiopathic’ dilated and alcoholic cardiomyopathy
[3].
Heart failure is a clinical syndrome resulting from a
10
structural and functional cardiac disorder. It impairs the ability of the ventricle to fill with or eject blood according to
the needs of the body, or precludes it from doing so in the
absence of increased filling pressures. It is a multisystem
disorder which is characterized by abnormalities of cardiac,
skeletal muscles as well as renal function, stimulation of
the sympathetic nervous system and a complex pattern of
neurohormonal changes [4]. Figure 1 presents the overview
of main pathophysiology pathways in HF. As heart failure
advances there is a relative decline in the counter regulatory effects of endogenous vasodilators such as: nitric oxide, prostaglandin, bradykinin, atrial and brain natriuretic
peptides (ANP, BNP). Other factors that play a role in the
pathogenesis of HF include: the endothelin and adenosine
receptor systems, vasopressin, pro-inflammatory cytokines
(mainly: tumour necrosis factor alpha TNF-α, C-reactive
protein CRP, interleukin IL-1 and IL-6) [3, 5].
Apart from neuroendocrine system activation, heart failure is characterized by an inflammatory component. The
mechanisms of inflammation play an important role in the
process of left ventricular remodelling including structural
and functional changes of the myocardium which are not
only in part responsible for the development of symptoms
but also for the disease progression. Pro-inflammatory cytokines exacerbate haemodynamic abnormalities, exert direct toxic effects on the heart and contribute to cachexia [6].
Also, it has been reported that inflammation is strictly correlated with clotting activation which has clinical relevance
to HF [7].
The aim of this study was to investigate the association
between hypercoagulability, inflammation, NT-pro BNP
and the clinical outcome – MACE (rehospitalisation, death,
heart transplantation), in patients with chronic systolic heart
failure.
Materials and methods
A prospective study has been accomplished in the group
of 164 patients (mostly man – 83.54%) with stable systolic heart failure, selected according to criteria of inclusion
and exclusion. According to the European Guidelines for
heart failure management, all patients – at least during three
months before hospital admission, were treated with angiotensine converting enzyme inhibitor (Captopril) or angiotensine receptor antagonist (ARA), β‑blocker (metoprolol
CR or carvedilol) in maximal tolerated doses and with patient fitted doses of digoxine, spironolactone and furosemide
[8]. The study protocol was accepted by the Bioethical Committee of Silesian Medical University in Katowice: NN-043
-10/95 and NN-6501-158/I/06/07; the patients gave their
conscious consent to participate in the study.
Inclusion criteria:
stable systolic heart failure – increased left ventricular
end–diastolic diameter LVEDd>57mm and reduced left
ventricular ejection fraction LVEF<40%, lasting at least 6
months and proceeded by a 3–month optimization of outpatient pharmacology treatment.
Exclusion criteria:
• more than 30% narrowing in the coronary arteries indicated by the coronary angiogram,
• active myocarditis revealed in biopsy material according to Dallas classification,
• chronic obstructive pulmonary disease or other respiratory diseases with the pulmonary hypertension,
• presence of acquired/congenital valve disease or other
disorders leading to impairment of myocardial structure and functions (with the exception of relative mild
or moderate mitral/tricuspid valve regurgitation),
• presence of clinically confirmed systemic disease,
• recognized cancer or ongoing oncological treatment,
• confirmed infectious diseases during at least 3 months
prior to study entry,
• endocrine diseases (diabetes mellitus, hyperthyroidism and hypothyroidism, Cushing disease),
• advanced liver or kidney disease,
• alcoholic disease,
• planned heart transplantation.
The clinical observation of patients began on admission to
hospital and lasted 3 years. Patients were admitted to hospital
in a stable clinical status, in order to conduct invasive and
non-invasive tests, to identify the aetiology of HF and establish their future treatment (including heart transplantation).
The evaluation of hs-CRP was
performed using the immunoturbidimetric method with a wave
length of 552nm and augmentation of latex particles (Cobas Integra 800, Roche). Plasma level
of NT‑pro BNP was measured
by the Elecsys 2010 (Roche), and
D‑dimers were assessed by the
STA – Compact (Roche).
Statistical analysis
Fig. 1. Pathophysiology pathways in chronic heart failure.
Data in the tables were presented as mean ± standard deviation (SD) and median with
lower and upper quartiles. Variables distribution was evaluated by the Shapiro‑Wilk test.
Homogeneity of variances was
assessed by the Levene test.
Study hypotheses were verified by the t-Student test for
unpaired variables with nor-
11
Farm Przegl Nauk, 2010, 7
mal distribution or the U Mann‑Whitney test for unpaired
variables without normal distribution. The univariate Cox
proportional hazard analysis defined MACE hazard ratios
in the 3-year follow-up. All variables found statistically significant in the univariate analysis (p<0.05) were included in
the multivariate backward stepwise analysis. The results of
Cox proportional hazard analysis were presented as hazard
ratios with the 95% CI, Wald statistics and corresponding
significance level. The survival analysis was shown with the
Kaplan‑Meier curve. Correlations between variables were
assessed with Spearman coefficients. All calculations were
performed using the commercially available statistical package Statistica 8.0 and Excel MS Office.
Table 1 presents baseline blood test results. In univariate
analysis, as risk factors for adverse cardiac events, there were
identified the following pro-inflammatory markers: serum
level of high sensitivity C-reactive protein, fibrinogen, Ddimers and NT-pro BNP. Table 2 encloses results of the Cox
proportional hazard univariate and backward stepwise multivariate analysis. Two most important risk factors for MACE
are: serum level of hs-CRP and NT-pro BNP. Hazard ratio of
MACE may be calculated with the following formula:
0h (t, hs-CRP, NT-pro BNP)=h(t)∙exp(0.0394∙hs-CRP+0.2183∙NT-pro BNP)
Figure 1 presents the Kaplan–Meier curve of patients
survival without MACE.
Results
We found the following correlations: hs-CRP with NTpro BNP (0.3789; p<0.001), fibrinogen (0.5681; p<0.001)
All 164 patient were divided into two groups: with com- and D-Dimers (0.2051; p<0.01), NT-pro BNP with fibrinobined end–point (MACE) (N=71 [43.29%]) and without gen (0.2708; p<0.001) and D-Dimers (0.3110; p<0.001), fiMACE (N=93 [56.71%]). Thirty one patients (18.9%) died, brinogen with D-Dimers (0.1904; p<0.05).
5 patients (3.05%) were qualified for urgent heart transplanFor HF patients whose serum level was hs-CRP
tation, 51 patients (31.10%) were re–admitted to hospital >1.81 mg/l1 and NT-pro BNT>1608 pg/ml1 – compared to padue to deterioration of heart failure symptoms.
tients with lower levels of pro-inflammatory markers, absolute
risk increase was 38.6%, attribTab. 1. Laboratory results for patients with and without major adverse cardiac events
utable risk was 29% and relative
risk of MACE was 2.14 (95%CI:
Patients:
MACE +
MACE –
p
1.57–2.92; χ2=18.38, p<0.0001).
71 (43.29%)
93 (56.71%)
Number
needed to treat, which is
45.56±10.26
46.31±10.49
Age [years]
0.4600
the
number
of patients who must
47.0 (38.0-53.0)
49.0 (41.0-54.0)
receive
a
particular
therapy to
5.41±7.36
2.62±2.87
<0.05
hs-CRP [mg/l]
prevent
one
major
adverse
car2.74 (1.10-5.16)
1.69 (0.93-3.01)
diac
events
was
2.59.
386.3±97.3
357.6±81.2
<0.05
Fibrinogen [mg/dl]
365.0 (313.0-440.0)
349.0 (301.0-413.0)
Discussion
0.582±0.716
0.365±0.340
<0.01
D-dimers [µg/ml]
0.250 (0.220-0.620)
0.220 (0.220-0.350)
Both our as well as other
13.95±1.46
13.63±2.14
Prothrombin time [s]
0.1500
studies
suggest that immune ac13.70 (13.00-14.40)
13.40 (12.80-14.10)
tivation
plays an important role
9.34±1.07
9.22±0.70
Haemoglobin [mmol/l]
0.6938
in
the
disease
progression of
9.20 (8.60-9.80)
9.20 (8.80-9.70)
chronic heart failure. C-reactive
0.44±0.04
0.43±0.03
Haematocrit
0.0778
protein, which is an acute phase
0.45 (0.42-0.47)
0.43 (0.42-0.46)
protein synthesised predomi4.84±0.45
4.80±0.44
nantly by hepatocytes under the
RBC [x106]
0.5424
4.86 (4.50-5.17)
4.78 (4.54-5.00)
influence of cytokines such as
7.22±1.59
6.78±1.63
3
IL-6 and TNF-α, was defined as
WBC [x10 ]
0.0749
7.13 (6.00-8.46)
6.63 (5.79-7.65)
an independent risk factor for
2381±2413
1018±1181
adverse events in patients with
<0.001
NT-pro BNP [pg/ml]
1701 (281-3789)
620 (295-1275)
heart failure. CRP activates the
RBC – red blood cells, WBC – white blood cells.
classic complement pathway
and participates in the opsonizaTab. 2. Results of univariate and backward stepwise multivariate analysis: Cox proportio- tion of ligands for phagocytosis
nal hazard and prognostic values of risk factors for MACE
[9, 10, 11]. In the population anParameter
HR
± 95% CI
Wald statistic
p
alyzed by Alonso‑Matinez et al.
Univariate
[15], like in our study, elevated
<0.001
hs-CRP [mg/l]
1.0585
1.0255 – 1.0927
12.35
CRP was associated with increased risk of hospitalization in
<0.05
Fibrinogen [mg/dl]
1.0028
1.0004 – 1.0052
5.06
long‑term observation. Further<0.001
1.9354
1.3594 – 2.7555
13.42
D-dimers [µg/ml]
more, El-Menyar showed that
<0.0001
NT-pro BNP [ng/ml]
1.2712
1.1685 – 1.3830
30.76
Multivariate
<0.05
hs-CRP [mg/l]
1.0402
1.0052 – 1.0764
5.09
1
median for all group
<0.0001
NT-pro BNP [ng/ml]
1.2439
1.1360 – 1.3621
22.23
12
Fig. 2. Kaplan-Meier survival estimate for HF patients.
patients with CRP levels higher than 0.9 mg/dL were identified
ascandidates for earlier hospitalization than those with
lower level of CRP. Higher levels of CRP were also related
to higher rates of mortality [12]. Huang et al. examined 72
patients with HF and found that CRP level higher than 5.38
mg/L was an independent significant predictor of MACE
(hazard ratio in Cox analysis HR=2.91; p<0.05) [13].
With increasing cardiac dysfunction, synthesis and release of cardiac natriuretic peptides rises incrementally in
concurrence with other neurohormonal responses observed
in heart failure. Similar to our study, where NT-pro BNP
plasma level proved to be an independent risk factor of
MACE, Olsson at al. showed that plasma concentrations of
NT-pro BNP above the all-group median (1242 pg/ml) were
associated with higher all-cause mortality (RR 2.77; 95%
CI 2.33-3.3, p<0.001). Patients who achieved NT-pro BNP
levels<400 pg/ml during follow-up had a lower subsequent
mortality (RR 0.32; 95% CI 0.15-0.69, p=0.004) [14]. Richard and Troughton revealed also that the treatment of heart
failure guided by NT-proBNP levels appeared to reduce cardiovascular events compared to intensive clinically guided
treatment [15]. Also Jourdain et al. proved that in optimally
treated HF patients, a BNP-guided strategy recued the risk
of HF-related death or hospital stay for heart failure [16].
Anand et al. showed that CRP was associated with a
quartile-dependent increase in mortality and morbidity even
after adjustment for other significant predictors of HF mortality and morbidity, including BNP. Compared with patients
in the lowest quartile of CRP, the adjusted risk of mortality
and first morbid event were increased by 1.5 in the highest
CRP quartile. Moreover, patients who had both CRP and
BNP levels above the all-group median values (3.23 mg/L
and 960 pg/mL respectively) had twice (2.14 in our study)
the risk of MACE of those with
levels of both markers below
the median [9]. In group of 306
clinically stable patients with
non-ischemic HF, Lamblin et
al. obtained hs-CRP and BNP
as independent risk factors, in
multivariable Cox proportional
hazard analysis. Hazard ratio for
hs-CRP>3 mg/L was 1.05 (95%
CI: 0.52-2.11, p=0.89) and for
BNP>38 pmol/L was 3.26 (95%
CI: 1.19-8.98; p<0.05) [17].
In univariate analysis, fibrinogen and D-dimers reflecting the
activation of coagulation system
were also identified as independent risk factors of MACE
in patients with heart failure.
Experimental studies report increased indexes of inflammation
and coagulation system activation in chronic heart failure [7].
In our study, like in the studies
of Alehagen et al. [18] and Marcucci et al. [7], D-dimers level
in patients who underwent cardiac event was elevated. Kannel et al. showed that there is
an independent contribution of fibrinogen to cardiovascular
disease in general, even on adjustment for coexistent risk factors. Fibrinogen enhances the risk of cardiovascular disease in
hypertensives, diabetics, and cigarette smokers [19]. Patients
with HF and cachexia have an increased hepatic fibrinogen
synthesis rate related to the level of C-reactive protein [20,
21]. Furthermore, HF patients with a severely impaired haemodynamic situation showed elevated levels of fibrinogen
compared to patients with a moderately impaired haemodynamic situation [22]. Moreover, we also confirmed that higher
level of fibrinogen serum concentration strongly (positively)
corresponds with hs-CRP level.
Conclusions
• Independent risk factors of major adverse cardiac events
in patients with chronic systolic heart failure are plasma
levels of: high sensitivity C-reactive protein, fibrinogen,
D-dimers and NT-pro BNP;
• Patients with high plasma levels of hs-CRP and NT-pro
BNP should be selected for more sophisticated prognostic
evaluation to determine whether alternative therapeutic
strategies such as aggressive pharmacological treatment,
cardiac transplantation or LV assist devices are needed.
References
1. Bundkirchen A, Schwinger R. Epidemiology and economic burden of chronic heart failure. Eur Heart J, 2004; 6:
D57-D60.
2. Mitkowski P. Heart failure – an epidemic of XXI century. Choroby serca i naczyń, 2004; 1(1): 43-50.
13
3. McMurray JJ, Pfeffer MA. Heart failure. The Lancet,
2005; 365: 1877-1886.
4. Jackson G, Gibbs CR, Davies MK, Lip GYH. ABC of
heart failure. Patophysiology, 2000; 320: 167-170.
5. Matsumori A. Role of inflammation in heart failure. Int
J Cardiol, 2008; 125: 10-11.
6. Anker SD, van Haeling S. Inflammatory mediators in
chronic heart failure: an overview. Heart, 2004; 90:
464-470.
7. Marucci R et al. Markers of hypercoagulability and inflammation predict mortality in patients with heart failure. J Thromb Haemost, 2006; 4: 1017-1022.
8. The Task Force on Heart Failure of the European Society of Cardiology (ESC) developed in collaboration
with the Heart Failure Association of the ESC (HFA).
ESC Guidelines Desk Reference. Compendium of
abridged ESC guidelines, 2008; Section XV, Heart Failure: 313-338.
9. Anand IS et al. C-reactive protein in heart failure: prognostic value and the effect of valsartan. Circulation,
2005; 112: 1428-1434.
10. Guliz K, Gokhan E, Kilic T, et al. Elevated level of high
sensitivity C-reactive protein is important in determining prognosis in chronic heart failure. Med Sci Monit,
2010; 16(3): 156‑161.
11. Alonso‑Martinez JL, Llorente‑Diez B, Echegaray‑Agara M, et al. C‑reactive protein as a predictor of improvement and readmission in heart failure. Eur J Hear Fail,
2002; 4: 331‑336.
12. El-Menyar A. Cytokines and Myocardial Dysfunction:
State of the Art. J Card Fail, 2008; 14: 61-74.
13. Huang WP, Yin WH, Jen HL, et al. C-reactive protein
levels in chronic congestive heart failure. Acta Cardiol
Sin, 2004; 20: 7-14.
data otrzymania pracy: 15.02.2010 r.
data akceptacji do druku: 21.06.2010 r.
Corresponding author:
Eng. Aleksander Owczarek, Ph.D.
Division of Statistics, Department of Instrumental Analysis
Medical University of Silesia
30 Ostrogórska S.
41-200 Sosnowiec
Mobile: +48 0 501 357 068
tel.: +48 32 364 13 32
e-mail: [email protected]
14
14. Olsson LG, Swedberg K, Cleland J, Spark PA, Komajda
M, Metra M, et al. Prognostic importance of plasma NTpro BNP in chronic heart failure in patients treated with
a beta-blocker: results from the Carvedilol Or Metoprolol European Trial (COMET) trial. Eur J Heart Fail,
2007; 9(8): 795-801.
15. Richard M, Troughton RW. NT-proBNP in heart failure: therapy decisions and monitoring. Eur J Heart Fail,
2004; 6: 351-354.
16. Jourdain P, Jondeau G, Funck F, Gueffet P, Le Helloco
A, Donal E, et al. Plasma brain natriuretic peptide-guided therapy to improve outcome in heart failure. JACC,
2007; 49(16): 1733-1739.
17. Lamblin N, Mouquet F, Hennache B, Joel D, Susen S,
Bauters Ch, et al. High-sensitivity C-reactive protein: potential adjunct for risk stratification in patients with stable
congestive heart failure. Eur Jeart J, 2005; 26: 2245-2250.
18. Alehagen U, Dahlstrom U, Lindahl TL, et al. Elevated
D‑dimer level is an independent risk factor for cardiovascular death in out‑patients with symptoms compatible with
heart failure. Thromb Haemost, 2004; 92: 1250-1258.
19. Kannel WB, D’Agostino RB, Belanger AJ. Update on
fibrinogen as a cardiovascular risk factor. Ann Epidemiol, 1992; 2(4): 457-66.
20. Witte KKA, et al. Fibrinogen synthesis is increased in
cachectic patients with chronic heart failure. Int J Cardiol, 2008; 129(3): 363-367.
21. Ferketich AK, Binkley PF. Heart failure and inflammation: results from the third national health and nutrition
examination survey (NHANES III). Cardiac Failure,
2004; 10(4): 93.
22. Hoffmeister A, et al. Plasma viscosity and fibrinogen in
relation to haemodynamic findings in chronic congestive heart failure. Eur J Heart Fail, 1999; 1: 293-295.
Farm Przegl Nauk, 2010,7, 15-19
Część IV. Proleki aktywowane hipoksją
Prodrugs in cancer therapy.
Part IV. Hypoxia activated prodrugs
Andrzej Stańczak, Marta Szumilak
Zakład Farmacji Szpitalnej Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Streszczenie
Abstract
Większość stosowanych obecnie leków przeciwnowotworowych charakteryzuje wysoka toksyczność systemowa i brak wybiórczości względem tkanki nowotworowej.
Jednym ze sposobów zwiększania skuteczności terapii
i ograniczania jej toksyczności jest projektowanie proleków. Nowoczesne proleki przeciwnowotworowe tzw. Tu‑
mor Activated Prodrugs projektuje się w oparciu o ciągle
rosnącą wiedzę na temat budowy i funkcji tkanki nowotworowej. Szereg jej cech np. hipoksja, obecność specyficznych antygenów, bądź receptorów, czy wadliwy system naczyniowy, stanowi punkt uchwytu umożliwiający
selektywne dostarczenie i aktywację proleku w obrębie
guza. Poniższy artykuł skupia się na prolekach aktywowanych hipoksją, które podlegają bioredukcyjnej aktywacji za pośrednictwem specyficznych enzymów obecnych
w niedotlenionych komórkach nowotworowych. W obrębie tej grupy proleków wyróżnia się: chinony, związki
o strukturze N-tlenku oraz związki nitroaromatyczne.
Most currently used anticancer drugs are characterized
by high systemic toxicity and lack of tumor selectivity.
One way to increase effectiveness of treatment and reduce
its toxicity is prodrug design. Advanced anticancer prodrugs so-called Tumor Activated Prodrugs are designed on
the basis of ever-growing knowledge of the structure and
function of tumor tissue. Several of its features such as:
hypoxia presence of specific antigens or receptors, vascular system failure or can be the targets allowing the selective delivery and activation of prodrugs within the tumor.
This work describes active targeting strategy which is
based on differences in cell surface antigen or receptor expression between normal and tumor tissue. The following
article focuses on hypoxia-activated prodrugs which are
bioreductively activated via particular enzymes present in
hypoxic tumor cells. This group of prodrugs include: quinones, N-oxides and nitroaromatics.
Słowa kluczowe: proleki, leki przeciwnowotworowe,
proleki aktywowane hipoksją, reduktaza NADPH:CYP450
Wprowadzenie
Komórki guzów litych często charakteryzuje znaczne
niedotlenienie. Wynika ono ze źle wykształconego, nieefektywnego systemu naczyniowego, który nie jest w stanie zapewnić komórkom nowotworowym odpowiedniej podaży
tlenu i składników odżywczych. Niedotlenienie guza stanowi istotny problem z punktu widzenia efektywności terapii
i przyszłych rokowań. Stanowi sygnał do ekspresji genów
zaangażowanych w progresję procesu nowotworowego
(m. in. nasilenie procesu angiogenezy), zwiększa częstość
mutacji i ryzyko przerzutów. Niedotlenione komórki guzów
litych są oporne na radioterapię, ponieważ jej efekt cytotoksyczny zależy od obecności tlenu w komórce. Klasyczna
chemioterapia także jest często nieskuteczna. Czynnikami
odpowiedzialnymi za oporność na chemioterapię są m. in.
zbyt duża odległość od naczyń krwionośnych, które dostarczają leki (co uniemożliwia osiągnięcie stężenia terapeutycznego w miejscu działania), obniżone tempo podziałów
komórkowych (wynikające po części z niedostatecznej po-
Key words: prodrugs, anticancer drugs, hypoxia activated
prodrugs, NADPH:CYP450 reductase
daży składników odżywczych), utrata wrażliwości na apoptozę aktywowaną białkiem p53 oraz up-regulacja genów zaangażowanych w powstawanie oporności wielolekowej np.
genów kodujących glikoproteinę P [1-4].
Jednak hipoksja stanowi także unikalna cechę komórek guzów litych, odróżniającą je od większości komórek
zdrowych i może stanowić dogodny punkt uchwytu terapii
celowanej, po raz pierwszy zaproponowanej na początku lat
70-tych przez zespół prof. Sartorell’ego. Większość proleków aktywowanych hipoksją podlega bioredukcyjnej aktywacji za pośrednictwem specyficznych enzymów obecnych
w niedotlenionych komórkach. Uwolnienie aktywnego leku
może nastąpić także pod wpływem niskiego pH, będącego efektem gromadzenia się produktów przemiany materii
w obrębie guza [1-4].
Warunkiem wybiórczego działania proleków na komórki hipoksyczne jest ich wysokie powinowactwo do reduktaz
katalizujących przeniesienie jednego elektronu. Mechanizm
selektywnej aktywacji obejmuje kilka etapów: w pierwszym
(odwracalnym) (rys. 1A) następuje przeniesienie jednego
15
Ryc. 1. Mechanizm selektywnej bioredukcyjnej aktywacji
ków.
elektronu i powstaje produkt przejściowy, który w warunkach tlenowych, panujących w zdrowych komórkach, jest
przekształcany z powrotem do nieaktywnego proleku, zaś
w warunkach niedoboru tlenu następują dalsze etapy jego
redukcji do cytotoksycznego metabolitu (rys. 1B). Jeśli
prolek ma także powinowactwo do reduktaz, takich jak DTdiaforaza (DTD), katalizujących jednoczesne przeniesienie
dwóch elektronów, wówczas jego selektywność wobec komórek hipoksycznych zostaje znacznie upośledzona, bowiem nie jest możliwa reoksydacja produktu przejściowego
w warunkach tlenowych do nieaktywnego proleku [1-5].
Z punktu widzenia budowy chemicznej, w obrębie proleków aktywowanych hipoksją wyróżnia się pochodne chinonu, związki o strukturze N-tlenku, oraz związki nitroaromatyczne.
Chinony
Pierwszym lekiem z tej grupy, stosowanym w terapii
nowotworów, była mitomycyna C (1) (rys. 2). Początkowo
wykorzystywano jej właściwości alkilujące. Dalsze badania
wykazały, że niedotlenienie komórek przyspiesza jej aktywację, która odbywa się pod wpływem reduktazy NADPH/
cytochrom P450 (CPR). Powstający anionorodnik semichinonu posiada zdolność tworzenia wiązań kowalencyjnych
z DNA, co skutkuje działaniem cytotoksycznym wobec komórek nowotworowych. Warto zauważyć, że rodnik semichinonu w warunkach tlenowych ulega reoksydacji do chinonu, co powinno czynić go selektywnym wobec komórek
hipoksycznych. Niestety związek ten ulega również bioredukcyjnej aktywacji przez reduktazy aktywne w warunkach
tlenowych np. DT-diaforazę (DTD), co negatywnie wpływa
na selektywność tego związku wobec komórek hipoksycznych [6, 7].
Dalsze poszukiwania związków selektywnych wobec
komórek hipoksycznych doprowadziły do otrzymania porfiromycyny (2) (rys. 2), etylowanej pochodnej mitomycyny
C, która w badaniach przedklinicznych wykazywała znacznie zwiększoną cytotoksyczność wobec komórek hipoksycznych, wynikającą ze zmniejszonego powinowactwa wobec
DTD, preferencyjnej aktywacji przez reduktazy przenoszące
jeden elektron oraz zwiększonego wychwytu przez komórki
hipoksyczne. Badania kliniczne mające na celu porównanie
aktywności porfiromycyny i mitomycyny C, w połączeniu
ze standardową radioterapią, nie wykazały korzyści ze stosowania porfiomycyny, co spowodowało zaniechanie dalszych
badań nad jej wykorzystaniem w terapii nowotworów [6].
Innym przedstawicielem tej grupy związków jest apazi-
16
chinon (EO9) (3) (rys. 2), pochodna indolochinonu,
aktywowana w warunkach hipoksji pod wpływem
CPR. Związek ten jest także substratem dla DTD,
co może mieć negatywny wpływ na selektywność
EO9. Mechanizm działania apazichinonu polega
na uszkadzaniu struktury DNA przez powstający
w wyniku redukcji rodnik EO9. Badania kliniczne
z udziałem tego związku wykazały jego niską toksyczność wobec komórek szpiku kostnego, krótki
prole- okres półtrwania i niską zdolność penetracji w głąb
guza, co niekorzystnie odbiło się na jego aktywności
przeciwnowotworowej. Ze względu na niekorzystny
profil farmakokinetyczny tej substancji, efekt terapeutyczny
został osiągnięty dopiero w chwili jego bezpośredniego podania do komórek nowotworowych [6-9].
Bioredukcyjne właściwości chinonów zostały także użyte w konstruowaniu cząsteczek uwalniających, w wyniku redukcji, związki alkilujące. Przykładem może być tutaj prolek (4) (rys. 2), który w wyniku laktonizacji zredukowanej
formy hydrochinonu uwalnia cząsteczkę melfalanu [3].
Związki o strukturze N-tlenku
Jednym z przedstawicieli tej grupy związków jest antrachinon AQ4N (banoksantron) (5) (rys. 3), zawierający
dwa alifatyczne ugrupowania N-tlenkowe. Związek ten jest
w warunkach hipoksji redukowany do metabolitu AQ4, analogu mitoksantronu, o wysokim powinowactwie do DNA
i zdolność inhibicji aktywności topoizomerazy II. Związek
ulega bioaktywacji głównie pod wpływem enzymów cytochromu P450 m. in. CYP1A1, CYP2B6 i CYP3A4 [3, 6,
11, 10].
Banoksantron badany in vivo, jako pojedynczy lek nie
wywierał znaczącego efektu przeciwnowotworowego. Wywołanie w komórkach efektu hipoksji znacznie nasiliło jego
aktywność cytotoksyczną [11]. Zastosowanie terapii łączonej
z naświetlaniem lub innymi chemioterapeutykami, takimi
jak: cyklofosfamid, cisplatyna, czy tiotepa także powodowało znaczną inhibicję wzrostu komórek nowotworowych [6,
Ryc. 2. Pochodne chinonu jako proleki.
Ryc. 3. Proleki o strukturze N-tlenku.
7, 11, 12]. Badania kliniczne wykazały niską toksyczność
systemową tego związku (wynikającą z braku aktywności
wobec komórek normotlenowych) oraz korzystne właściwości farmakokinetyczne [13]. Cenną cechą tego proleku
okazała się zdolność przenikania przez barierę krew-mózg,
co pozwala wykorzystać ten związek w terapii celowanej
nowotworów mózgu [6, 7].
Przykładem N-tlenku heteroaromatycznego jest tirapazamina (6) (rys. 3). Od lat 80-tych stanowi związek wiodący w grupie proleków aktywowanych hipoksją. Wykazuje
wysoką selektywność wobec komórek o niskim stężeniu
tlenu. W pierwszej fazie aktywacji ulega jednoelektrodowej
redukcji pod wpływem CPR do rodnika tirapazaminy, który
w warunkach tlenowych ulega reoksydacji do nietoksycznej
pierwotnej formy proleku, zaś w warunkach niedoboru tlenu ulega dalszym przemianom, w wyniku których powstają
rodniki uszkadzające DNA. TPZ ulega aktywacji w warunkach znacznie słabszego niedotlenienia, co czyni ją aktywną
cytotoksycznie wobec komórek, w których poziom hipoksji jest niewystarczający do bioaktywacji innych związków
bioredukcyjnych, ale powoduje ich oporność na radioterapię
[6]. Jednakże krótki okres półtrwania rodnika, a także jego
niska zdolność dyfuzji do otaczających komórek hamuje
powstawanie „bystander effect” [2, 6, 7] i czyni komórki
anoksyczne opornymi na TPZ (TPZ nie dociera do nich, ponieważ jest szybciej aktywowana w komórkach o wyższym
stężeniu tlenu) [6, 14].
TPZ uwrażliwia komórki nowotworowe na radioterapię
[15], a także nasila działanie przeciwnowotworowe innych
chemioterapeutyków, takich jak: cisplatyna, melfalan, cyklofosfamid, karmustyna, bleomycyna, doksorubicyna, taksol, karboplatyna, paklitaksel i 5-fluorocytozyna [16-19].
Badania kliniczne z udziałem TPZ są prowadzone od 1994
roku. Najczęściej notowanym działaniem niepożądanym
była neutropenia. Niehematologiczne objawy toksyczności
TPZ obejmowały: nudności, wymioty, biegunkę i wysypkę
[6, 7]. Fazy II i III badań klinicznych obejmowały badanie
cytotoksyczności TPZ wobec szerokiej gamy nowotworów
w skojarzeniu z innymi chemioterapeutykami (cisplatyną,
winorelbiną, 5-fluorocytozyną, gemcytabiną, paklitakselem,
karboplatyną) i radioterapią. Dla przykładu badania III fazy
TPZ w kombinacji z cisplatyną, na pacjentach z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuc, wykazały
znacznie silniejszą odpowiedź komórek nowotworowych na
leczenie i co istotne, zwiększało szansę pacjentów na przeżycie [20].
Tirapazamina jest także wykorzystywana jako prolek
w konstruowaniu strategii GDEPT regulowanej hipoksją.
Koncepcja zakłada dostarczenie, za pośrednictwem wektora adenowirusowego, enzymu kodującego reduktazę P450,
którego ekspresja jest regulowana stężeniem czynnika
wzbudzanego hipoksją HIF-1. (HIF-1 to czynnik transkrypcyjny, który w warunkach hipoksji indukuje transkrypcję
szeregu genów, przez co reguluje różne procesy biologiczne, odpowiedzialne za przystosowanie się komórki do
warunków obniżonego stężenia tlenu [21]) Tym samym w
hipoksycznych komórkach nowotworowych, za pośrednictwem HIF-1, następuje nasilona ekspresja genu kodującego
enzym, co w konsekwencji prowadzi do znacznego wzmożenia bioredukcyjnej aktywacji proleku (TPZ) i powstawania toksycznych metabolitów [22].
Związki nitroaromatyczne
Pochodne 2-nitroimidazolu są grupą związków o selektywnym wobec komórek hipoksycznych mechanizmie działania. W warunkach niedotlenienia ulegają nieodwracalnej, wieloetapowej bioredukcji do aktywnych produktów,
które mają zdolność niszczenia komórek nowotworowych.
Pierwszy etap tego procesu (jednoelektronowa redukcja)
jest w warunkach normotlenowych odwracalny, co czyni tę
grupę leków wybiórczymi wobec komórek hipoksycznych
[6, 7].
Pierwszym związkiem z tej grupy był misonidazol (7)
(rys 4), który miał zdolność uwrażliwiania tkanki nowotworowej na radioterapię. Wykazano, że nasilał on działanie cytotoksyczne promieniowania nawet wówczas, gdy
podawany był po naświetlaniu komórek nowotworowych,
co wykluczało go, jako związek uwrażliwiający na radioterapię i wskazywało na inny mechanizm działania związany z hipoksją komórek nowotworowych. Dalsze badania
w obrębie tej grupy związków doprowadziły do otrzymania RSU1069 (8) (rys. 4), dwufunkcyjnego związku alkilującego aktywowanego przez reduktazę P450R, o właściwościach uwrażliwiających komórki nowotworowe na
radioterapię, który został wycofany z dalszych badań ze
względu na wysoką cytotoksyczność wobec układu pokarmowego [6, 7].
Ciekawą grupą związków o właściwościach bioredukcyjnych są pochodne iperytu dinitrobenzamidu. Przedstawicielem tej grupy związków jest CB1954, 5-(1-azyrydynylo)2,4-dinitrobenzamid (9) (rys. 5), wykorzystywany jako
prolek w strategii VDEPT. Związek ten, w przeciwieństwie
do gancyklowiru i 5-fluorouracylu, jest aktywny wobec
komórek niedzielących się. Pod wpływem nitroreduktazy
Ryc. 4. Wybrane pochodne 2-nitroimidazolu.
17
Ryc. 5. Szlak przemian CB1954.
E. coli (NTR), kodowanej przez gen nfsB, dostarczany do
komórek nowotworowych za pośrednictwem wektora retrowirusowego lub adenowirusowego, ulega redukcji do pochodnej hydroksyloaminy (10) (rys. 5), z której w wyniku
dalszych przemian metabolicznych powstaje dwufunkcyjny czynnik alkilujący 5-(1-azyrydynylo)-4-N-acetoksy-2nitrobenzamid (11) (rys. 5), powodujący letalne uszkodzenia DNA komórek nowotworowych. Istotną cechą metabolitu jest jego zdolność dyfuzji do komórek sąsiadujących,
w których nie nastąpiła ekspresja genu kodującego NTR
(bystander effect). Nie mniej istotny jest fakt, że nie istnieje
ludzki homolog nitroreduktazy bakteryjnej, zaś CB1954 nie
jest dobrym substratem dla ludzkiej DT-diaforazy, co czyni ten związek wybiórczym wobec komórek wykazujących
ekspresję genu kodującego nitroreduktazę [6, 7, 23, 24].
Podsumowanie
Ostatnie lata przyniosły znaczący postęp prac nad prolekami aktywowanymi hipoksją. Nieustannie prowadzi się
badania mające na celu dokładne poznanie procesów zachodzących w niedotlenionej komórce nowotworowej, które
służą zwiększaniu siły i wybiórczości działania już istniejących proleków, a także stanowią podstawę projektowania
nowych o ulepszonym profilu terapeutycznym. Najbardziej
obiecującym związkiem tej grupy wydaje się tirapazamina,
która podlega obecnie intensywnym badaniom klinicznym.
Piśmiennictwo
1. Brown JM, Wilson WR. Exploiting Tumour Hypoxia In
Cancer Treatment. Nature Rev 2004; 4: 4437-4447.
2. Denny WA. The role of hypoxia-activated prodrugs in
cancer therapy. Lancet Oncol 2000; 1: 25-29.
3. Avendano C, Menendez CJ. Medicinal Chemistry of
Anticancer Drugs. Elsevier B.V. Oxford 2008.
4. Melillo G. Targeting hypoxia cell signaling for cancer
therapy. Cancer Met Rev 2007; 26: 341–352.
5. Wang B, Siahaan T, Soltero R. Drug delivery: Principles
and Applications. John Wiley & Sons Inc. Hoboken,
New Jersey 2005.
6. McKeown SR, Cowen R L, Williams KJ. Bioreductive
Drugs: from Concept to Clinic. Clin Oncol 2007; 19:
427-442.
7. Błaszczak-Świątkiewicz K, Mikiciuk-Olasik E. Rola
hipoksji w postępach w diagnostyce i terapii chorób nowotworowych. Wiad Chem 2008; 62: 1066-1089.
18
8. Liia D. i wsp. Stability experiments in human urine with
EO9 (apaziquone): A novel anticancer agent for the intravesical treatment of bladder cancer. J Pharm Biomed
Anal 2007; 43: 285–292.
9. Schellens JHM i wsp. Phase I and Pharmacologic Study
of the Novel Indoloquinone Bioreductive Alkylating Cytotoxic Drug E09. J Natl Cancer Inst 1994; 86: 906-912.
10. Loadman PM i wsp. A Preclinical Pharmacokinetic Study of The Bioreductive Drug AQ4N. Drug Metab Disp
2001; 29: 422–426.
11. Patterson LH, McKeown SR. AQ4N: a new approach
to hypoxia activated cancer chemotherapy. Br J Cancer
2000; 83: 1589–1593.
12. Patterson LH i wsp. Enhancement of chemotherapy and
radiotherapy of murine tumours by AQ4N, a bioreductively activated antitumor agent. Br J Cancer 2000; 82:
1984–1990.
13. Lalani AS i wsp. Selective Tumor Targeting by the Hypoxia Activated Prodrug AQ4N Blocks Tumor Growth
and Metastasis in Preclinical Models of Pancreatic Cancer. Clin Cancer Res 2007; 13:2216-2225.
14. Hicks KO i wsp. Multicellular Resistance to Tirapazamine is Due to Restricted Extravascular Transport:
A Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Study in HT29
Multicellular Layer Cultures. Cancer Res 2003; 63:
5970–5977.
15. Sum BG i wsp. Tirapazamine-induced Cytotoxicity and
DNA Damage in Transplanted Tumors: Relationship to
Tumor Hypoxia. Cancer Res 1997; 57: 2922-2928.
16. Holden SA i wsp. Enhancement of Alkylating Agent
Activity by SR-4233 in the FSaIIC Muraine Fibrosarcoma. J Natl Cancer Inst 1992; 84: 187–193.
17. Dorie MJ, Brown JM. Tumor-specific, schedule-dependent interaction between Tirapazamine (SR 4233) and
Cisplatin. Cancer Res 1993; 53: 4633-4636.
18. Langmuir VK. i wsp. Synergistic Interaction between
Tirapazamine and Cyclophosphamide in Human Breast
Cancer Xenografts Cancer Res 1994; 54: 2845-2847.
19. Emmenegger U. Low-Dose Metronomic Daily Cyclophosphamide and Weekly Tirapazamine: A Well-Tolerated Combination Regimen with Enhanced Efficacy
That Exploits Tumor Hypoxia. Cancer Res 2006; 66,
1664-1674.
20. Talbot D. Tirapazamine Plus Cisplatin Versus Cisplatin
in Advanced Non–Small-Cell Lung Cancer: A Report
of the International CATAPULT I Study Group. J Clin
Oncol 2000; 18: 1351-1359.
21. Mantur M, Wojszel J. Cząsteczki adhezyjne oraz ich
udział w procesie zapalnym i nowotworowym. Pol
Merk Lek 2008; 24: 177-180.
22. Md.Taufiq-Ur-Rahman Tirapazamine and gene-directed
enzyme prodrug therapy of cancer. Indian J Pharmacol
2004; 36: 332.
23. McNeish IA i wsp. Gene directed enzyme prodrug therapy for cancer. Adv Drug Deliv Rev 1997; 26: 173–184.
24. Chung-Faye G. Virus-directed, Enzyme Prodrug Therapy with Nitroimidazole Reductase: A Phase I and Pharmacokinetic Study of its Prodrug, CB1954. Clin Cancer
Res. 2001; 7: 2662-2668.
data otrzymania pracy: 15.02.2010r.
data akceptacji do druku: 9.04.2010r.
Adres do korespondencji:
Andrzej Stańczak
Zakład Farmacji Szpitalnej Wydziału Farmaceutycznego UM w Łodzi,
ul. Muszyńskiego 1, 91-151 Łódź
tel. 0 42 677 92 52
19
Metylacja DNA – główny znacznik epigenetyczny komórki
DNA Methylation – a major epigenetic marker of the cell
Olga Smagacz, Aleksandra Moździerz, Anna Rzepecka-Stojko, Jerzy Stojko,
Małgorzata Juszko-Piekut, Magdalena Wyszyńska, Justyna Kaźmierczak
Zakład Higieny, Bioanalizy i Badania Środowiska
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Streszczenie
Abstract
Procesy epigenetyczne wpływają na ekspresję genów nie
naruszając sekwencji DNA. Do podstawowych modyfikacji epigenetycznych, obok zmian struktury chromatyny,
zaliczana jest metylacja DNA. Metylacja DNA jest procesem przyłączania grup metylowych do atomu węgla
cytozyny, w obrębie dinukleotydu CpG. Produktem tej
reakcji jest 5-metylocytozyna, nazywana czasem piątym
podstawowym składnikiem DNA. W ustalaniu wzoru metylacji udział biorą enzymy z grupy metylotransferaz. W
warunkach fizjologicznych 70-80% dinukleotydów CpG
zawiera grupę metylową. Istnieją również regiony, które
na wszystkich etapach rozwoju i we wszystkich typach
tkanek są chronione przed metylacją - wyspy CpG. Konsekwencją zmian informacji epigenetycznej są zaburzenia
w transkrypcji i syntezie białka, będące czynnikami mającymi udział w patogenezie wielu chorób. Defekty metylacji
DNA są zmianami odwracalnymi. Można zatem poprzez
celowaną aktywację bądź inhibicję regulować poziom ekspresji genów. Zmapowanie miejsc metylacji DNA i poznanie mechanizmów współtowarzyszących temu procesowi
daje nadzieję na znalezienie technik umożliwiających leczenie chorób nowotworowych, schorzeń o podłożu alergicznym, immunologicznym czy - jak wskazują najnowsze
badania - być może także tych, o podłożu genetycznym.
Epigenetic processes influence gene expression without altering DNA sequence. DNA methylation, together
with chromatin remodelling, forms the basis for epigenetic modification. DNA methylation denotes addition of
methyl groups to the cytosine carbon atom within CpG
dinucleotide. It results in formation of 5-Methylcytosine,
also referred to as 5th basic DNA element. Enzymes of
methyltransferase group contribute to methylation patterns set-up. In physiological environment 70-80% of
CpG dinucleotide have methyl groups. There are also regions, so called CpG Islands, which are protected from
methylation in all types of tissues. Alterations in epigenetic information result in abnormalities in transcription
and protein synthesis, which contributes to pathogenesis
in a variety of diseases.
DNA methylation defects are reversible changes. Therefore, by intentional activation or inhibition, it is possible
to regulate gene expression. Mapping of DNA methylation regions and identifying the mechanism accompanying this process raise hopes for finding new treatment
techniques for cancerous diseases, allergy and immunityrelated diseases and possibly, as recent studies has shown,
for genetic disorders.
Słowa kluczowe: epigenetyka,
5-metylocytozyna, wyspy CpG
metylacja
DNA,
Metylacja DNA obok przebudowy struktury chromatyny, indukowanej zmianami w obrębie białek histonowych,
zaliczana jest do podstawowych mechanizmów epigenetycznych. Owe mechanizmy umożliwiają dziedziczenie, mimo
iż nie towarzyszą im zmiany w układzie nukleotydów DNA.
W odróżnieniu od zmian o podłożu genetycznym, epigeneza charakteryzuje się odwracalnością [1]. Obecnie trwają badania, mające na celu wykorzystanie tej właściwości,
a tym samym dające nadzieje na odkrycie nowych metod terapeutycznych. Prawdopodobnie miałyby one zastosowanie
w leczeniu chorób alergicznych, immunologicznych, metabolicznych, a przede wszystkim chorób nowotworowych
[1-3].
Pierwszym zjawiskiem o podłożu epigenetycznym, uka-
20
Key words: epigenetics, DNA methylation, 5-methylcytosine, CpG islands
zującym złożoność tego procesu, było odkrycie H. J. Műllera z 1930 roku. Obiektem badań była linia Drosophila,
której oczy zabarwione były w sposób mozaikowy. Odpowiedzialny za tę cechę, okazał się gen, który co pewien czas
ulegał spontanicznej inaktywacji, ale co istotne, bez zmian
w sekwencji DNA. Ponadto, jeśli ów proces raz zaistniał,
gen pigmentu pozostał nieaktywny we wszystkich komórkach potomnych [4].
Proces metylacji DNA
Jedną z cech wyróżniających eukariotyczne DNA, jest
stosunkowo wysoka zawartość 5-metylocytozyny, produktu
reakcji metylacji kwasu deoksyrybonukleinowego.
5-metylocytozyna jest nazywana piątym składnikiem
DNA, obok adeniny, guaniny, cytozyny oraz tyminy [5].
Grupa metylowa, składająca się z węgla, trzech atomów
wodoru oraz jednego elektronu, ma silne powinowactwo do
zasady pirymidynowej DNA – cytozyny. Specyficzne enzymy, należące do metylotransferaz katalizują reakcję przyłączenia grupy metylowej do węgla w pozycji 5 pierścienia
cytozyny w obrębie dinukleotydu CpG. Enzymami tymi są:
DNMT1, DNMT3a oraz DNMT3b (DNMT- DNA MethylTransferase) [3, 6-8]. Dwa ostatnie ustalają wzór metylacji
w czasie embriogenezy [3]. Donorem grup metylowych
w powyższej reakcji jest S-adenozylometionina (SAM) [7].
W ustalaniu wzoru metylacji, biorą udział również demetylazy, enzymy odłączające potrzebne grupy ze składników
pokarmowych w nie bogatych [3, 7, 9].
Zmetylowana cytozyna tworząca regularne wiązania wodorowe typu Watsona-Cricka, rozproszona jest niemal w całym genomie [1, 3]. Istnieją jednak sekwencje DNA, bogate
w dinukleotydy CpG, które nie ulegają metylacji. Miejsca
takie, zwane wyspami CpG, zlokalizowane są w regionach
promotorowych genów mających znaczenie dla podstawowych funkcji komórki. W genomie człowieka stwierdzono
około 29000 wysp CpG (1-2% całego genomu) [1, 3, 7, 10,
11]. Prawidłowe komórki posiadają mechanizmy chroniące
wyspy przed metylacją. Działają one na wszystkich etapach
rozwoju i we wszystkich typach komórek. Jeżeli mechanizmy takie ulegną zaburzeniu, wówczas następują istotne
zmiany w profilu metylacji DNA.
Zmiany stopnia metylacji DNA
Czynniki mutagenne, a także stres, głównie oksydacyjny
mogą doprowadzić do dramatycznych w skutkach transformacji, tj. zwiększenia bądź zmniejszenia stopnia metylacji
[2, 5, 11]. Pierwsza zmiana, czyli hipermetylacja, dotyczy
zazwyczaj metylacji wysp CpG, które w zdrowym genomie
nie ulegają temu procesowi. Konsekwencją jest „wyciszenie” funkcji genów [1, 3, 7]. W przypadku nowotworów
zjawisku temu ulegają geny supresorowe, czyli geny, których prawidłowe produkty ograniczają tempo podziałów komórkowych [1, 3]. Ponadto w wyniku nadmiernej metylacji
wysp CpG, dochodzić może do wystąpienia mutacji punktowych CG do TG. 5-metylocytozyna wykazuje bowiem
większą skłonność do spontanicznej deaminacji w tyminę, aniżeli cytozyna w formie niezmetylowanej [3, 5, 11].
Z kolei w przypadku hipometylacji obserwujemy globalne
obniżenie metylacji regionów normalnie podlegających tej
reakcji. Ten rodzaj zmian epigenetycznych skojarzony bywa
z demetylacją regionów promotorowych onkogenów [1, 3].
Wyniki przeprowadzonych dotychczas badań wykazały korelację między stopniem metylacji a występowaniem nowotworów mózgu. Ilość 5-metylocytozyny jest odwrotnie proporcjonalna do stopnia złośliwości guzów mózgu [5].
Rola metylacji DNA
Zmiany o podłożu epigenetycznym zachodzą już u organizmów prokariotycznych, przy czym dotyczą trzech typów
metylacji. Produktami tego procesu, obok 5-metylocytozyny
są N-metylocytozyna oraz N-metyloadenina [12]. Na pod-
stawie identyfikacji miejsc przyłączania grup metylowych
w genomie bakterii, stwierdzono, że metylacja uczestniczy
w fundamentalnych procesach komórkowych. Bierze udział
w kierowaniu cyklem komórkowym oraz replikacji DNA,
reguluje poziom ekspresji genów, wreszcie jest czynnikiem
umożliwiającym odróżnienie własnego DNA od obcego
[12, 13].
Szacuje się, że u ssaków około 5% wszystkich cytozyn
jest trwale zmetylowanych. U roślin poziom tego procesu
jest znacznie wyższy i sięga nawet 30%. Z kolei u bezkręgowców metylacja obejmuje znacznie mniejszą część chromatyny, a u niektórych z nich jak u Drosophila melanoga‑
ster nie zachodzi w ogóle [6, 13].
Zdolność wyciszania bądź pobudzania poszczególnych
genów, jest szczególnie istotna w okresie rozwoju embrionalnego organizmu. A zaznaczyć należy, że we wczesnych
fazach rozwojowych, genom przechodzi zmiany profilu metylacji. W zygocie niemal wszystkie niegenetyczne zapisy są
usuwane. Dopiero w piątym miesiącu płód generuje nowy
kod epigenetyczny, w tym już ostateczny wzór metylacji
DNA [4, 7, 8]. Jednakże w trakcie odtwarzania epigenomu
zdarzają się błędy. Dowodem na to może być brak współwystępowania chorób u bliźniąt jednojajowych. Mimo iż bliźnięta mają identyczną sekwencję DNA, to często obserwuje
się ujawnienie choroby o podłożu genetycznym (np. choroba afektywna dwubiegunowa, schizofrenia) tylko u jednego z nich. Do zmian w zapisie epigenomu dochodzi także
w okresie rozwoju i starzenia się organizmu [4, 8].
Dowodem przemawiającym o wadze procesów epigenetycznych są także wyniki badań, przeprowadzonych na embrionalnych komórkach macierzystych, którym wyłączono
jeden z enzymów odpowiedzialnych za przyłączanie grupy
metylowej do cytozyny. Spowodowało to uaktywnienie się
wielu transpozonów, doprowadzając tym samym do dziesięciokrotnego wzrostu mutacji w badanych komórkach [8, 9].
Pożywienie a zmiany epigenetyczne
Tę silną zależność potwierdziły badania przeprowadzone
na myszach agouti (o brązowozłotym umaszczeniu). Jednej
z grup ciężarnych myszy podawano pokarm standardowy –
około 60% ich potomstwa miało jasną sierść. Druga grupa
karmiona była paszą bogatą w kobalaminę, kwas foliowy
i inne źródła grup metylowych, co spowodowało nasilenie
procesu metylacji DNA. To wystarczyło, aby młode myszy
miały ciemnobrązowe futro i nie ujawniały predyspozycji do
otyłości, cukrzycy i raka. Zatem kobalamina, kwas foliowy,
cholina czy betaina poprzez dostarczenie grup metylowych,
zarówno do syntezy DNA, jak i zachowania już ustalonego
wzoru metylacji, pełnią fundamentalną rolę w utrzymaniu
stabilności tej struktury. Brak w diecie kwasu foliowego powoduje akumulację uracylu, który wbudowując się w miejsce tyminy, zaburza prawidłową sekwencje i w konsekwencji prowadzić może nawet do złamania chromosomu. Wraz
z kobalaminą odpowiada on również za prawidłową syntezę
tyminy, a także przemianę homocysteiny w metioninę. Skutkiem nagromadzenia się homocysteiny jest wzrost ryzyka
wystąpienia chorób naczyniowych i nieprawidłowości rozwojowych oraz neurologicznych [2, 9]. Wykazano również
ciekawą zależność pomiędzy produktami zawierającymi
21
znaczne ilości flawonoidów (zielona herbata, owoce granatu), a ich farmakologicznym działaniem w przypadku chorób cywilizacyjnych. Ma to związek z antyoksydacyjnym
działaniem. Niszcząc reaktywne formy tlenu, nie dopuszczają do zmian we wzorze epigenetycznym [9].
Przyszłość modyfikacji epigenomu
Wiele czynników zewnętrznych, jak środowisko, rodzaj
pokarmu, styl życia, wpływa na zmiany stopnia metylacji
DNA, co w konsekwencji prowadzi do rozwoju licznych
chorób. Już sama sytuacja głodu powodować może hipermetylację. I przeciwnie, u otyłych pacjentów zachodzi generalna hipometylacja DNA. Kolejnym przykładem jest zaobserwowany spadek metylacji u chorych na arteriosklerozę
czy insulino-oporną cukrzycę typu II [2].
Wzór metylacji jest znakomitym markerem do
kompleksowej diagnostyki wielu chorób. Za pomocą
5-metylocytozyny możemy aktywować bądź inhibować
ekspresję odpowiednich genów [1-3]. Metylowany DNA
budzi również spore zainteresowanie z diagnostycznego
punktu widzenia – jest molekułą stabilną i łatwo wykrywaną
zarówno w osoczu, jak i plwocinie [2, 3]. Badania dowiodły,
że poziom tego epigenetycznego znacznika jest bardzo podobny w DNA tkanki zmienionej jak i krwi, dzięki czemu
monitorowanie procesów chorobowych stanie się znacznie
szybsze i łatwiejsze [11].
Epigenetyczna „terapia” skuteczna jest nie tylko u rozwijających się organizmów, ale i w późniejszych etapach
życia. Przyczyną rozwoju pewnych typów raka jelita grubego czy płuc, nie są jak przypuszczano zmutowane geny
(niektóre komórki nowotworowe mają przecież prawidłowy
kod genetyczny), ale zaburzenia stopnia metylacji. Odkrycie to jest więc tym cenniejsze, że metylacja w przeciwieństwie do mutacji jest procesem odwracalnym [1, 3]. Pewne
nadzieje wiąże się z wykorzystaniem substancji mających
zdolność znoszenia nieprawidłowej metylacji. Działanie
takie wykazuje niestosowana w Polsce - decytabina, a także prokaina - powszechnie stosowana w anestezjologii.
Decytabina jest analogiem cytozyny, która pomimo wysodata otrzymania pracy: 04.03.2010 r.
Aleksandra Moździerz
Zakład Higieny, Bioanalizy i Badania Środowiska SUM
41-200 Sosnowiec
ul. Kasztanowa 3a
tel/fax: 32 269 98 25
[email protected]
22
kiej toksyczności, u niektórych pacjentów z zaawansowaną białaczką, powoduje śmierć 99,9% komórek rakowych
[6, 7, 14].
Piśmiennictwo
1. Jabłońska J, Jesionek-Kupnicka D. Zmiany epigenetyczne w nowotworach. Onkologia Polska 2004; 7, 4:
181-185.
2. Szpecht-Potocka A. Zdrowy i chory „gorset” DNA,
czyli medyczne aspekty epigenetyki. Kosmos - problemy nauk biologicznych 2004; 53: 281-293.
3. Rahden-Staroń I, Grosicka E. Epigenetyczne mechanizmy kancerogenezy. Medycyna Dydaktyka Wychowanie 2006; 38: 20-26.
4. Wierzbicki A. Dziedziczenie epigenetyczne. Kosmos problemy nauk biologicznych 2004; 3-4: 271-280.
5. Barciszewska A i wsp. Wpływ przechowywania tkanek
nowotworowych na zawartość 5-metylocytozyny w
DNA guzów mózgu. Neuroskop 2006; 8: 160-162.
6. Kieć-Wilk B. Rola metylacji DNA w etiopatogenezie chorób
układu krążenia. Kardiologia Polska 2010; 68: 202-207.
7. Issa J. Epidemiology and Molecular Genetics. Leukemia Conferences, October 30-31, 2000.
8. Sanz L i wsp. Genome – wide DNA demethylation in
mammals. Genome Biology 2010; 11: 110.
9. Felsenfeld G, Groudine M. Controlling the Double Helix. Nature 2003; 421: 448-453.
10. Issa J. Epigenetic Variation and Human Disease. J Nutr
2002; 132(8): 2388-2392.
11. Barciszewska A i wsp. Analiza całkowitej zawartości
5-metylocytozyny w DNA z tkanek i krwi pacjentów
pacjentów guzami mózgu. Neuroskop 2005; 7: 39-43.
12. Bart A i wsp. Direct detection of methylation in genomic DNA. Nucl Ac Res 2005; 33: 1-6.
13. Jones P, Takai D. The role of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science 2001; 293: 1068-1070.
14. Gil L, Komarnicki M. Nowe metody farmakoterapii
ostrej białaczki szpikowej. Współczesna Onkologia
2007; 11(4): 181-185.
Iceland Moss – active compounds, biological properties
Elżbieta Studzińska-Sroka, Wiesława Bylka
Katedra i Zakład Farmakognozji Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu
Streszczenie
Abstract
Cetraria islandica, porost rozpowszechniony na obszarach
północnej Europy i Azji, był od dawna wykorzystywany
przez zamieszkującą te tereny ludność. Doceniano nie tylko walory lecznicze zbieranej plechy, lecz także jej wartość jako pożywienia. Poniższa praca jest przeglądem wiadomości na temat porostu islandzkiego. Główne związki
wyizolowane z tarczownicy islandzkiej to: polisacharydy
(lichenina i izolichenina), depsydony: kwas fumaroprotocetrarowy, cetrarowy oraz α-metyleno-γ-lakton: kwas
protolichesterynowy. Badania prowadzone w warunkach
in vitro i in vivo wykazały: immunomodulujące, przeciwzapalne, przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, antyproliferacyjne, cytotoksyczne, antyoksydacyjne właściwości
związków obecnych w C. islandica. Stopień toksyczności
surowca oceniany w badaniach na zwierzętach, zależał od
procentowego udziału plechy porostu w ich diecie oraz
od jej przygotowania. W artykule przedstawiono informacje na temat preparatów z surowca wykorzystywanych
w lecznictwie, bezpieczeństwa ich stosowania oraz możliwych działań niepożądanych. Przebadane w testach klinicznych preparaty z porostu islandzkiego były dobrze
tolerowane przez stosujących je pacjentów.
Cetraria islandica, lichen that occurs especially in area
of Nothern Europe and Asia was used by local inhabitants from a very long time. Not only medical properties
of thallus but also its nutritive values were appreciated.
This work is a review of present-day knowledge concerning Iceland moss. The main compounds isolated from
C. islandica are: polysaccharides (lichenin and isolichenin), depsidones: fumaroprotocetraric acid, cetraric
acid and α-methylene-γ-lactone: protolichesterinic acid.
Biological activity of compounds present in C. islandica
was confirmed. Studies carried out in vitro and in vivo
showed immunomodulating, antiinflammatory, antibacterial, antiviral, antiproliferative, cytotoxic and antioxidative properties of lichens active compounds. Iceland moss
toxicity was tested on animals and depended on preparation
and percentage content of thallus in the diet. In the paper
information concerning commercial products containing lichen, safety od their usage and possible adverse effects are
presented. Commercial products containing C. islandica
examined in clinical tests were well tolerated by patients.
Słowa kluczowe: Cetraria islandica, porost islandzki, badania, związki, aktywność
Wstęp
Tarczownica islandzka (Cetraria islandica (L.) Ach.)
to porost z rodzaju płucnic (Cetraria) [1]. Występuje na
półkuli północnej (Azja, Europa, Ameryka), aż po rejony
arktyczne. W Polsce C. islandica rośnie na niżu, w suchych
lasach sosnowych, na skałach w górach oraz na innych ubogich siedliskach. Jest to gatunek objęty w Polsce częściową
ochroną prawną [1-4].
Opis gatunku
Cetraria islandica jest porostem naziemnym o krzaczkowatej, silnie rozgałęzionej plesze, której orzęsione brzegi
są podwinięte do wewnątrz. Porost osiąga wysokość do 15
cm. Górna powierzchnia plechy ma zielone lub brunatne
zabarwienie, dolna jest białawo-brązowawa. Wygląd C. is‑
landica może nieznacznie ulegać zmianie, w zależności od
panującej wilgotności. Sucha plecha jest sztywna i krucha,
Key words: Cetraria islandica, lichen islandicus, study,
compounds, activity
zwilżona staje się giętka i elastyczna [2, 4]. Surowiec leczniczy (porost islandzki) stanowią całe lub pocięte plechy
C. islandica [4, 5].
Dawniej…
Porost islandzki, znany głównie w Skandynawii i Rosji,
znajdował zastosowanie jako pokarm (zwłaszcza w okresach
głodu) oraz jako surowiec leczniczy. W celach spożywczych
plechę C. islandica wykorzystywano do robienia mąki,
z której pieczono chleb. Porost używano także do wyrobu
słodyczy. Podczas II wojny światowej Rosjanie stosowali
płucnicę jako surowiec do przygotowywania gęstego syropu przypominającego melasę. Aby uzyskać surowiec pozbawiony gorzkiego smaku, związanego z obecnością kwasów
porostowych, rozdrobnioną plechę C. islandica moczono
przez 24 godziny w roztworze o odczynie alkalicznym [6].
W medycynie ludowej C. islandica stosowana była:
w leczeniu nieżytu górnych dróg oddechowych, jako środek
23
wzmacniający po przebytych chorobach, a także w dolegliwościach żołądkowo-jelitowych. Przygotowywane z płucnicy wywary i napary wykorzystywano w: przeziębieniu,
krztuścu, astmie, cukrzycy oraz zapaleniu nerek [6]. Porost
islandzki był prawdopodobnie podawany również Fryderykowi Chopinowi jako lek przeciwgruźliczy [2].
Porosty, w tym także C. islandica, wytwarzają związki
o strukturze chemicznej często niespotykanej w świecie roślin wyższych [7]. Substancje te, to tzw. kwasy porostowe,
z których w plesze płucnicy występują m.in. depsydony:
kwas fumaroprotocetrarowy (2,6-11,5%), kwas protocetrarowy (0,2-0,3%) oraz śladowe ilości kwasu cetrarowego.
Związkiem alifatycznym o strukturze α-metyleno-γ-laktonu
jest kwas (+)-protolichesterynowy (0,1-0,5%) [8, 9]. Niektóre źródła donoszą o występowaniu w surowcu małych
ilości kwasu usninowego [2, 10, 11].
Surowiec jest bogaty w polisacharydy. Związki te, należące do metabolitów pierwotnych, mogą występować
w płucnicy nawet w ilościach 25-50% [8]. Są to przede
wszystkim lichenina i izolichenina, które w postaci mieszaniny zostały otrzymane z plech C. islandica już na początku XIX wieku [12]. Lichenina (lichenan), jest nierozpuszczalnym, tworzącym w zimnej wodzie żel, linearnym
β-D-glukanem. Jej strukturę, stanowią cząsteczki glukozy połączone wiązaniami (1→3) i (1→4). Rozpuszczalna
w zimnej wodzie jest izolichenina (izolichenan) o budowie
(1→3)-(1→4)-α-D-glukanu. Inne polisacharydy tarczownicy
to: α-glukan o nazwie Ci-3 oraz złożone z cząsteczek galaktozy i mannozy galaktomannany, m.in. Ki-M-7 [8, 12-14].
W C. islandica obecne są także: kwasy tłuszczowe (linolowy, oleinowy, linolenowy), karotenoidy, związki z grupy
naftochinonów (naftazaryna) oraz związki mineralne, takie
jak: sole jodu i boru [2, 8, 11, 15].
(0,125 µg/ml) i erytromycyny (0,25 µg/ml), ale zbliżone do
wykazującego działanie stężenia metronidazolu (16 µg/ml)
[20]. Związek posiadał też aktywność: antyproliferacyjną
oraz cytotoksyczną, które udowodniono w badaniach prowadzonych na ludzkich liniach komórkowych (linie komórkowe raka piersi – T-47D, ZR-75-1 oraz komórki białaczki
– K-562). Działanie kwasu protolichesterynowego okazało się zależne od jego stężenia w stosowanym roztworze.
Dawka zmniejszająca syntezę DNA komórkowego o 50%
(ED50) wynosiła od 1,1 do 24,6 µg/ml, natomiast stężenie
wyższe od 20 µg/ml wywoływało śmierć wszystkich trzech
typów komórek. W innym eksperymencie badany związek
hamował proliferację stymulowanych mitogenem limfocytów krwi obwodowej przy ED50=8,4 µg/ml. Kwas protolichesterynowy nie wpływał jednak na syntezę DNA, proliferację oraz przeżycie normalnych fibroblastów skóry, nawet
w dawkach wyższych od 20 µg/ml [13, 21].
Innym zasługującym na uwagę metabolitem C. islan‑
dica jest naftazaryna. W badaniach in vitro substancja ta
wykazywała aktywność cytotoksyczną wobec ludzkich
komórek nowotworu naskórkowego. Okazało się również,
że omawiany naftochinon hamował rozwój komórek keratynocytów ludzkich, których nadmierna proliferacja jest
jedną z przyczyn przewlekłej i trudnej w leczeniu łuszczycy [22, 23].
Gülçin i wsp. badał właściwości antyoksydacyjne wodnego wyciągu z tarczownicy islandzkiej. Do eksperymentu
użyto próbki zawierające 50, 100, 250, 500 µg przygotowanego ekstraktu. We wszystkich badanych stężeniach wyciąg wykazywał działanie przeciwutleniające, silniejsze niż
500 µg zastosowanego jako wzorzec α-tokoferolu. Ekstrakt wykazywał też wyższą niż BHT i kwercetyna zdolność
zmiatania anionu ponadtlenkowego, silniejsze od BHT właściwości zmiatania wolnych rodników, a także większe właściwości redukujące rodnik DPPH● w porównaniu z kwercetyną i BHT stosowanymi jako wzorce [24].
Badania in vitro
Badania in vivo
Polisacharydy C. islandica wykazują działanie immunomodulujące. Wpływ na układ odpornościowy miały przede
wszystkim: α-glukan Ci-3, oraz galaktomannan Ki-M-7.
Związki te zwiększały zdolność fagocytozy stosowanych
w eksperymencie granulocytów [16, 17]. Polisacharyd Ci-3
posiadał ponadto właściwości przeciwzapalne. Aktywność
ta miała związek z układem dopełniacza, który ma udział
w przebiegu procesu zapalnego [8, 17].
Przeciwzapalne właściwości wykazywał także obecny
w surowcu kwas (+)-protolichesterynowy (α-metyleno-γlakton). Mechanizm działania polegał na inhibicji mediatorów reakcji zapalnej: 5-lipooksygenazy w leukocytach
świńskich (IC50 = 20 µM) i leukotrienów B4 w polimorfojądrowych leukocytach bydlęcych (IC50 = 9 µM) [18]. Kwas
(+)-protolichesterynowy działał przeciwwirusowo, hamując
odwrotną transkryptazę HIV-1 [19]. Przeciwdrobnoustrojowe właściwości α-metyleno-γ-laktonu potwierdzono wobec
powodującej wrzody żołądka i dwunastnicy bakterii Helico‑
bacter pylori. Określone w badaniach minimalne stężenie
hamujące MIC90 (32 µg/ml) było co prawda wyższe od stężeń stosowanych dla porównania antybiotyków: ampicyliny
Aktywność biologiczna C. islandica została także udowodniona w badaniach in vivo. W doświadczeniu przeprowadzonym na myszach, przygotowywane wodne wyciągi
z porostu islandzkiego, a także wyizolowany z C. islandica
galaktomannan Ki-M-7, posiadały właściwości immunomodulujące. Wynikały one z indukującego wpływu polisacharydów na zdolność fagocytarną mysich makrofagów [16,
25].
Ciekawe są badania japońskich naukowców, którzy znając chińską tradycję stosowania wyciągów z porostów dla
utrzymania sprawnego umysłu u osób starszych, postanowili zbadać działanie związków porostowych u pacjentów
z amnezją starczą [13]. Smirga i wsp. stwierdził, że izolichenina podawana doustnie myszom i szczurom, może wywierać korzystny efekt na zdolności poznawcze gryzoni. Izolichenina podana dożylnie szczurom w dawce 1 mg/kg m.c.
miała istotny wpływ na zwiększenie, tzw. krótkotrwałej potencjalizacji hipokampialnej plastyczności synaptycznej, co
może mieć wpływ na wzrost zdolności przyswajania wiedzy
i zapamiętywania. Równocześnie stwierdzono brak wpływu
ekstraktów na zdrowe zwierzęta [13, 26].
Skład chemiczny Cetraria islandica
24
Badania kliniczne
Kumulowanie metali toksycznych
Badania z podwójną ślepą próbą obejmowały 63 ochotników po przebytej operacji nosa. Osoby te oddychały przez
usta, co powodowało stany zapalne i suchość śluzówki jamy
ustnej. Trzem grupom pacjentów podawano pastylki z różną ilością porostu islandzkiego (w grupach: 1, 2 i 3 jedna
pastylka zawierała odpowiednio: 0,048 g, 0,3 g, 0,5 g surowca). Wszyscy ochotnicy przyjmowali każdego dnia 10
pastylek. Leczenie rozpoczęto dzień po przeprowadzonym
zabiegu chirurgicznym i kontynuowano przez 5 dni. Skuteczność terapii oceniono w skali od 0-3, biorąc pod uwagę
takie kryteria jak: suchość śluzówki i stan zapalny jamy
ustnej, powiększenie węzłów chłonnych, obecność nalotu na języku, chrypkę, ból gardła. Wymienione objawy
ustąpiły u wszystkich osób, niezależnie od przynależności do monitorowanych grup. Otrzymane wyniki świadczą
o skuteczności już najniższej stosowanej dawki (0,048 g).
U pacjentów nie zaobserwowano działań niepożądanych,
co wskazuje na dobrą tolerancję przyjmowanych preparatów [8].
W innych badaniach grupę 100 pacjentów pomiędzy
7 a 85 rokiem życia z objawami: zapalenia gardła, krtani,
ostrymi lub przewlekłymi dolegliwościami ze strony oskrzeli, leczono pastylkami zawierającymi po 160 mg wodnego
wyciągu z porostu islandzkiego. Uczestniczącym w badaniach ochotnikom podawano 1-2 tabletki co 2-3 godziny
w okresie od 4 do 21 dni. Poprawę odnotowano u 86 ochotników biorących udział w eksperymencie [8].
Wykazano, że porosty mogą kumulować w swych plechach pochodzące ze środowiska metale ciężkie oraz pierwiastki promieniotwórcze. Badania prowadzone po katastrofie w Czarnobylu w 1986 roku, oceniające zawartość
promieniotwórczego izotopu 137Cs w plechach porostów
z terenów objętych skażeniem, wykazały znaczny wzrost
jego stężenia. Oceniana w Bq/kg suchej masy surowca ilość
137
Cs wynosiła w 1983 roku 51-199 Bq/kg, natomiast w roku
1990, aż 479-39 300 Bq/kg. Dopuszczalna przez normy UE
zawartość izotopu 137Cs w powietrzu i produktach żywnościowych to maksymalnie 600 Bq/kg (Bq-jednostka radioaktywności w układzie SI; 1 Bq = 1 rozpad na sekundę) [27].
Badania toksyczności
W doświadczeniach na myszach badano wpływ porostu islandzkiego na przeżywalność poddanych testom
gryzoni. Okazało się, że duże znaczenie ma sposób przygotowania surowca przed wprowadzeniem go do paszy
zwierząt. W przypadku, gdy plecha C. islandica stanowiła 50% dziennej diety i podawana była bez uprzednich
zabiegów mających na celu zmniejszenie zawartości
kwasów porostowych, myszy umierały po 4-5 dniach.
Znacznie mniej toksyczny był surowiec o niższej ilości
związków gorzkich. Badane gryzonie karmiono plechą
porostu islandzkiego dopiero po zamoczeniu jej w wodzie z popiołem drzewnym i procesie gotowania (popiół
drzewny z uwagi na zawartość związków potasu i wapnia
pozwalał osiągnąć odczyn zasadowy roztworu, co miało
wpływ na obniżenie zawartości kwasów porostowych).
Śmierć zwierząt następowała po 20-22 dniach. Okazało
się, że po zmniejszeniu udziału plechy w diecie gryzoni
do 25% obserwowano ich mniejszą śmiertelność. W tym
przypadku, plechę przed podaniem zwierzętom, gotowano z popiołem przez 10 minut, a następnie karmiono nią
przez 6 tygodni laboratoryjne myszy oraz przez 3 miesiące laboratoryjne szczury. Wyniki badań histologicznych
oraz krwi i moczu żywionych porostem szczurów, nie
odbiegały od przyjętych norm. Jedynym organem, który
ucierpiał podczas eksperymentu były nerki, jednak upośledzenie ich funkcjonowania przypisywano raczej toksyczności zawartych w plechach związków ołowiu, niż
działaniu metabolitów porostowych [8].
Zastosowanie w farmakoterapii
Działanie polisacharydów śluzowych obecnych w preparatach wodnych polega na tworzeniu warstwy chroniącej
podrażnioną suchym kaszlem błonę śluzową górnych dróg
oddechowych. Efekt powlekający i nawilżający skutkuje
złagodzeniem stanów zapalnych gardła oraz zmniejszeniem
podrażnienia receptorów kaszlowych, co jest związane z redukcją suchego kaszlu [8].
Porost islandzki posiada monografię w Farmakopei Europejskiej V i Farmakopei Polskiej VIII. Surowiec ma także
akceptację Komisji Europejskiej. Zgodnie z jej zaleceniami
preparaty z porostu islandzkiego można stosować w przypadku podrażnionej śluzówki jamy ustnej, gardła i krtani
z towarzyszącym suchym kaszlem, a pomocniczo również
w zapaleniu oskrzeli. Wskazaniem do stosowania specyfików z plechy C. islandica może być także utrata apetytu czy
zaburzenia dyspeptyczne [8, 11, 13].
W zależności od zaleceń do stosowania surowca, preparaty używane w terapii powinno się przygotowywać
w różny sposób. Jeśli celem jest otrzymanie leku na kaszel
głównym składnikiem sporządzanych specyfików powinny
być, wpływające kojąco na podrażnione drogi oddechowe,
polisacharydy śluzowe. W tym przypadku pożądane jest
zmniejszenie zawartości gorzkich kwasów porostowych w
surowcu. Warunkują one nieprzyjemny smak zażywanych
mikstur, nie mając wpływu na spodziewany efekt terapeutyczny. Oczekiwany rezultat uzyskuje się przez krótkie,
wstępne gotowanie plechy porostu i odrzucenie pierwszej
porcji przygotowywanego odwaru. Aby otrzymać preparat
o gorzkim smaku, czyli zawierający wtórne metabolity porostów, konieczne jest zredukowanie ilości substancji śluzowych. Efekt taki osiąga się przez macerację surowca (zalanie
plechy wodą o temp. pokojowej) lub przygotowanie z niego
naparu (zalanie surowca gorącą, lecz nie wrzącą wodą). Innym sposobem może być także sporządzanie wyciągów etanolowych. Jeśli preparat ma zwierać oba typy wykazujących
działanie lecznicze substancji, plechę gotuje się a otrzymany
w ten sposób wodny wyciąg cedzi przez sito [8].
Środki ostrożności i działania niepożądane
Uważa się, że przeciwwskazaniem do stosowania porostu islandzkiego są wrzody żołądka i dwunastnicy [6].
W związku z gorzkim smakiem surowiec, powoduje zwięk-
25
szenie wydzielania soków trawiennych, co drażni uszkodzoną błonę śluzową przewodu pokarmowego. Stosowanie
preparatów z C. islandica może zmniejszyć wchłanianie
przyjmowanych równocześnie leków [28]. Nie ma danych
na temat stosowania preparatów z surowca w okresie ciąży
i karmienia piersią, dlatego według ogólnie przyjętych zasad, nie zaleca się ich stosowania w tym okresie bez wskazań lekarza [8, 13].
Porost islandzki w preparatach
W polskich aptekach dostępne są preparaty zawierające
wyciągi z porostu islandzkiego. Do bardziej znanych należy
zaliczyć tabletki z serii „Isla” (Isla-Moos®, Isla-Mint®, IslaCassis®). Preparat można stosować profilaktycznie, w celu
ochrony śluzówki przed podrażnieniami spowodowanymi
wpływem szkodliwych czynników zewnętrznych, takich jak
suche powietrze czy klimatyzacja. Ponadto ssanie tabletek
z porostem islandzkim zaleca się osobom narażonym na silne obciążenie strun głosowych oraz w przypadku chrypki.
Według zaleceń producenta nie ma przeciwwskazań do stosowania preparatu u kobiet w ciąży i kobiet karmiących oraz
u dzieci.
Wśród innych preparatów do ssania można wymienić tabletki Aciv-Angidin, zawierające wyciąg z porostu islandzkiego oraz olejek z mięty pieprzowej. Według zaleceń producenta można podawać go dzieciom już od 4 roku życia.
Porost islandzki jest także zawarty w preparacie Pectosol. Specyfik zawiera płynne wyciągi etanolowe nie tylko
z porostu islandzkiego, lecz również z innych surowców
leczniczych (ziele tymianku, korzeń mydlnicy, ziele hyzopu). Krople Pectosol zaleca się w stanach zapalnych i nieżycie dróg oddechowych, suchym kaszlu, a także w utrudnionym odkrztuszaniu wydzieliny. Preparat nie powinien
być zażywany razem z lekami blokującymi odruch kaszlu.
W przypadku chorych cierpiących na astmę oskrzelową
Pectosol można stosować tylko w wyjątkowych przypadkach. Zawartość alkoholu wyklucza podawanie preparatu
dzieciom do 6 roku życia.
Podsumowanie
Wiele gatunków porostów było wykorzystywanych
w medycynie ludowej, lecz tylko C. islandica jako najlepiej
przebadana, znalazła szersze zastosowanie w preparatach
farmaceutycznych. Porost islandzki zalecany jest głównie
w leczeniu schorzeń górnych dróg oddechowych oraz
w przypadku zaburzeń trawiennych. Dane piśmiennictwa
wskazują na znacznie większy potencjał leczniczy surowca, gdyż jak wynika z badań laboratoryjnych, tarczownica
islandzka i zawarte w niej związki posiadają aktywność:
przeciwbakteryjną, przeciwwirusową, cytotoksyczną, antyproliferacyjną, antyoksydacyjną oraz immunomodulującą.
Wykorzystanie w terapii wszystkich stwierdzonych w badaniach właściwości porostu islandzkiego, wymaga przeprowadzenia badań klinicznych potwierdzających skuteczność
i bezpieczeństwo stosowania surowca.
26
Piśmiennictwo
1. Fałtynowicz W. The lichens, lichenicolous and allied
fungi of Poland. An annotated checklist. Krytyczna lista
porostów i grzybów naporostowych Polski. Szafer Institute of Botany, Polish Academy of Sciences. Kraków
2003, 72-75.
2. Strzelecka H, Kowalski J. Encyklopedia zielarstwa
i ziołolecznictwa. PWN. Warszawa 2000, 556-557.
3. Rozporządzenia Ministra Środowiska z dnia 9 lipca
2004 roku w sprawie gatunków dziko występujących
grzybów objętych ochroną (Dz. U. nr 168, poz. 1765).
4. European Pharmacopoeia V, vol. 2. Council of Europe.
Strasbourg 2004, 1787.
5. Farmakopea Polska VIII, t. 2. Warszawa 2008,
2162-2163.
6. Blumenthal M (red.). Herbal Medicine. Expanded Commission E Monographs. Integrative Medicine Communications. Newton 2000, 212-214.
7. Huneck S, Yoshimura I. Identification of lichen substances. Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg 1996.
8. Bradley P. British Herbal Compendium. A Handbook
of scientific information on widely used plant drugs.
BHMA British Herbal Medicine Association. Bournemouth 2006, 223-227.
9. Gudjónsdottir GA, Ingólfsdóttir K. Quantitative determination of protolichesterinic and fumarprotocetraric acids in Cetraria islandica by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A 1997;
757: 303-306.
10. Kohlmünzer S. Farmakognozja. Podręcznik dla studentów farmacji. PZWL, Warszawa 2007, 94.
11. Wichtl M (red.). Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals. A Handbook for Practice on a Scientific Basis.
Medpharm Scientific Publishers. Stuttgart 2004, 338341.
12. Bylka W, Studzińska E. Aktywność immunostymulująca porostów. W: Współczesne zagrożenia zdrowotne.
Red. Skopińska-Różewska E, Siwicki AK. EDYCJA.
Olsztyn 2009, 231-342.
13. ESCOP Monographs. The Scientific Foundation for
Herbal Medicinal Products. Thieme. New York 2003,
286-289.
14. Olafsdóttir ES, Ingólfsdóttir K. Polysaccharides from
Lichens: Structural Characteristics and Biological Activity. Planta Med 2001; 67: 199-208.
15. Stepanenko LS i wsp. Quinones of Cetraria islandica.
Phytochemstry 1997; 46: 565-568.
16. Ingólfsdóttir K i wsp. Immunologically active polysaccharides from Cetraria islandica. Planta Med 1994; 60:
527-531.
17. Olafsdóttir ES i wsp. Immunologically active (1→3)(1→4)-α-D-glucan from Cetraria islandica. Phytomedicine 1999a; 6: 33-39.
18. Kumar KCS, Müller K. Lichen metabolites. 1. Inhibitory action against leukotriene B4 biosynthesis by a nonredox mechanism. J Nat Prod 1999; 62: 817-820.
19. Pengsuparp T i wsp. Mechanistic evaluation of new
plant-derived compounds that inhibit HIV-1 reverse
transcriptase. J Nat Prod 1995; 58: 1024-1031.
20. Ingólfsdóttir K i wsp. In Vitro Susceptilibility of Heli‑
cobacter pylori to Protolichesterinic Acid from the Lichen Cetraria islandica. Antimicrob Agents Chemother
1997; 41: 215-217.
21. Ögmundsdóttir HM i wsp. Anti-proliferative effects of
lichen-derived inhibitors of 5-lipoxygenase on malignant cell-lines and mitogen-stimulated lymphocytes. J
Pharm Pharmacol 1998; 50: 107-115.
22. Müller K. Pharmaceutically relevant metabolites from
lichens. Appl Microbiol Biotechnol 2001; 56: 9-16.
23. Studzińska E, Witkowska-Banaszczak E, Bylka W.
Związki biologicznie aktywne porostów. Herba Pol
2008; 54: 80-88.
24. Gülçin I i wsp. Determination of antioxidant activity of
lichen Cetraria islandica (L.) Ach. J Ethnopharmacol
2002; 79: 325-329.
25. Ingólfsdóttir K, Jurcic K, Wagner H. Immunomodulating polysaccharides from aqueous extracts of Iceland
moss. Phytomedicine 1998; 5: 333-339.
26. Smyrga M, Saito H. Effect of selected thallophytic glucans on learning behaviour and short-term potentiation.
Phytother Res 2000; 14: 153-155.
27. Huovinen K, Jaakkola T. Lichen islandicus and the Chernobyl Fallout In Finland. Planta Med 1991; 57: A24.
28. Wynn SG, Fougère B. Veterinary herbal medicine. Mosby Elsevier. Missouri 2007, 201.
prof. UM dr hab. Wiesława Bylka
Katedra i Zakład Farmakognozji
Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu
ul. Święcickiego 4, 60-781 Poznań
tel.: +48 61 854 67 09
faks: +48 61 854 67 01
27
Farm Przegl Nauk, 2010,7,28-32
Porównanie skuteczności czynników silanizujących w analizie
niesteroidowych leków przeciwzapalnych techniką GC/MS
Comparison of the Efficiency of Silylating Agents in GC/MS Analysis
of Non-steroidal Anti-inflammatory Drugs
Sławomir Kurkiewicz, Anna Dzierżęga-Lęcznar, Krystyna Stępień
Katedra Analizy Instrumentalnej Wydziału Farmaceutycznego
z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
Streszczenie
Abstract
Silanizacja polarnych grup funkcyjnych jest jedną z metod derywatyzacyjnych, których przeprowadzenie jest
niezbędne w analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) z zastosowaniem chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas. W pracy poddano
ocenie możliwość wykorzystania różnych odczynników
silanizujących do oznaczania ibuprofenu, paracetamolu,
flurbiprofenu, naproksenu, ketoprofenu i kwasu mefenamowego techniką GC/MS. Pod wpływem BSA, BSTFA,
HMDS i MSTFA otrzymano pochodne trimetylosililowe
analizowanych NLPZ, natomiast po zastosowaniu MTBSTFA - pochodne tert-butylodimetylosililowe. Identyfikacji trimetylosililopochodnych dokonano na podstawie
porównania ich widm mas z widmami bibliotecznymi,
natomiast pochodne tert-butylodimetylosililowe zidentyfikowano poprzez interpretację otrzymanych widm. Zoptymalizowano warunki rozdziału chromatograficznego
sililopochodnych NLPZ i wykonano krzywe kalibracyjne
do ich oznaczania. Z przeprowadzonych badań wynika, że
wszystkie testowane odczynniki wprowadzające ugrupowania trimetylosililowe można z powodzeniem wykorzystać do
oznaczania ibuprofenu, flurbiprofenu, naproksenu, kwasu
mefenamowego i ketoprofenu techniką GC/MS, przy czym
ich skuteczność derywatyzacyjna jest porównywalna, a uzyskane krzywe wzorcowe charakteryzują się zbliżonymi parametrami. BSA i HMDS nie są polecane do derywatyzacji
paracetamolu. Oznaczanie testowanych leków w postaci pochodnych tert‑butylodimetylosililowych jest korzystniejsze
z uwagi na wyższą czułość metody oraz na znacznie większą odporność tych związków na ślady wody, ale wymaga
znacznego wydłużenia czasu analizy GC/MS.
Silylation of polar functional groups is one of the derivatization methods that are indispensable in the analysis of
non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) by GC/
MS. In this study, the potential utility of various silylation
reagents in GC/MS determination of ibuprofen, paracetamol, flurbiprofen, naproxen, ketoprofen and mefenamic
acid was evaluated. Treatment with BSA, BSTFA, HMDS
and MSTFA caused trimethylsilylation of the analyzed
NSAIDs, while the use of MTBSTFA led to the formation
of their tert-butyldimethylsilyl derivatives. Trimethylsilyl
derivatives of the drugs were identified by comparison of
their mass spectra with the library standards. To establish
the identity of tert-butyldimethylsilyl derivatives, the interpretation of the recorded spectra was performed. The
conditions of GC separations of the obtained silyl derivatives of the studied NSAIDs were optimized, and the calibration curves were plotted. It was found that all the tested
trimethylsilylation reagents may be successfully applied
for GC/MS determination of ibuprofen, flurbiprofen,
naproxen, mefenamic acid and ketoprofen, with comparable efficiency, sensitivity and linearity. BSA and HMDS
are not recommended for paracetamol derivatization. Determination of the studied drugs as tert-butyldimethylsilyl
derivatives is more beneficial due to higher sensitivity of
the method and much more resistance of the derivatives to
the hydrolytic effects of moisture, but significant extending of GC/MS analysis is required.
Key words: GC/MS, silylation, non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs
Słowa kluczowe: GC/MS, silanizacja, niesteroidowe leki
przeciwzapalne, NLPZ
Wstęp
W celu oznaczenia niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) techniką chromatografii gazowej należy na
drodze derywatyzacji przeprowadzić je w mniej polarne po-
28
chodne posiadające wyższą lotność i stabilność termiczną.
W procesie derywatyzacji następuje wymiana atomu wodoru związanego z heteroatomem na taką grupę funkcyjną,
która nie tworzy wiązań wodorowych [1]. W analizie NLPZ
najczęściej do tego celu stosuje się metylację lub silanizację
[2-5]. Obecnie na rynku mamy szeroki wybór odczynników
derywatyzujących, które tworzą pochodne trimetylosililowe
(TMS). Odczynniki te różnią się aktywnością względem
różnych grup funkcyjnych. W analizowanych lekach najłatwiej podstawieniu ulega wodór w grupie hydroksylowej,
a najtrudniej w grupie amidowej, dlatego zdolność derywatyzacji grupy amidowej może być dowodem wysokiej
reaktywności danego odczynnika silanizującego. Reakcja
silanizacji zachodzi z reguły łatwo i szybko, zazwyczaj nie
wymaga katalizatora, a nadmiar odczynnika derywatyzującego z uwagi na wysoką lotność opuszcza kolumnę wraz z
rozpuszczalnikiem na początku analizy [6]. Pochodne TMS
są wrażliwe na wilgoć: śladowe ilości wody powodują ich
hydrolizę, co może w znaczny sposób obniżyć czułość metody. Ma to szczególne znaczenie w analizie prób pochodzenia biologicznego, które zazwyczaj są izolowane z wodnego
środowiska. W celu uniknięcia tej niedogodności można stosować derywatyzację do pochodnych tert‑butylodimetylosililowych (TBDMS). Chociaż pochodne te powstają trudniej,
charakteryzują się znacznie większą odpornością na hydrolizę [7, 8]. Ponadto, z uwagi na większą masę cząsteczkową, zwiększa się czułość ich detekcji przy zastosowaniu
jako detektora spektrometru mas z jonizacją elektronową [9,
10]. Ze względu na swoje zalety, pochodne TBDMS zostały wykorzystane w międzylaboratoryjnych, obejmujących
dziewięć krajów, badaniach zawartości NLPZ w wodach
rzecznych i ściekach [11, 12]
Celem prezentowanej pracy było porównanie skuteczności derywatyzacyjnej odczynników silanizujących prowadzących do otrzymania pochodnych TMS i TBDMS wybranych NLPZ oraz wyznaczenie krzywych kalibracyjnych
do oznaczeń ilościowych.
Materiały i metody
W celu derywatyzacji, 100 μl analizowanych roztworów wzorcowych NLPZ umieszczono w szklanych fiolkach (2ml) i dodano taką samą objętość odczynnika silanizującego. Następnie fiolki szczelnie zamknięto i ogrzewano przez godzinę w temperaturze 70 oC. Po schłodzeniu próbek, poddano je analizie techniką GC/MS. Analizy
GC/MS wykonano stosując chromatograf gazowy Agilent serii 6890 sprzężony ze spektrometrem mas Agilent
Network 5973 i automatycznym podajnikiem próbek
7683 firmy Agilent Technologies. Wykorzystano dozownik „bezpośredniego wprowadzania na zimną kolumnę”
(„Cool on column”) z elektroniczną kontrolą ciśnienia,
którego temperatura w trybie pracy „Track Oven” wynosiła 3 oC więcej niż temperatura pieca chromatograficznego. Jako gaz nośny zastosowano hel o szybkości przepływu 2,6 ml/min. Temperatura linii transferowej wprowadzającej kolumnę chromatograficzną bezpośrednio do
źródła jonów spektrometru mas wynosiła 230 ºC. Analizowane związki jonizowano strumieniem elektronów
o energii 70 eV. Źródło jonów w spektrometrze utrzymywano w temperaturze 230 ºC, a kwadrupol w 150 ºC.
Spektrometr pracował w trybie zbierania pełnego widma
(full scan), monitorując masy 70-400 j.m.a. Do interpretacji widm mas wykorzystano ósme wydanie biblioteki
widm mas Wiley’a oraz bibliotekę NIST/EPA 2008.
Zastosowano następujące programy temperaturowe pieca chromatograficznego:
– dla rozdziału pochodnych TMS: temperatura początkowa 40 oC utrzymywana była przez 1min, następnie
zastosowano wzrost temperatury z prędkością 20 oC/
min do 160 oC i od 160 oC z prędkością 5 oC/min
do temp. 205 oC, którą utrzymywano przez 10 min,
dalej temperatura z prędkością 3 oC/min wzrastała do
270 oC.
– dla rozdziału pochodnych TBDMS: temperatura
początkowa 50 oC utrzymywana była przez 1min,
następnie zastosowano wzrost temperatury z prędkością 20 oC/min do 130 oC i od 130 oC z prędkością
2 oC/min do temp. 205 oC, którą utrzymywano przez
10 min, dalej temperatura z prędkością 3 oC/min
wzrastała do 280 oC.
Analizie poddano roztwory wzorcowe NLPZ w dichlorometanie, zawierające ibuprofen, flurbiprofen, ketoprofen,
kwas mefenamowy, naproksen oraz paracetamol. Stężenia
każdego z leków w określonym roztworze były identyczne
i wynosiły 10, 20, 30 i 50 ng/μl. Jako wzorzec wewnętrzny
zastosowano oktadekan, którego stężenie w każdym roztworze wynosiło 25 ng/μl. Wszystkie stosowane leki, oktadekan
oraz dichlorometan zakupiono w firmie Sigma‑Aldrich.
W celu otrzymania pochodnych
trimetylosililowych
zastosowano
odczynniki derywatyzujące: N,Obis-trimetylosililoacetamid (BSA),
N,O‑bis‑trimetylosililo-trifluoroacetamid (BSTFA), heksametylodisiloksan (HMDS) - firmy Supelco oraz
N-metylo-N-trimetylosililotrifluoroacetamid (MSTFA) - produkcji Macherey & Nagel. Pochodne tert‑butylodimetylosililowe
otrzymano
wykorzystując N‑metylo‑N‑(tert‑butylodimetylosililo)trifluoroacetamid (MTBSTFA) z 1% dodatkiem Ryc. 1. Porównanie skuteczności derywatyzacyjnej różnych odczynników silanikatalizatora tert‑butylodimetylo‑sil- zujących względem ibuprofenu, kwasu mefenamowego, flurbiprofenu, naproksenu
ilochlorku (TMCS) firmy Sigma i ketoprofenu (20 ng/µl). Powierzchnię pików znormalizowano względem wzorca
-Aldrich.
wewnętrznego.
29
Wyniki i dyskusja
W celu dobrania najlepszego odczynnika derywatyzującego testowano kilka najpopularniejszych związków silanizujących: BSA, BSTFA, HMDS i MSTFA, które prowadzą
do otrzymania pochodnych TMS oraz MTBSTFA, który
tworzy pochodne TBDMS.
Wszystkie odczynniki silanizujące prowadzące do otrzymania pochodnych TMS ibuprofenu, flurbiprofenu, naproksenu, kwasu mefanamowego i ketoprofenu charakteryzowała podobna skuteczność derywatyzacyjna. Bez względu na
stosowany odczynnik derywatyzujący, uzyskano porównywalne powierzchnie pików odpowiadających sililopochodnym analizowanych leków. Każdy z tych leków posiada
grupę karboksylową, której wodór stosunkowo łatwo ulega
wymianie na ugrupowanie sililowe. Na rycinie 1 przedstawiono porównanie skuteczności derywatyzacyjnej wybranych związków silanizujących względem ibuprofenu, kwasu
mefenamowego, flurbiprofenu, naproksenu i ketoprofenu.
Natomiast w przypadku paracetamolu, jeden z aktyw-
Ryc. 4. Widmo mas i schemat fragmentacji estru tert‑butylodimetylosililowego ibuprofenu.
Ryc. 5. Krzywa kalibracyjna do oznaczania flurbiprofenu
w postaci pochodnych TMS i TBDMS otrzymanych w obecności odpowiednio BSTFA i MTBSTFA. Pola powierzchni
pików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego.
Ryc. 2. Porównanie pól powierzchni pików ibuprofenu po
przeprowadzeniu do pochodnej TMS przy użyciu BSTFA
i pochodnej TBDMS za pomocą MTBSTFA. Pola powierzchni pików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego.
Ryc. 3. Porównanie sumy pól powierzchni pików pochodnych mono- i di- paracetamolu po przeprowadzeniu do pochodnej TMS przy użyciu BSTFA i pochodnej TBDMS za
pomocą MTBSTFA. Pola powierzchni pików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego.
30
nych wodorów ulegających podstawieniu pochodzi z grupy hydroksylowej, a drugi znajduje się przy atomie azotu
grupy amidowej. W wyniku derywatyzacji pod wpływem
większości zastosowanych odczynników otrzymano disililopochodną tego leku. Wyjątek stanowił HMDS, który
praktycznie nie wykazuje reaktywności w stosunku do grup
amidowych. We wszystkich mieszaninach poderywatyzacyjnych zidentyfikowano ponadto mono-O-sililopochodną
paracetamolu, natomiast nie stwierdzono obecności mono-N-sililopochodnej. Najefektywniejszym odczynnikiem
derywatyzującym, dzięki któremu uzyskano najwięcej pochodnej di-TMS, okazał się BSTFA, natomiast najsłabszym
działaniem wykazał się HMDS. W tym przypadku wykryto
tylko pochodną mono-TMS o charakterze eteru oraz rozmyty pik niezderywatyzowanego paracetamolu. BSA, pomimo
wysokiej skuteczności derywatyzacyjnej, ze względu na dodatkowy produkt, który powstaje z jego rozkładu, nie jest
polecany do oznaczania paracetamolu. Produkt ten ma podobny czas retencji do pochodnej di-TMS paracetamolu, co
może prowadzić do zafałszowania wyników ilościowych.
Na rycinie 2 przedstawiono porównanie pól powierzchni
pików ibuprofenu po przeprowadzeniu do pochodnej TMS
przy użyciu BSTFA i pochodnej TBDMS za pomocą MTBSTFA. Niemal dla wszystkich oznaczanych leków pochodne
tert-butylodimetylosililowe charakteryzowały się większą
intensywnością pików chromatograficznych. Wyjątek stano-
Tab. 1. Wartości m/z jonów molekularnych oraz jonów wynikających z odczepienia
rodnika tert-butylowego, charakterystyczne dla pochodnych TBDMS analizowanych
leków
Jon główny [M-57]
Jon molekularny M+
Pochodna TBDMS
intensywność
m/z
m/z
ślady
Ibuprofen
320
263
ślady
Flurbiprofen
358
301
10%
Naproksen
344
287
65%
Kwas mefenamowy
355
298
ślady
Ketoprofen
368
311
40%
Paracetamol (mono)
265
208
10%
Paracetamol (di)
379
322
wiło najniższe stężenie paracetamolu, przy którym powstają głównie mono pochodne, zarówno TMS, jak i TBDMS
(Ryc. 3). Wraz ze wzrostem stężenia leku obserwowano
stopniowy przyrost stężenia pochodnej di- w mieszaninie
poderywatyzacyjnej. W celu ilościowego oznaczenia paracetamolu należy uwzględnić obie jego pochodne .
Ponieważ w komercyjnie dostępnych bibliotekach (8
edycja biblioteki Wiley’a i NBS/EPA 2008) nie ma widm
pochodnych TBDMS oznaczanych leków, ich identyfikacji dokonano na podstawie interpretacji zarejestrowanych
widm mas. Na rycinie 4 przedstawiono widmo mas i schemat fragmentacji tert‑butylodimetylosililowej pochodnej
ibuprofenu. W zastosowanych warunkach jonizacji jon molekularny m/z 320 jest na tyle nietrwały, że zarejestrowano
go tylko w śladowych ilościach. Zarejestrowano natomiast
jon [(CH3)2CHCH2C6H4CHCH3]+ przy m/z 161 charakterystyczny dla ibuprofenu bez względu na typ jego pochodnej.
Pik główny o wartości m/z 263 wynika z odczepienia rodnika tert‑butylowego (M‑57) i jest typowy dla w wszystkich
tert‑butylodimetylosililowych pochodnych analizowanych
leków [9, 13]. W widmach tych pochodnych zawsze obserwuje się również jon przy m/z 73 odpowiadający [Si(CH3)3]+,
który jest charakterystyczny także dla pochodnych trimetylosililowych, oraz towarzyszący mu jon o wartości m/z 75.
W podobny sposób były interpretowane widma tert‑butylodimetylosililowych pochodnych pozostałych leków. W tabeli 1 przedstawiono masy cząsteczkowe tych pochodnych,
jony wynikające z odczepienia rodnika tert-butylowego oraz
ich względne intensywności w otrzymanych widmach.
W celu oznaczenia analizowanych leków zoptymalizowano proces rozdziału chromatograficznego. Najkorzystniejsze rozdziały uzyskano na 60 m kolumnie typu HP-5 (95%
polidimetylosiloksanu, 5% bifenylu). Niestety program,
który zastosowano do rozdziału trimetylosililopochodnych
w przypadku pochodnych TBDMS okazał się nieodpowiedni, głównie z powodu niecałkowitego rozdziału estrów ketoprofenu i kwasu mefenamowego. Z tego względu konieczne
było zastosowanie łagodniejszego narostu temperaturowego
i wydłużenie czasu analizy z 36 do 60 minut.
Skuteczność odczynników zastosowanych do derywatyzacji potwierdzają krzywe kalibracyjne wykonane dla wszystkich
oznaczanych leków. W przypadku pochodnych TMS charakteryzują się one wysokim współczynnikiem korelacji liniowej
i niemal identycznym nachyleniem dla każdego z leków. Krzywe kalibracyjne uzyskane za pomocą MTBSTFA charakteryzuje
równie wysoka korelacja liniowa, natomiast wartości ich współczynników kierunkowych „a” są wyraźnie wyższe, co
wskazuje na lepszą czułość metody. Na
rycinie 5 przedstawiono przykładowe
krzywe kalibracyjne pochodnych TMS i
TBDMS otrzymane dla flurbiprofenu.
Wnioski
Wszystkie testowane odczynniki
silanizujące, które tworzą pochodne
TMS można z powodzeniem wykorzystać do oznaczania ibuprofenu,
flurbiprofenu, naproksenu, kwasu mefenamowego i ketoprofenu techniką GC/MS, przy
czym ich skuteczność derywatyzacyjna jest porównywalna.
HMDS i BSA nie są polecane do derywatyzacji paracetamolu. Oznaczanie testowanych leków w postaci pochodnych
tert‑butylodimetylosililowych jest korzystniejsze z uwagi
na wyższą czułość metody oraz na znacznie większą odporność tych związków na ślady wody, ale wymaga znacznego
wydłużenia czasu analizy GC.
Badania finansowane przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach (grant nr KNW-2-151/09).
Piśmiennictwo
1. Namieśnik J, Chrzanowski W, Szpinek P. Nowe horyzonty i wyzwania w analityce i monitoringu środowiska. Centrum Doskonałości Analityki i Monitoringu
Środowiskowego, Gdańsk 2003.
2. Maurer HH. Systematic toxicological analysis procedures for acidic drugs and/or metabolites relevant to clinical and forensic toxicology and/or doping control. J
Chromatogr B 1999; 733: 3-25.
3. Polettini A. Systematic toxicological analysis of drugs
and poisons in biosamples by hyphenated chromatographic and spectroscopic techniques. J Chromatogr B
1999; 733: 47-63.
4. Kurkiewicz S i wsp. Derywatyzacja “on-line” w oznaczaniu ibuprofenu i naproksenu techniką GC/MS. Farm
Przegl Nauk 2008; 3: 22-24.
5. Kurkiewicz S, Dzierżęga-Lęcznar A, Stępień K. Wodorotlenek trimetylosulfoniowy jako czynnik derywatyzujący
w analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnych techniką GC/MS. Farm Przegl Nauk 2008; 11-12: 38-41.
6. Kosjek T, Heath E, Krbavcic A. Determination of nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAIDs) residues in
water samples. Environ Int 2005; 31: 679-685.
7. Knapp DR. Handbook of Analytical Derivatization Reactions. Wiley. Chichester 1979.
8. Farré M, Petrovic M, Barceló D. Recently developed GC/
MS and LC/MS methods for determining NSAIDs in water samples. Anal Bioanal Chem 2007; 387: 1203-1214.
9. Rodríguez I i wsp. Determination of acidic drugs in sewage water by gas chromatography-mass spectrometry
as tert.-butyldimethylsilyl derivatives. J Chromatogr A
2003; 985: 265-274.
31
10. Carpinteiro JB i wsp. Application of strategic sample composition to the screening of anti-inflammatory
drugs in water samples using solid-phase microextraction. Anal Chim Acta 2004; 524: 63-71.
11. Heath E i wsp. Second interlaboratory exercise on nonsteroidal anti-inflammatory drug analysis in environmental aqueous samples. Talanta 2010; 81: 1189-1196.
12. Farre M i wsp. First interlaboratory exercise on non-steroidal anti-inflammatory drugs analysis in environmental samples. Talanta 2008; 76: 580-590.
13. Kyoung-Rae K, Hye-Ran Y. Rapid screening for acidic
non-steroidal anti-inflammatory drugs in urine by gas
chromatography mass spectrometry in the selected-ion
monitoring mode. J Chromatogr B 1996; 682: 55-66.
dr n. farm. Sławomir Kurkiewicz
Katedra Analizy Instrumentalnej Wydziału Farmaceutycznego
z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
ul. Narcyzów 1, 41-200 Sosnowiec
tel: +48 32 364 1053
32
poddanych działaniu kamptotecyny
NF-κB factor in human skin fibroblasts treated with camptothecin
Ewa Kłosińska – Szmurło, Wojciech Miltyk, Arkadiusz Surażyński, Joanna Dondziło, Jerzy Pałka
Katedra Chemii, Analizy i Technologii Środków Leczniczych
Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
Streszczenie
Abstract
Mechanizm inhibitorowego działania kamptotecyny na
biosyntezę kolagenu nie jest w pełni wyjaśniony. Z niniejszych badań wynika, iż kamptotecyna (CPT) hamuje biosyntezę kolagenu oraz pobudza aktywność prolidazy, enzymu który odgrywa ważną rolę w biosyntezie kolagenu –
hydrolizuje imidodipeptydy dostarczając wolną L-prolinę
do procesu biosyntezy tego białka. Aktywność prolidazy
i biosyntezę kolagenu regulują receptory β1-integrynowe.
Wykazano, że ekspresja podjednostki β1 receptora integrynowego wzrasta w fibroblastach inkubowanych z CPT,
w porównaniu do komórek kontrolnych. Wykazano także,
że CPT pobudza ekspresję czynnika NF-κB (odpowiadającego za hamowanie ekspresji genów kolagenu) w sposób
zależny od użytego stężenia i od czasu inkubacji. Różnica
pomiędzy wzrostem aktywności prolidazy, a obniżeniem
biosyntezy kolagenu, w fibroblastach poddanych działaniu CPT może wynikać zatem z przewagi inhibitorowego
działania NF-κB na ekspresję genów kolagenu nad pobudzającym działaniem MAP-kinaz na aktywność prolidazy. Przedstawiony mechanizm inhibitorowego działania
kamptotecyny na biosyntezę kolagenu może posłużyć
jako model badawczy do poszukiwania nowych leków
stosowanych w terapii zwłóknienia narządów.
Although, camptothecin (CPT) is considered as a potential anticancer agent acting through inhibition of topoisomerase I, the mechanism of its effect on collagen metabolism is not known. The present study was undertaken
to evaluate the mechanism of CPT - induced deregulation
of collagen metabolism in cultured human skin fibroblast.
It has been found that CPT strongly induced inhibition of
collagen biosynthesis. The mechanism of this phenomenon was found to be independent of prolidase activity,
an enzyme that plays an important role in enhancement of
collagen biosynthesis at post-translational level. In fact,
the enzyme activity was found to be stimulated by CPT.
Increase in the enzyme activity was accompanied by increase in the expression of β1 integrin receptor and some
β1 integrin-dependent signaling proteins, Sos, MAPK and
transcription factor NF-κB. Since at least in some cell
types activation of β1 integrin induces NF-κB and this
transcription factor is involved in inhibition of collagen
gene transcription, therefore the mechanism of CPT-dependent inhibition of collagen biosynthesis may be related
to β1 integrin-dependent stimulation of NF-κB. The data
suggest that CPT induces inhibition of collagen biosynthesis in cultured human skin fibroblasts by stimulation of
NF-κB signaling.
Słowa kluczowe: kamptotecyna, kolagen, fibroblasty,
NFκB
Key words: camptothecin, collagen, fibroblasts, NFκB
Wstęp
Badania nad metabolizmem kolagenu stanowią jeden
z głównych kierunków badań nad chorobami tkanki łącznej.
Pomimo znacznego postępu, jaki dokonał się w wyjaśnieniu
mechanizmów regulujących metabolizm kolagenu, wciąż
brakuje skutecznej terapii zwłóknienia narządów.
Jednym z czynników hamujących biosyntezę kolagenu
jest kamptotecyna. Mechanizm tego procesu nie jest w pełni poznany. Kamptotecyna jest alkaloidem chinolinowym,
wykazującym właściwości antymitotyczne [1, 2]. Udowodniono, że najwyższą aktywność cytotoksyczną wykazuje ona w stosunku do komórek znajdujących się w fazie
przedpodziałowej cyklu komórkowego [3, 4]. Faza S cyklu
komórkowego u szybko dzielących się komórek takich jak
komórki nowotworowe trwa dłużej niż w przypadku komó-
rek prawidłowych i dlatego komórki rakowe są niszczone
z dużo większą skutecznością niż komórki prawidłowe
[5-7]. Z tego powodu, pochodne tego alkaloidu znalazły zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej [8, 9].
NF-κB to rodzina jądrowych czynników aktywujących
transkrypcję genów, obejmująca grupę regulatorów kontroli
cyklu komórkowego, wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej, procesów zapalnych, apoptozy i onkogenezy. Czynniki te, w zależności od typu bodźca mają zdolność
do dimeryzacji [7, 10-12]. Najdokładniej scharakteryzowanym heterodimerem jest p50/p65 stanowiący produkt genu
NF-κB1 i RelA [13-19]. Rodzina NF-κB odpowiada za aktywację transkrypcji genów w odpowiedzi na sygnał pochodzący ze środowiska pozakomórkowego, wywołany obec-
33
nością: cytokin (np. TNF-α), mitogenów (np. anti-CD2, antiCD3), bakterii (endotoksyny Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis), wirusów (np. HTLV-1, HBV), leków (np.
cykloheksamid) i innych czynników np. stresu oksydacyjnego
czy związków przeciwnowotworowych [19-25]. Aktywacja
NF-κB zachodzi w ciągu kilku minut po ekspozycji na czynnik
indukujący, zatem nie wymaga syntezy białek de novo. Proces
ten polega na fosforylacji IκB (inhibitora NF-kB) co prowadzi
do ich ubikwitynacji i oddysocjowania od NF-κB. Aktywny
NF-κB ulega translokacji z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie pobudza transkrypcję odpowiednich genów [26-28].
Wpływ kamptotecyny na ekspresję NF-κB nie jest
znany. Wysunięto przypuszczenie, że potencjalnym punktem uchwytu inhibitorowego działania tego alkaloidu
na biosyntezę kolagenu może być czynnik transkrypcyjny NF-κB. Ocenie poddano ekspresję NF-κB, receptora
β1-integrynowego oraz biosyntezę kolagenu w fibroblastach
skóry ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny.
Materiały i metody
Materiały
L-prolina, kolagenaza bakteryjna typu VII, trypsyna, pożywka DMEM, kamptotecyna - Sigma, USA, płodowa surowica
bydlęca – Gibco, USA, L-5[3H] prolina (28 Ci/mmol), Amersham, U.K. Przeciwciała poliklonalne królicze przeciw NFκB,
β-aktynie, receptorowi β1-integrynowemu, przeciwciała drugorzędowe znakowane fosfatazą, Santa Gruz, USA. Fibroblasty –
American Type Culture Collection, Rockville, USA.
Metody
Przygotowanie hodowli fibroblastów.
Fibroblasty skóry ludzkiej hodowano w DMEM z dodatkiem 10 % płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mmol/l
glutaminy, 50 µg/ml penicyliny, 50 µg/ml streptomycyny
w temperaturze 37 oC, w atmosferze 5 % CO2. Fibroblasty przenoszono z butelek „Costar” do 6 oczkowych płytek „Costar” stosując bufor fosforanowy z dodatkiem
0,05 % trypsyny i 0,02 % EDTA. Komórki liczono w hemocytometrze i przenoszono w ilości 1x105 komórek na oczko
w 1 ml pożywki hodowlanej. Pożywkę hodowlaną wymieniano na świeżą, co 48 godzin. Fibroblasty osiągały stan inhibicji kontaktowej w 6 dniu wzrostu. W większości przypadków komórki takie użyto do dalszych doświadczeń. Do badań używano komórek pomiędzy 8 i 14 pasażem. Fibroblasty
w stanie inhibicji kontaktowej płukano trzykrotnie 0,15 mol/l
NaCl, zawieszano w 0,15 mol/l NaCl i wirowano przy obrotach 200 x g, a supernatant odrzucono. Następnie, odwirowane komórki zawieszono w 0,3 ml 0,05 mol/l buforu Tris-HCl
o pH 7,8 i poddano działaniu ultradźwięków trzykrotnie po
10 sekund w temp. 0 oC. Próby wirowano przy 16.000 x g w
temp. 0oC przez 30 minut. W uzyskanym supernatancie oznaczono białko i użyto do dalszych doświadczeń.
Test cytotoksyczności
Pomiar cytotoksyczności przeprowadzono według metody opisanej przez Carmichael’a [29]. Oceniono żywotność
34
komórek przy użyciu soli tetrazolinowej (MTT). W żywych
komórkach barwnik ten ulega konwersji do purpurowego
formazonu pod wpływem mitochondrialnych dehydrogenaz. W martwych komórkach konwersja ta nie zachodzi.
Komórki w stanie inhibicji kontaktowej inkubowano w pożywce zawierającej równe stężenia badanego związku przez
24 godziny w inkubatorze z CO2 w temp. 37 oC. Następnie
podłoże usunięto, komórki przepłukano 3 x 1 ml PBS, dodano 1 ml PBS oraz 50µl MTT o stężeniu 5 mg/ml i kontynuowano inkubację przez 4 godziny. Po tym czasie usunięto
medium i dodano do komórek 1 ml 0,1 mol/l kwasu solnego
w absolutnym izopropanolu. Po ok. 10 minutach, w lizacie
komórek mierzono absorbancję przy 570 nm i 630 nm. Od
wartości absorbancji przy 570 nm odjęto wartość absorbancji tła (630nm). Różnicę wartości absorbancji uzyskaną
w hodowlach komórek kontrolnych przyjęto za 100%. Posłużyła ona za wartość porównawczą względem komórek inkubowanych w obecności kamptotecyny. Przeżywalność tych
komórek przedstawiono jako procent wartości kontrolnej.
Oznaczanie zawartości białka
Białko zawarte w supernatancie homogenatów komórkowych oznaczano metodą Lowry i wsp. [30].
Elektroforetyczny rozdział białek na żelu poliakrylami‑
dowym z SDS
Badane próby zawierające 20 µg białka rozpuszczono
w buforze 0,125 mol/l Tris-HCl o pH 6,8 zawierającym 3 %
SDS, 20 % glicerol i 0,1 % błękit bromofenolowy. Próbki
poddano rozdziałowi elektroforetycznemu na żelu poliakryloamidowym złożonym z 10 % żelu zagęszczającego
(zawierającego 0,4 % SDS, 1,5 mol/l bufor Tris-HCl o pH
8,8) i 6 % żelu rozdzielającego (zawierającego 0,4 % SDS,
0,5 mol/l bufor Tris-HCl o pH 6,8) w buforze elektrodowym
zawierającym 1,92 mol/l glicyny, 0,25 mol/l Tris i 1 % SDS.
Doświadczenie prowadzono przy natężeniu prądu 100 mA
na żel przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Analiza białek metodą „Western immunoblot”
Po rozdziale elektroforetycznym żele zrównoważono
5 minutową inkubacją w 20 % (v/v) metanolowym roztworze, który zawierał 25 mmol/l Tris i 0,2 mol/l glicyny. Białka
zostały przetransferowane na nitrocelulozę o porach 0,2 µm
z użyciem zestawu LKB 2117 Multiphor II, pod wpływem
napięcia 100 mA w ciągu 1 godziny, zgodnie z metodą opisaną w podręczniku dołączonym do aparatu. Niespecyficzne
wiązania nitrocelulozy zablokowano poddając ją działaniu
5 % roztworu beztłuszczowego mleka w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, wolno mieszając. Następnie
nitrocelulozę inkubowano z poliklonalnym przeciwciałem
przeciw NF-κB lub polikolnalnym przeciwciałem przeciw
receptorowi β1-integrynowemu lub poliklonalnalnym przeciwciałem przeciw β-aktynie w 5 % roztworze mleka beztłuszczowego w TBS-T o stężeniu 1:3000 przez 24 godziny
w temperaturze pokojowej. Po inkubacji nitrocelulozę płukano w roztworze TBS-T (1x15 minut, 2x10 minut) wolno mieszając. W celu wykrycia analizowanych białek dodano drugie
[dpm x 10 / mg białka]
Analiza statystyczn
25
Wyniki poddano analizie statystycznej. Obliczono średnie arytmetyczne z poszczególnych
pomiarów i odchylenia standardowe oraz dokonano analizy statystycznej przy użyciu testu „t” –
studenta. Za istotne statystycznie przyjęto różnice
pomiędzy średnimi przy poziomie ufności p<0,05.
20
-3
3
Wbudowywanie 5[ H]-proliny
Cytotoksyczność
[% wartości kontrolnej]
skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej w
pożywce przez 24 godziny z dodatkiem 5[3H]120
proliny (5 µCi/ml, 28 Ci/mmol). Komórki dwukrotnie przemyto 1 ml DPBS z 10 mmol/l pro100
liny, następnie zawieszono je w 1,5 ml DPBS
z 10 mmol/l proliny. Zawiesinę komórek poddano homogenizacji ultradźwiękami (3 x 20 s w
80
temp. 0 oC). Białka zawarte w homogenatach
wytrącono przez dodanie 1,5 ml 20% TCA z 20
60
mmol/l proliną. Po 5 minutach wytrącone białka odwirowano (1000 x g w temp. 4oC przez 10
40
minut), supernatant odrzucono, a osad rozpuszczono w 0,6 ml 0,2 mol/l NaOH. Pobierano po 2
próby po 0,2 ml lizatu. Każdą próbę zobojętnia20
no przez dodanie 0,16 ml 0,15 mol/l HCl i 0,1 ml
1 mol/l Tris-HCl o pH 7,2, a następnie dodano
0
20 µl 62,5 mmol/l N-etylomaleimidu (NEM), 10
0
0,1
15
50
µl CaCl2 oraz 10 µl DPBS z kolagenazą o stężeniu
1 mg/ml (próba badana) lub bez kolagenazy
�
Kamptotecyna [ µM]
(próba kontrolna). Próby inkubowano przez 90
Ryc. 1. Ocena przeżywalności fibroblastów skóry ludzkiej poddanych minut w temperaturze 37 oC. Następnie dodano
działaniu kamptotecyny (CPT). Komórki inkubowano przez 24 godziny 0,5 ml zimnego 10% TCA i chłodzono przez 5
w pożywce z dodatkiem różnych stężeń CPT. Przedstawiono wartości minut w temperaturze 0 oC. Po 5 minutach próśrednie ± S.D.
by odwirowano, a supernatant przeniesiono do
fiolek scyntylacyjnych z 4 ml płynu scyntylacyjnego. Ilość powstałego kolagenu wyrażono
w dpm 5[3H]-proliny wbudowanej do białek
35
podatnych na działanie kolagenazy bakteryjnej,
w przeliczeniu na µg białka.
30
15
10
5
Wyniki
0
W celu oceny wpływu kamptotecyny na
przeżywalność fibroblastów skóry ludzkiej,
wykonano test cytotoksyczności metodą CarKamptotecyna [�µM]
michael’a z zastosowaniem soli tetrazolinowej.
Ryc. 2. Biosynteza kolagenu w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej Przeżywalność fibroblastów inkubowanych
w stanie inhibicji kontaktowej inkubowanych przez 24 godziny w poprzez 24 godziny z różnymi stężeniami kampżywce z dodatkiem 0,1, 15, 50 µ M CPT. Przedstawiono wartości średnie totecyny (0,1, 15, 50 µM) przedstawia Ryc. 1.
± S.D.
Stwierdzono, że badane stężenia kamptotecyny
nie wpływają w istotnym stopniu na przeżywalprzeciwciało przeciw króliczej Fc IgG, znakowane fosfatazą alka- ność fibroblastów. Z tego względu do dalszych doświadczeń
liczną w stężeniu 1:5000 w TBS-T i poddano inkubacji przez 30 użyto kamptotecyny w stężeniach 0,1, 15, 50 µM. Następnie
minut, wolno mieszając. Następnie nitrocelulozę delikatnie płuka- wykonano pomiar biosyntezy kolagenu. Badania prowadzono TBS-T (5x10 minut) i poddano działaniu odczynnika Sigma– no w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej w stanie inhibicji
kontaktowej. Fibroblasty inkubowano przez 24 godziny
Fast BCIP/NBT aby wybarwić immunoreaktywne białko.
w podłożu zawierającym różne stężenia kamptotecyny.
Wynik doświadczenia przedstawia Ryc. 2. Dodatek kampPomiar biosyntezy kolagenu
totecyny do pożywki hodowlanej w stężeniu 0,1, 15, 50 µM
Pomiar biosyntezy kolagenu wykonano według me- spowodował obniżenie biosyntezy kolagenu w hodowlach fitody opisanej przez Peterkofsky i wsp. [31]. Fibroblasty broblastów skóry ludzkiej odpowiednio o 30%, 47%, 73% w
0
0,1
15
50
35
A.
NF-κB
B.
β-aktyna
0
0.1
15
Kamptotecyna [μM]
50
Ryc. 3. (A) Ocena ekspresji czynnika NF-κB w ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóry
ludzkiej inkubowanych w obecności różnych stężeń kamptotecyny (B) ekspresja β-aktyny
w ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych w obecności różnych
stężeń kamptotecyny.
A.
NF-κB
B.
β-aktyna
0
20
Czas [min]
60
240
Ryc. 4. Ekspresja NF-κB (A) i β-aktyny (B) w zależności od czasu inkubacji w ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych w pożywce hodowlanej z dodatkiem
50 mM kamptotecyny.
receptor
β1 - integrynowy
integrynowego w homogenacie fibroblastów skóry
ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny. Badanie
przeprowadzono
metodą
„Western-immunoblot”.
Jednocześnie przeprowadzono analizę β-aktyny metodą „Western-immunoblot”
w celu stwierdzenia kontroli
ilości nanoszonego białka.
Wykazano większą zdolność do wiązania przeciwciał przeciwko podjednostce
β1 receptora integrynowego
homogenatów komórek inkubowanych z CPT w porównaniu do homogenatów
komórek kontrolnych (Ryc.
5). Wskazuje to, iż kamptotecyna pobudza ekspresję
receptora β1-integrynowego
w hodowli fibroblastów
skóry ludzkiej.
Dyskusja
Pomimo
znacznego
postępu jaki dokonał się
w wyjaśnieniu mechanizmów regulujących metaboB.
β-aktyna
lizm kolagenu, wciąż brakuje
skutecznej terapii zaburzeń
0
0.1
15
50
kolagenu z tkanki łącznej.
Kamptotecyna [μM]
Kolagen jest najobficiej
Ryc. 5. (A) Ekspresja receptora β1-integrynowego w fibroblastach kontrolnych oraz inkubo- występującym
białkiem
wanych z CPT w różnych stężeniach. (B) Ekspresja β-aktyny w fibroblastach kontrolnych macierzy pozakomórkowej
oraz inkubowanych z CPT w różnych stężeniach.
ssaków. Odpowiada on za
utrzymanie
prawidłowej
struktury
i
integralności
tkanki
łącznej,
odgrywa
też ważna
porównaniu do biosyntezy kolagenu zachodzącej w komórrolę
w
interakcji
z
receptorami
integrynowymi
powierzchkach rosnących w pożywce hodowlanej bez CPT (kontrola).
Zaobserwowano hamowanie biosyntezy kolagenu proporcjo- ni komórek, regulujących wiele procesów fizjologicznych
nalne do użytych stężeń alkaloidu. Uzyskane wyniki wskazu- i patologicznych: reorganizację cytoszkieletu, transport joją, że CPT jest inhibitorem biosyntezy kolagenu w hodowli nów, metabolizm lipidów, aktywację kinaz, ekspresję genów, regulację cyklu komórkowego, procesy różnicowania
fibroblastów skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej.
Jednym z czynników odpowiedzialnych za hamowa- i wzrostu komórek nowotworowych jak również inwazyjnie biosyntezy tego białka jest NF-κB. Oceniono ekspresję ność komórek nowotworowych. Z tego względu wszelkie
NF-κB w hodowli fibroblastów inkubowanych w obecności zmiany w procesach biosyntezy i degradacji kolagenu mają
różnych stężeń kamptotecyny. Wynik tego doświadczenia potencjalny wpływ na metabolizm komórkowy [32].
Badania zespołu Czuwary-Ładykowskiej wskazujące, że
przedstawia Ryc. 3. Zaobserwowano wzrost ekspresji czynkamptotecyna
silnie hamuje biosyntezę kolagenu, nie wynika NF-κB zależny od użytego stężenia kamptotecyny.
jaśniły
jednak
mechanizmu inhibitorowego działania CPT.
W celu potwierdzenia poprawności wykonania doświadczeTen
przeciwnowotworowy
związek zwany „fazowo specynia wykonano jednocześnie analizę „Western-immunoblot”
ficznym”
może
modulować
cykl komórkowy, wpływając
β-aktyny. Zaobserwowano wzrost ekspresji czynnika NFna
replikację
DNA
(fazę
S),
a
dokładniej na stabilizowanie
κB w hodowli fibroblastów w zależności od czasu inkubakompleksu
DNA
–
topoizomeraza
I (enzym biorący udział
cji z kamptotecyną. Najwyższą ekspresję zaobserwowano
w
replikacji,
zmniejszający
naprężenia
nici DNA) i hamopo 4 godzinach inkubacji (Ryc. 4) W regulacji aktywności
wanie
przesuwania
się
widełek
replikacyjnych.
Zjawisko to
NF-κB w fibroblastach skóry ludzkiej ważną funkcję pełzatrzymuje
cykl
w
fazie
S,
co
może
prowadzić
do licznych
ni podjednostka β1 receptora integrynowego powierzchni
mutacji,
a
w
efekcie
do
śmierci
komórki
[35].
komórki. Z tego powodu oceniono ekspresję receptora β1A.
36
Z przeprowadzonych doświadczeń wynika, iż kamptotecyna hamuje biosyntezę kolagenu proporcjonalnie do użytych stężeń. Związek ten jednocześnie pobudza aktywność
prolidazy (dane nie prezentowane). Rozbieżność między
zwiększoną aktywnością prolidazy a zahamowaniem biosyntezy kolagenu nasunęła przypuszczenie, że hamowanie
biosyntezy kolagenu może wynikać z indukcji innych mechanizmów. Z badań tych, wynikło również, że w regulację
aktywności prolidazy i biosyntezy kolagenu zaangażowane
są receptory β1-integrynowe [32].
Ligandem receptorów β1-integrynowych jest kolagen.
Interakcja kolagenu z receptorem integrynowym inicjuje
kaskadę wewnątrzkomórkowego szlaku sygnałowego. Pobudzony receptor β1-integrynowy wywołuje autofosforylację
kinazy białkowej FAK, która następnie oddziaływuje z białkami adaptorowymi Grb i Src, poprzez białka Shc i Shr. Ta interreakcja pozwala na aktywację kaskady białek Sos, Ras, Raf,
a następnie kinaz MAP: ERK1 i ERK2, które indukują czynniki
transkrypcyjne, regulujące ekspresję wielu genów biorących
udział w regulacji wzrostu komórek i ich różnicowaniu [33].
Oceniono ekspresję receptora β1-integrynowego w homogenacie fibroblastów skóry ludzkiej poddanych działaniu
kamptotecyny. Badanie przeprowadzono metodą „Westernimmunoblot”. Badanie wykazało większą zdolność do wiązania przeciwciał przeciwko podjednostce β1 receptora integrynowego homogenatów komórek inkubowanych z CPT
w porównaniu do komórek kontrolnych. Wskazuje to, iż
kamptotecyna pobudza ekspresję receptora β1-integrynowego
w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej.
Przeprowadzone badania wykazały, że kamptotecyna
pobudza ekspresję zarówno receptora β1-integrynowego
jak i czynnika NF-κB. Ekspresja czynnika jądrowego
NF-κB wzrasta proporcjonalnie do użytych stężeń CPT i czasu inkubacji, w porównaniu do komórek kontrolnych. NFκB indukuje transkrypcję genów w odpowiedzi na sygnał z
zewnątrz komórki wywoływany przez cytokiny (np. TNFα),
mitogeny, bakterie, wirusy, leki (np. cykloheksamid), światło UV, stres oksydacyjny, związki przeciwnowotworowe
[17, 19, 20, 22]. W niektórych typach komórek zwiększona
ekspresja NF-κB może zachodzić pod wpływem sygnału generowanego przez receptor β1-integrynowy [34].
W niniejszej pracy wykazano, że ekspresja podjednostki receptora β1 integrynowego powierzchni komórki wzrasta w fibroblastach skóry ludzkiej inkubowanych z CPT,
w porównaniu do komórek kontrolnych. Stymulacja tego
receptora indukuje NF-κB, który odpowiada za hamowanie
ekspresji genów kolagenu oraz pobudza kinazę MAP regulującą aktywność prolidazy. NF-κB i MAPK oddziaływają
między sobą na zasadzie konkurencji [32]. Zahamowanie
genów kolagenu przez NF-κB uniemożliwia biosyntezę tego
białka. Zatem nasilenie aktywności prolidazy pobudzającej
biosyntezę kolagenu na etapie posttranslacyjnym, a obniżeniem biosyntezy kolagenu, w fibroblastach poddanych działaniu CPT nie równoważy inhibitorowego działania NF-κB
na ekspresję genów kolagenu.
Przedstawiony mechanizm inhibitorowego działania
kamptotecyny poprzez receptory β1-integrynowe i NF-κB
na biosyntezę kolagenu może służyć jako model badawczy
do poszukiwania nowych leków stosowanych w terapii chorób związanych z zaburzeniami metabolizmu kolagenu.
Piśmiennictwo
1. Kruszewski S. Zastosowanie zjawisk fotoluminescencji
w badaniach farmaceutycznych oraz w terapii i diagnostyce przeciwnowotworowej. Zakład Fizyki Medycznej; CM UMK, Wiadomości Akademickie Nr 19.
2. Wink M, van Wyk B. Rośliny lecznicze świata. Ilustrowany przewodnik naukowy. Briza Publications
2004, 76.
3. Kruszewski S, Burke T. Właściwości analogów kamptotecyny – obiecujących inhibitorów topoizomerazy I,
oznaczonych metodą spektroskopii fluorescencyjnej.
Polish J Med Phys & Eng. 2002; 8(3): 183-192.
4. Wall M i wsp. Plant antitumor agents. The isolation and
structure of camptothecin, a novel alkaloidal leukemia
and tumor inhibitor from Camptotheca acuminate. J Am
Chem Soc. 1996; 88: 3888-90.
5. Kohn K, Pommier Y. Molecular and Biological Determinants of the Cytotoxic Actions of Camptothecins.
Ann NY Acad Sci. 2000; 922: 11-26.
6. Liu L i wsp. Mechanism of Action of Camptothecin.
Ann NY Acad Sci. 2000; 922: 1-10.
7. Yamamoto Y, Gaynor R. I-κB kinases: key regulators
of the NF-κB pathway. Trends Biochem Sci 2004; 29:
72-79.
8. Omyła - Staszewska J, Deptała A. Inhibitory topoizomerazy I – unikalna grupa leków przeciwnowotworowych. Współcz Onkol 2003. 7; 1: 45-53.
9. Pommier Y. Eucaryotic DNA topoisomerase I: Genome
gatekeeper and its intruders camptothecins. Semin Oncol. 1996; 23: 3-12.
10. Karin M, Ben - Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquination: the control of NF-κB activity. Ann Rev Immunol. 2000; 18: 621-663.
11. Li Z i wsp. Genetic dissection of antigen receptor induced – NF-κB activation. Mol Immunol 2004; 41:
701-714.
12. McKay L, Cidlowski J. Molecular control of immune/
inflammatory responses: interactions between NF-κB
and steroid receptor – signaling pathway. Endocrinol
Rev 1999; 20: 435-459.
13. Boland MP i wsp. Danarubicin activates NF-κB and
induces NF-κB – dependent gene expression in HL60 promyelocytic and Jurkat T lymphoma cells. J Biol
Chem 1997; 272: 12952-12957.
14. Chen F i wsp. New insights into the role of Nuclear Factor-κB in Cell Growth Regulation. Am J Pathol
2001; 159: 387-393.
15. Ghosh S i wsp. NF-κB and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. Ann Rev
Immunol 1998; 16: 225-260.
16. Ji GZ i wsp. Role of transforming growth factor-β1smad signal transduction pathway in patients with hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol 2006; Jan
28; 12(4): 644-648.
17. Lisowska K, Witkowski J. Viral Strategies in Modulation of NF-κB. Activity Arch Immun Ther Exp, 2003,
51, 367-375.
18. Pahl HL. Activators and target genes of Rel /NF-κB
transcription factors. Oncogene 1999; 18: 6853-6858.
37
19. Wang CY i wsp. NF-κB antiapoptosis: induction of
TRAF1 and TRAF2 and cIAP1 and cIAP2 to suppress
caspase-8 activation. Science 1998; 281: 1680-1685.
20. Starska K, Łukomski M. Regulacja Cyklu Komórkowego, Procesu Apoptozy, Wydzielania Cytokin i Cząsteczek
Adhezyjnych w Limfocytach T i innych Komórkach
Krwi Obwodowej oraz w Komórkach Nowotworowych
w Mechanizmie Aktywacji toll-like receptors (TLRs) i
Rodziny Cząsteczek Transkrypcyjnego Czynnika Jądrowego NF-κB. Post Biol Kom 2006; 33, (4): 621-634.
21. Baeuerle PA, Baltimore D. NF-κB: Ten years after. Cell
1996; 87: 13-18.
22. Gilmore TD i wsp. Rel/ NF-κB/I-κB proteins and cancer. Oncogene 1996; 13: 1367-1374.
23. Carson J i wsp. Pharmacogenomic Identification of Targets for Adjuvant Therapy with the Topoisomerase Poison Camptothecin. Cancer Res 2004; 64: 2096-2104.
24. Piret B, Piette J. Topoisomerase poisons activate the
transcription factor NF-κB in ACH-2 and CEM cells.
Nucleic Acids Research 1996; 24: 4242-4248.
25. Qiao L i wsp. Constitutive activation of NF-κB in human
hepatocellular carcinoma: evidence of a cytoprotective
role. Hum Gene Ther 2006 Mar; 17(3): 280-290.
26. Ruland J, Mak TW. From antigen to activation: specific
signal transduction pathways linking antigen receptors
to NF-κB. Semin Immunol 2003; 15: 177-183.
27. Rutkowski R i wsp. Właściwości biologiczne czynnika
transkrypcji jądrowej NF-κB. Alergia Astma Immunologia, 2005; 10(3): 125-131.
28. Deptala A i wsp. Simple assay of activation of nuclear
factor – κB by laser scanning cytometry (LSC). Cytometry 1998; 33: 376-381.
29. Carmichael J i wsp. Evaluation of a tetrazolium-based
semiautomated colorimetric assay: assessment of radiosensitivity. Cancer Res 1987; 47(4): 943-6.
30. Lowry I i wsp. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275.
31. Oyamada I i wsp. Scorbutic and fasted guinea pig sera
contain an insulin-like growth factor I-reversible inhibitor of proteoglycan and collagen synthesis in chick
embryo chondrocytes and adult human skin fibroblasts.
Arch. Biochem. Biophys. 1990; 276(1): 85-93.
32. Miltyk W i wsp. Prolidase independent mechanism of
camptothecin – induced inhibition of collagen biosynthesis in cultured human skin fibroblasts. J. Biochem.
2007; 141(2): 287-292.
33. Ciesielska E. Inhibitory topoizomerazy I – nowa klasa
leków przeciwnowotworowych. Post Biol Kom 1998;
25(4): 613-632.
34. Pałka J. Farmakoterapia nowotworów. Inhibitory angiogenezy. Farmacja Regionu Północno-Wschodniego.
2006; 1(49): 25.
35. Friedland JC i wsp. α6β4-integrin activates Rac – dependent p21-activated kinase 1 to drive NF-κB – dependent
resistance to apoptosis in 3D mammary acini. J Cell Sci
2007; 120 (Pt 20): 3700-12.
Wojciech Miltyk
Samodzielna Pracownia Analizy Leków
Katedra Chemii, Analizy i Technologii Środków Leczniczych
Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
15-089 Białystok, ul. Jana Kilińskiego 1
tel. +48 85 748 57 06, e-mail: [email protected]
38
Substancje biologicznie aktywne i lecznicze obecne
w wybranych gatunkach koniczyn
Biologically active and therapeutic substances from Trifolium species
Joanna Kołodziejczyk, Beata Olas, Barbara Wachowicz
Katedra Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki
Streszczenie
Abstract
Z roku na rok rośnie zainteresowanie różnorodnymi roślinami, jako źródłem substancji o korzystnym, a zarazem
leczniczym działaniu. Z medycznego punktu widzenia,
zainteresowanie gatunkami zaliczanymi do rodzaju Tri‑
folium początkowo wynikało z zawartości izoflawonów
o aktywności fitoestrogenowej. Większość gatunków koniczyn należących do rodzaju Trifolium nie została jeszcze jak do tej pory scharakteryzowana pod względem
chemicznym. Wiadomo jednak, że koniczyny zawierają szereg związków o potencjalnej aktywności biologicznej, takich jak flawonoidy, saponiny, clovamid oraz
inne polifenole. Najbardziej znana koniczyna czerwona
(T. pratense) jest od dawna stosowana w medycynie tradycyjnej w leczeniu schorzeń dermatologicznych, zaburzeń
oddechowych (kaszel, astma), a nawet w leczeniu nowotworów. W medycynie współczesnej ekstrakty z tej koniczyny są źródłem fitoestrogenów wchodzących w skład
wielu preparatów łagodzących dolegliwości związane
z menopauzą. Prezentowana praca stanowi przegląd dostępnych informacji dotyczących biologicznej aktywności
związków zawartych w wybranych gatunkach koniczny
i ich potencjalnego zastosowania w profilaktyce i leczeniu
różnych chorób.
The growing scientific interest in herbal bioactive substances yields new information about various species
with remarkable medical importance. Trifolium species
were originally identified to possess estrogenic activity,
because of their content of isoflavones. Therefore these
plants have been studied mainly in respect to the phytoestrogens, however their beneficial properties may be also
attributed to other biologically active substances present
in these herbs. The majority of Trifolium species have not
been characterized phytochemically, however the main
constituents of the most common clovers have been established - they are a source of various compounds such
as flavonoids, saponins, clovamides and other phenolic
compounds. Red clover (Trifolium pratense) has been traditionally used in the treatment of chronic skin diseases,
cancer and respiratory problems (e.g. whooping cough,
asthma). Currently, it is an ingredient of various dietary
supplements and herbal medicines, consuming as alternatives to estrogen replacement therapy. This review presents the available data on the biological actions of various
clovers and their potential using in prophylaxis or clinical
routine.
Wstęp
Rodzaj Trifolium (z rodziny bobowatych (Fabaceae))
obejmuje około 300 gatunków koniczyn. Część z nich jest
od dawna znana i stosowana w medycynie tradycyjnej wielu kultur, jednak większość gatunków nie została jak do tej
pory zbadana pod względem zawartości składników o potencjalnej aktywności biologicznej. Najwięcej jest danych
dotyczących gatunków koniczyn wykorzystywanych w rolnictwie, takich jak. T. pratense (koniczyna czerwona), T. re‑
pens (koniczyna biała), T. resupinatum (koniczyna skręcona
większa), T. incarnatum (koniczyna krwistoczerwona), a także kilku innych popularnych gatunków: T. hybridum (koniczyna białoróżowa), T. pannonicum (koniczyna pannońska),
T. subterraneum (koniczyna perska), T. fragiferum (koniczyna rozdęta), w których zidentyfikowano saponiny, izoflawonoidy i inne związki fenolowe [1, 2]. Najlepiej poznana,
koniczyna czerwona (koniczyna łąkowa, kądziołka, T. pra‑
tense) jest uważana w medycynie ludowej za lek ziołowy
pomocny w zaburzeniach hormonalnych (również zaburze-
niach związanych z menopauzą) i towarzyszących im bólach piersi, dolegliwościach układu oddechowego (kaszel,
astma), środek moczopędny i przeciwobrzękowy, a także
wspomagający leczenie nowotworów [3-5]. W lecznictwie
ludowym stosowane jest ziele koniczyny czerwonej – Trifolii
rubri herba i kwiat koniczyny czerwonej - Trifolii rubri flos,
zebrane w początkowym okresie zakwitania rośliny i wysuszone szybko w warunkach naturalnych lub w suszarniach
w temperaturze 35 ˚C. Oba surowce zawierają różne flawonoidy, antocyjany, kwasy fenolowe czy garbniki. W Polsce
bardzo pospolitym gatunkiem jest także koniczyna biała
(koniczyna rozesłana, T. repens), której ziele, jak i kwiat są
stosowane w lecznictwie ludowym. Ziele oraz kwiat koniczyny białej jest dobrym źródłem garbników, flawonoidów.
Zawierają też małe ilości olejku. Garbniki zawarte w wyciągu z ziela działają przeciwbiegunkowo, natomiast kwiat jest
składnikiem mieszanek przeciwreumatycznych [6].
Poszczególne gatunki koniczyn różnią się jednak bardzo znacznie pod względem zawartości poszczególnych
substancji o aktywności biologicznej, a większość z tych
39
Ryc. 1. Izoflawony
i 17-β-estradiol (B).
obecne
w
koniczynach
(A)
roślin nie została jeszcze scharakteryzowana chemicznie
i biochemicznie. Prezentowana praca stanowi przegląd dostępnych danych literaturowych na temat aktywności biologicznej, oraz potencjalnego zastosowania profilaktycznego
i leczniczego związków obecnych w znanych (lub dopiero
poznawanych) gatunkach koniczyn i uzyskiwanych z nich
ekstraktach.
Substancje biologicznie aktywne obecne
w różnych gatunkach z rodzaju Trifolium
Flawonoidy i izoflawony
Izoflawony stanowią grupę flawonoidów wykazujących podobieństwo strukturalne do estrogenów, co umożliwia im wiązanie się do receptorów dla tych hormonów
i regulację ekspresji określonych genów. Wyróżnia się
dwa podstawowe typy receptorów estrogenowych: ER-α
i ER-β, które są kodowane przez różne geny i ulegają
ekspresji w różnych regionach organizmu. Fitoestrogeny
ze względu na podobieństwo do 17-β-estradiolu (Ryc. 1.)
wiążą się głównie do receptorów ER-β. Dostępne dane
wskazują, że dieta bogata w składniki roślinne o działaniu
estrogenowym może ograniczać dolegliwości związane
z menopauzą, zmniejszać częstość występowania osteoporozy, chorób układu krążenia i nowotworów hormono-zależnych [7]. Ekstrakty z roślin o wysokiej zawartości izoflawonów (głównie genisteiny, daidzeiny, biochaniny A i formononetyny), uzyskiwane m.in. z koniczyny
czerwonej stosowane są do zmniejszania dolegliwości
towarzyszących menopauzie [8]. Wykazano ponadto, że
izoflawony obecne w koniczynie czerwonej i soi stymulują śródbłonek do wydzielania prostacykliny, ważnego
czynnika rozkurczającego naczynie krwionośne, zmniejszającego ciśnienie krwi i hamującego agregację płytek
krwi [9].
Oleszek i wsp. [10] przeanalizowali 57 gatunków koniczyn, analizując je pod względem zawartości różnych związków fenolowych, takich jak fenolokwasy, izoflawony i inne
flawonoidy oraz clovamid i jego pochodne. Pod względem
zawartości izoflawonów, w badaniach tych uwagę zwraca-
40
ją 3 gatunki Trifolium: T. heldreichianum, T. scabrum oraz
T. subterraneum, zawierający ok. 7-9% tych związków
w suchej masie. Stężenie izoflawonów w innych badanych
gatunkach koniczyn również było wysokie, ale porównywalne z koniczyną czerwoną (T. pratense), która jest uznanym
źródłem tych związków. Badania Polasek i wsp. [11] wykazały natomiast, że obiecującym źródłem izoflawonów mogą
być także T. pallescens i T. alpinum (koniczyna alpejska).
Oprócz fitoestrogenów, koniczyny zawierają również
inne związki zaliczane do flawonoidów, m.in. kwercetynę
i kempferol [12, 13], wykazujące różnorodną aktywność
biologiczną. Kwercetyna jest związkiem o stwierdzonej
aktywności antyoksydacyjnej. Polifenol ten jest zmiataczem
reaktywnych form tlenu i azotu, m.in. nadtlenoazotynu
i rodnika hydroksylowego [14]. Wykazano jej istotną rolę
w przeciwdziałaniu peroksydacji lipidów, a także właściwości chelatujące. Dostępne dane wskazują również, że
związek ten jest szczególnie skuteczny w przeciwdziałaniu uszkodzeniom powodowanym przez alkohol (etanol).
Stwierdzono, że kwercetyna chroni wątrobę przed stresem
oksydacyjnym zarówno poprzez zmiatanie rodników nadtlenkowych, jak i pośrednio, powodując wzrost poziomu
glutationu (GSH), ważnego endogennego antyoksydanta
[15, 16]. Kempferol jest jednym z głównych aktywnych biologicznie składników, obecnych w wielu ziołach wykorzystywanych od wieków w tradycyjnej medycynie chińskiej.
Kempferol wykazuje działanie antyoksydacyjne, a Badania
Xu i wsp. wskazują również na jego korzystny wpływ na
układ krążenia, ponieważ posiada działanie rozkurczające
ścianę naczynia krwionośnego [17].
Koniczyny zawierają również istotne dla zdrowia człowieka związki, takie jak proantocyjanidyny, w tym katechiny.
Katechiny stanowią grupę związków o działaniu przeciwmiażdżycowym, wynikającym m.in. z ich przeciwutleniającej, antypłytkowej i przeciwzapalnej aktywności. Związki
te zapobiegają utlenianiu LDL efektywniej niż α-tokoferol,
a poprzez hamowanie aktywacji płytek krwi mogą działać
przeciwzakrzepowo [18]. (-)-Epikatechina jest uważana za
ważny egzogenny antyoksydant chroniący komórki przed
uszkodzeniami wywołanymi działaniem nadtlenoazotynu,
reaktywnej formy tlenu o silnym działaniu utleniającym
i nitrującym [19].
Saponiny
Saponiny posiadają bardzo zróżnicowane właściwości
biochemiczne i biologiczne. Mogą nadawać słodki lub gorzki smak roślinom, posiadają także właściwości emulgujące, co wykorzystuje się m.in. w przemyśle kosmetycznym
i farmaceutycznym [20]. Są trujące dla zwierząt zmiennocieplnych, natomiast ich działanie toksyczne w stosunku
do zwierząt stałocieplnych jest znikome, co może wynikać
ze słabej przyswajalności tych substancji przy podawaniu
drogą pokarmową. Ekstrakty z wielu roślin zawierające saponiny są stosowane od dawna w medycynie ludowej wielu
kultur [21]. Wiadomo, że związki te wykazują właściwości
hemolityczne. Saponiny są detergentami, mogą więc powodować niszczenie błony erytrocytów, ich pękanie i wyciek
hemoglobiny [22]. Stwierdzono także ich przeciwzapalne
działanie [23-25].
Możliwości zastosowania roślin
z rodzaju Trifolium w profilaktyce
i leczeniu różnych chorób
Działanie fitoestrogenowe
Szczególną uwagę zwraca się na zawarte w koniczynach
izoflawonoidy ze względu na ich aktywność estrogenową.
Liczne badania wskazują, że fitoestrogeny są pomocne
w terapii zaburzeń związanych z menopauzą, mogą także
znacząco obniżać ryzyko choroby wieńcowej i nowotworów hormonozależnych, takich jak rak piersi, czy gruczołu
krokowego [26]. Dlatego też preparaty roślinne zawierające
izoflawony stanowią składnik wielu suplementów i produktów wspomagających leczenie. Ponieważ głównym źródłem
tych związków oprócz nasion soi jest koniczyna czerwona,
zwraca się coraz większą uwagę na tę i inne rośliny należące do rodzaju Trifolium. W liściach i łodydze koniczyny
czerwonej wykazano obecność 31 związków o charakterze
izoflawonów, w korzeniu 25, a w kwiatach 26 [27]. Koniczyna ta jest źródłem m.in. formononetyny, biochaniny A,
daidzeiny i genisteiny [28, 29]. Pojawia się coraz więcej danych dotyczących zastosowania suplementacji tych substancji w profilaktyce niektórych nowotworów i chorób układu
krążenia. Badana kliniczne wskazują, że 4-tygodniowa terapia izoflawonami z koniczyny czerwonej powoduje wzrost
poziomu lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) u kobiet
[30]. Badania nad przeciwnowotworowym działaniem fitoestrogenów zawartych w koniczynie czerwonej wskazują,
że mogą mieć one istotne znaczenie w hamowaniu postępu zmian nowotworowych. Nie stwierdzono ponadto występowania skutków ubocznych, charakterystycznych dla
terapii estrogenowej stosowanej w raku prostaty, a więc
zwiększenia potencjału prokoagulacyjnego krwi i aktywacji
płytek krwi, prowadzących do powikłań zakrzepowo-zatorowych [31]. Ekstrakt z koniczyny czerwonej posiada także
właściwości antyangiogenne i przeciwzapalne, co zwiększa jego wartość terapeutyczną jako potencjalnego leku
w chemoprewencji nowotworów i innych chorób związanych z przewlekłym stanem zapalnym [32]. Stwierdzono
też, że ekstrakt z koniczyny czerwonej działa przeciwmiażdżycowo poprzez zmniejszenie ekspresji białek adhezyjnych ICAM-1 i VCAM-1 na leukocytach, co ogranicza
ich przyleganie do śródbłonka [33]. Genisteina obecna
w różnych koniczynach, wykazuje aktywność przeciwnowotworową, wynikającą ze zdolności wpływania na funkcjonowanie receptorów estrogenowych, kinaz tyrozynowych
i topoizomerazy. Przeciwnowotworowe działanie genisteiny potwierdzono w badaniach nad rakiem prostaty i piersi.
Wykorzystanie hodowli komórkowych pozwoliło wykazać,
że izoflawon ten wykazuje działanie antyproliferacyjne zarówno w stosunku do komórek estrogenozależnych, jak i estrogenoniezależnych [34]. Biochanina A natomiast posiada
właściwości przeciwzapalne, które mogą mieć zastosowanie
w zapobieganiu chorobom neurodegeneracyjnym. Stwierdzono, że poprzez hamowanie aktywacji komórek mikrogleju i generowania czynników prozapalnych, związek ten
chroni neurony dopaminergiczne przed uszkodzeniami wywołanymi przez lipopolisacharyd bakteryjny (LPS) [35].
Zarówno bogaty w izoflawony ekstrakt z koniczyny czer-
wonej, jak i fitohormony genisteina oraz biochanina A mogą
mieć również działanie lecznicze w terapii zespołu metabolicznego, z uwagi na zdolność wiązania się do receptora γ
aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPARγ)
[36]. Zespół metaboliczny obejmuje szereg czynników,
takich jak otyłość, podwyższone stężenie trójglicerydów
we krwi ≥150 mg/dl, obniżone stężenie HDL-cholesterolu
(mężczyźni < 40 mg/dl, kobiety < 50 mg/dl), ciśnienie tętnicze ≥130/≥85 mmHg oraz glikemia na czczo ≥100 mg/dl.
Jednoczesne występowanie już 2-3 tych zaburzeń wiąże się
ze zwiększeniem ryzyka rozwoju miażdżycy, cukrzycy typu
2 i powikłań sercowo-naczyniowych [37]. Główną fizjologiczną rolą receptora PPARγ jest regulacja transkrypcji genów dla białek biorących udział w różnicowaniu adipocytów
i w metabolizmie lipidów. Poza regulacją gospodarki lipidowej, receptor PPARγ reguluje także przemiany węglowodanów. Aktywatory receptora pobudzają glikolizę
i zmniejszanie glukoneogenezy w hepatocytach, regulują poziom insuliny i zmniejszają ciśnienie tętnicze [38]. Ekstrakt
z koniczyny czerwonej, genisteina, biochanina A oraz ich
metabolity są ligandami aktywującymi PPARγ. Z tego
względu sugeruje się możliwość ich leczniczego zastosowania jako czynnika ograniczającego część procesów patologicznych składających się na zespół metaboliczny [36].
Aktywność antyoksydacyjna
Badania nad zawartością związków biologicznie aktywnych w roślinach należących do rodzaju Trifolium wskazują
na dużą zawartość związków polifenolowych o dobrze już
znanej lub badanej aktywności antyoksydacyjnej. Wykazano
m.in., że kwiaty koniczyny białej są źródłem wielu polifenoli o aktywności przeciwutleniającej, takich jak kwercetyna,
galokatechina, epigalokatechina, kempferol i inne [39]. Zawarta w koniczynie czerwonej formonetyna, oprócz aktywności estrogenowej może być efektywnym antyoksydantem.
Wykazano, że fitohormon ten przeciwdziała skutkom stresu
oksydacyjnego. W badaniach in vivo na zwierzętach, podawanie formonetyny powodowało zmniejszenie peroksydacji lipidów oraz wzrost aktywności głównych enzymów
antyoksydacyjnych: dysmutazy ponadtlenkowej (SOD),
katalazy oraz peroksydazy glutationowej zawierającej selenocysteinę (GSH-Px) [40]. Sabudak i wsp. [41] jako pierwsi
stwierdzili, że również T. resupinatum posiada przeciwutleniające i przeciwzapalne właściwości. Zaobserwowali
oni, że ekstrakt z tej rośliny efektywnie chroni lipidy przez
peroksydacją, co prawdopodobnie związane jest ze zmiataniem wolnych rodników przez zawarte w nim flawonoidy.
Autorzy podkreślają także biologiczną aktywność triterpenów saponin, związków o bardzo zróżnicowanej aktywności, obejmującej działanie przeciwzapalne, antyalergiczne
i przeciwnowotworowe.
Również inny, dotąd mało znany gatunek – T. pallidum
wydaje się być obiecującym źródłem fitozwiązków o działaniu leczniczym. Nadziemne części tej koniczyny oprócz
izoflawonów, kwasów fenolowych i flawonoidów zawierają
duże ilości clovamidu - 13 mg/g suchej masy. T. pallidum
jest najzasobniejszą w ten związek rośliną poznaną do tej
pory. Właściwości tego gatunku dopiero zaczynają być badane, jak dotąd nie ma żadnej polskojęzycznej nazwy dla
41
Ryc. 2. Struktura: clovamidu (A), kwasu kawowego (B)
i kwasu rozmarynowego (C).
tej koniczyny. Występuje ona w Europie, zachodniej Azji
i Północnej Afryce. T. pallidum przebadano jedynie pod
względem zawartości związków fenolowych. Clovamid
(N-kawoilo-L-DOPA) jest pochodną kwasu kawowego,
a pod względem struktury jest bardzo podobny do kwasu
rozmarynowego (Ryc. 2.), związków o właściwościach antyoksydacycjnych [42]. Po raz pierwszy zidentyfikowano
go w koniczynie czerwonej [43]. Dotychczas dla celów naukowych clovamid izolowano z ziaren kakaowca. W różnorodnych badaniach wykazano zdolność tego związku do
neutralizacji wolnych rodników przewyższającą zdolności
kwasu galusowego i kwercetyny [44, 45]. Pochodne clovamidu także wykazują właściwości antyoksydacyjne, zbliżone a nawet większe w porównaniu do znanych przeciwutleniaczy - kwasu askorbinowego i α-tokoferolu. Szczególnie
silne działanie chroniące lipidy przed utlenianiem wykazały
ester metylowy N-kawoilo-L-tyrozyny i ester alkilowy N-kawoilo-L-dihydroksyfenyloalaniny [46].
Piśmiennictwo
1. Sakamoto S, Kfuji S, Kuroyanag, M, Ueno A, Sekita S.
Saponins from Trifolium repens. Phytochemistry 1992;
31: 1773-1777.
2. Stochmal A, Oleszek W. The changes of cyanogenic
glucosides in white clover (Trifolium repens L.) during the growing season. J Agric Food Chem 1997; 11:
4333–4336.
3. Red clover (Trifolium pratense). In: Coates P, Blackman
M, Cragg G, et al., eds. Encyclopedia of Dietary Supplements. New York, NY: Marcel Dekker; 2005: 587602.
4. Tice JA, Ettinger B, Ensrud K. i wsp. Phytoestrogen
supplements for the treatment of hot flashes: the Isoflavone Clover Extract (ICE) study. J Am Med Assoc
2003; 290(2): 207-214.
5. Fugh-Berman A, Kronenberg F. Red clover (Trifolium
pratense) for menopausal women: current state of
knowledge. Menopause. 2001; 8(5): 333-337.
6. Strzelecka H, Kowalsi J. Encyklopedia zielarstwa i ziołolecznictwa. Wyd. naukowe PWN Warszawa 2000,
wyd. 1, 242-243.
7. Kurzer MS, Xu X. Dietary phytoestrogens. Annu Rev
Nutr 1997; 17: 353-381.
42
8. Occhiuto F, Zangla G, Samperi S, Palumbo DR, Pino A,
De PasqualeR, Circosta C. The phytoestrogenic isoflavones from Trifolium pratense L. (Red clover) protects
human cortical neurons from glutamate toxicity. Phytomedicine 2008; 15: 676-682.
9. García-Martínez MC, Hermenegildo C, Tarín JJ, Cano
A. Phytoestrogens increase the capacity of serum to stimulate prostacyclin release in human endothelial cells.
Acta Obstet Gynecol Scand 2003; 82(8): 705-710.
10. Oleszek W, Stochmal A, Janda B. Concentration of isoflavones and other phenolics in the aerial parts of Trifo‑
lium species. J Agri Food Chem 2007; 55: 8095-8100.
11. Polasek J, Queiroz EF, Hostettmann K. On-line identification of phenolic compounds of Trifolium species using
HPLC-UVMS and post-column UV-derivatisation. Phytochem Anal 2007; 18: 13-23.
12. Isik E, Sabudak T, Oksuz S. Flavonoids from Trifolium
resupinatum var. microcephalum. Chemistry of Natural
Compounds 2007; 43(5): 506-507.
13. Sharaf M. Chemical constituents from the seeds of Trifolium
alexandrinum. Nat Prod Res 2008; 22(18): 1620-3162.
14. Boots AW, Haenen GR, Bast A. Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical. Eur J Pharmacol 2008; 585(2-3): 325-337.
15. Molina MF, Sanchez-Reus I, Iglesias I, Benedi J. Quercetin, a flavonoid antioxidant, prevents and protects
against ethanol-induced oxidative stress in mouse liver.
Biol Pharm Bull 2003; 26(10): 1398-1402.
16. Bischoff SC. Quercetin: potentials in the prevention and
therapy of disease. Curr Opin Clin Nutr Metab Care
2008; 11(6): 733-340.
17. Xu YC, Yeung DKY, Man RYK, Leung SWS. Kaempferol enhances endothelium-independent and dependent
relaxation in the porcine coronary artery. Mol Cell Biochem 2006; 287: 61-67.
18. Auger C, Al-Awwadi N, Bornet A i wsp. Catechins and
procyanidins in Mediterranean diets. Food Res Int 2004;
37: 233-245.
19. Schroeder P, Klotz L-O, Sies H. Amphiphilic properties
of (-)-epicatechin and their significance for protection
of cell against peroxynitrite. Biochem Biophys Res
Commun 2003; 307: 69-73.
20. Vincken J-P, Heng L, de Groot A, Gruppen H. Saponins,
classification and occurrence in the plant kingdom. Phytochemistry 2007; 68: 275-297.
21. Sparg SG, Light ME, van Staden J. Biological activities
and distribution of plant saponins. J Ethnopharmacol
2004; 94: 219-243.
22. Baumann E, Stoya G, Völkner A, Richter W, Lemke
C, Linss W. Hemolysis of human erythrocytes with saponin affects the membrane structure. Acta Histochem
2000; 102: 21-35.
23. Just MJ, Recio MC, Giner RM, Cuéllar MJ, Mañez
S, Bilia AR, Rios J-L. Anti- inflammatory activity of
unusual lupane saponins from Bupleurum fruticescens.
Planta Med 1998; 64: 404-407.
24. Navarro P, Giner RM, Recio MC, Máñez S, CerdáNicolas M., Rios JL. In vivo anti-inflammatory activity
of saponins from Bupleurum rotundifolium. Life Sci 68;
1199–1206.
25. Sirtori CR. Aescin: Pharmacology, pharmacokinetics and
therapeutic profile. Pharmacol Res 2001; 44: 183-193.
26. Adlercreutz H, Mazur W. Phytoestrogens and Western
diseases. Ann Med 1997; 29: 95-120.
27. Wu Q, Wang M, Simon JE. Determination of isoflavones
in red clover and related species by high-performance
liquid chromatography combined with ultraviolet and
mass spectrometric detection. J Chromatogr A 2003;
1016: 195-209.
28. Liu J, Burdette JE, Xu H, Gu C, van Breemen RB, Bhat
KP, Booth N i wsp. Evaluation of estrogenic activity of
plant extracts for the potential treatment of menopausal
symptoms, J Agri Food Chem 2001; 49: 2472-2479.
29. Beck V, Unterrieder E, Krenn L, Kubelka W, Jungbauer
A.Comparison of hormonal activity (estrogen, androgen and progestin) of standardized plant extracts for large scale use in hormone replacement therapy. J Steroid
Biochem Mol Biol 2003; 84: 259-268.
30. Campbell MJ, Woodside JV, Honour JW, Morton MS,
Leathem AJC. Effect of red clover-derived isoflavone
supplementation on insulin-like growth factor, lipid and
antioxidant status in healthy female volunteers: a pilot
study. Eur J Clin Nutr 2004; 58: 173-179.
31. Jarred RA, Keikha M, Dowling C, McPherson SJ, Clare AM,
Husband AJ, Pedersen JS, Frydenberg M, Risbridger GP. Induction of apoptosis in low to moderate-grade human prostate
carcinoma by red clover-derived dietary isoflavones. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 2002; 11: 1689-1696.
32. Krenn L, Paper DH. Inhibition of angiogenesis and inflammation by an extract of red clover (Trifolium pra‑
tense L.). Phytomedicine 2009; 16:1083-1088.
33. Simoncini T, Garibaldi S, Fu XD, Pisaneschi S, Begliuomini S, Baldacci C, Lenzi E, Goglia L, Giretti MS,
Genazzani AR Effects of phytoestrogens derived from
red clover on atherogenic adhesion molecules in human
endothelial cells. Menopause 2008; 15(3): 542-550.
34. Grynkiewicz G, Achmatowicz O, Pucko W. Bioaktywny izoflawon genisteina - perspektywy zastosowań medycznych. Post Fitoter 2000; 3:15-20.
35. Chena H-Q, Jin Z-Y, Li G-H. Biochanin A protects dopaminergic neurons against lipopolysaccharide-induced damage through inhibition of microglia activation
and proinflammatory factors generation. Neurosci Lett
2007; 417: 112-117.
36. Mueller M, Jungbauer A. Red clover extract: a putative
source for simultaneous treatment of menopausal disorders and the metabolic syndrome. Menopause 2008;
15(6): 1120-1131.
37. Wożakowska-Kapłon B, Bartkowiak R, Stępień A. Zespół metaboliczny – epidemia naszych czasów, nowa
definicja, cele działań prewencyjnych i leczniczych.
Przew Lek 2005; 6: 32-38.
38. Gacka M, Adamiec R. Nadciśnienie tętnicze a funkcja
receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów γ. Arterial Hypertension 2003; 7: 281-285.
39. Foo LY, Lu Y, Molan AL, Wood DR, McNabb WC. The
phenols and prodelphinidins of white clover flowers.
Phytochemistry 2000; 54: 539-548.
40. Mu H, Bai Y-H, Wang S-T, Zhu Z-M, Zhang Y-W. Research on antioxidant effects and estrogenic effect of formononetin from Trifolium pratense (red clover). Phytomedicine 2009; 16: 314-319.
41. Sabudak T, Dokmeci D, Ozyigit F, Isik E, Aydogdu N.
Antiinflammatory and Antioxidant Activities of Trifo‑
lium resupinatum var. microcephalum extracts. Asian J
Chem 2008; 20: 1491-1496.
42. Shahidi F, Chandrasekara A. Hydroxycinnamates and
their in vitro and in vivo antioxidant activities. Phytochem Rev (2010) 9: 147–170.
43. S zajwaj B, Stochmal A, Mołdoch J, Janda B, Oleszek W. Preparative isolation of clovamide from Tri‑
folium pallidum aerial plants. Bioactive Plant Compounds - Structural and Applicative Aspects 2009;
56: 10-11.
44. Arlorio M, Locatelli M, Travaglia F, Coïsson J-D,
Del Grosso E, Minassi A, Appendino G, Martelli A.
Roasting impact on the contents of clovamide (Ncaffeoyl-L-DOPA) and the antioxidant activity of cocoa beans (Theobroma cacao L.). Food Chem 2008;
106: 967-975.
45. Sanbongi C, Osakabe N, Natsume M, Takizawa T,
Gomi S, Osawa T. Antioxidative polyphenols isolated
from Theobroma cacao. J Agric Food Chem 1998; 46:
454-457.
46. Ley JP, Bertram HJ. Synthesis of lipophilic clovamide derivatives and their antioxidative potential against lipid peroxidation. J Agric Food Chem 2003; 51:
4596-4602.
Joanna Kołodziejczyk
Katedra Biochemii Ogólnej
Uniwersytet Łódzki
ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź
tel. +48 42 635 44 82,
43
INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OF
MANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY
1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewed
transdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicine and related sciences. The journal publishes conference
reports and materials, conference announcements, as well as
letters to the Editor.
2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printed
and an electronic form. Electronic versions of articles are to be
sent to [email protected] or supplied on
CD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagrams
and figures) should be addressed to:
3.
4.
5.
6.
7.
8.
44
Scientific Review in Pharmacy
41-200 Sosnowiec
ul. Jedności 8
Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345
Fax: +48 32 364 11 58
Disk label should contain the first name(s) and surname(s)
of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphics
should be included in separate files. Do not paste pictures and
graphics to text files. The Editor advises to use Star Office,
Word, or Word Perfect. The acceptable graphics format is *.
TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi.
All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief. The Authors are encouraged to suggest their reviewers, however the final selection of a reviewer is up to the Editorial Board. The Editor-in-Chief reserves the right to correct or
abbreviate the text (after the Author’s approval).
Authors are requested to resubmit the revised manuscript
within four weeks. Papers that are not resubmitted within
four weeks will be treated as a new submission.
The manuscript that has been rejected by the Scientific
Review in Pharmacy should not be resubmitted.
A cover letter should be included with the manuscript, containing a declaration that the manuscript has not been previously
published in print or electronic format and is not under consideration by another journal or electronic medium, signed by all
the Authors. It should also include written approval from the
head of the institution in which the study was conducted.
All human and animal research will have obtained ethical consent from the local Bioethical or Ethical Committee.
The material sent in and the review will remain among the
documentation of the Board of Editors.
Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the whole
of the copyrights for the published papers (including the right
to publishing in print, on electronic media, such as CD-ROM
disks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries is
allowed without any written permission of the Editor.
Instructions for authors:
8.1. Manuscript Page Setup
• Paper: white, A4 format.
• Margins: 2.5 cm (top, left, right, bottom)
• Font: Times New Roman, no smaller than 12 points.
• Text: Double-spaced, one side of the page only.
• Numbering: Insert page numbers at bottom right of each
page.
• Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extra
line space between paragraphs.
• Subheads: All subheads should be flush with the left margin,
with one line above. Indent first line after a subhead. Use an
extra line space between the subhead and the text.
• Title or Heading of the article: boldface, on separate
line.
• Second-level subhead: boldface, on separate line.
• Third-level subhead: italic, on separate line.
8.2. Organization of Manuscript
• Title page should include: submission date and Author(s)
full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’
full current affiliations (for papers with multiply authors,
please enumerate the authors and their affiliations in the
following way: Author1, Author2, etc; 1Affiliation, 2Affiliation,
etc.). Affiliations should contain the full name of the institution. One corresponding author must be designated for
papers with coauthors. At the bottom of the page the full
name, academic degrees/titles, and address of the corresponding author should be given, including the telephone
number, fax number and/or e-mail address. If research
has been funded, please indicate the source of funding
(including grant index/symbol, grant agencies, corporations, or sponsors).
• The second page should include an abstract (150-250
words). The abstract must be self-contained, and must not
require reference to the paper to be understood. The abstract should present objectives and scope of the study or
reasons for writing the paper. The methods and techniques
or approaches should be described only to the extent necessary for comprehension. The findings and conclusions
should be concise and informative. The abstract should
be followed by the key words consistent with the Medical
Subject Headings Index Medicus, and should not contain
unfamiliar terms that are not defined, undefined acronyms
and reference citations. Neither displayed equations or
lists should appear in the abstract.
• Body text should be organized as follows:
original paper - introduction, material and methods descriptions, research results, discussion;
review papers – free structure;
case studies – introduction (motivation for the study), case
descriptions, discussion of the characteristic symptoms,
treatment results etc.
• Figures (diagrams, drawings, color or black-and-white
photographs) should be put into a separate envelope. On
each figure there should be its number (Arabic numerals),
the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking.
Figure captions should be placed on separate pages and
numbered consecutively using Arabic numerals. Previously published visual materials should be supplied together
with the written consent of the Publisher for reprint.
• Tables, each on a separate page, should be numbered
using Roman numerals and preceded by their captions.
Table captions should be placed on separate pages, numbered using Roman numerals.
• The papers should not exceed the following limitations:
original and review work – 10 pages and others – 5 pages.
8.3. References to the works cited should be presented at the end of the paper and arranged according to the sequence
of citations in the body text. The acronyms for journal titles
should be used according to Index Medicus. Each entry,
starting with a new line, should be given a number and
must be presented as follows:
• journal citation:
Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic
multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117:
557-67.
If there are more than three authors, the name of the first
one should be given, followed by an ,,et al” annotation.
Komosińska-Vassev K et al. Graves’ disease-associated
changes in the serum lysosomal glycosidases activity and
glycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331:
97-102.
• the specific chapter:
Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. Biochemia
Harpera. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.
Warszawa 1994, 59-69.
• monograph:
Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw
2004.
References to the works cited within the text should be numbered using Arabic numerals and placed between brackets,
e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations: original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliography entries.
REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM
1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowane prace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe, z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych. Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na temat
konferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji.
2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłać w formie elektronicznej na adres: kolegium.redakcyjne@
kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dysku CDROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego
(z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji:
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
41-200 Sosnowiec
ul. Jedności 8
Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345
Fax: +48 32 364 11 58
Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów)
i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory.
Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych.
Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word,
Word Perfect. Akceptowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor:
CMYK, rozdzielczość 300 dpi.
Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonych każdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca się
autorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcja
zastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta,
jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniu z autorem).
Autorzy proszeni są o odesłanie poprawionego manuskryptu, zgodnie z uwagami recenzenta, w terminie nieprzekraczającym czterech tygodni. W przeciwnym razie
praca będzie traktowana jako nowa publikacja.
Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta nie
może być ponownie przedkładany Redakcji Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego.
Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie była
uprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcji
innego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawierać również podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodę
Kierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczenie
publikacji w czasopiśmie.
Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, które
są przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, muszą
mieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej.
Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacji Redakcji.
Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskich
do wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, na
nośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszcza się natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy.
Instrukcje dla autorów
8.1.Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu:
• Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, na
białym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnego
odstępu między kolejnymi wierszami.
• Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny).
• Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt.
• Numeracja stron – kolejne numery stron, począwszy od
strony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnym rogu.
• Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowych odstępów pomiędzy kolejnymi akapitami.
• Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównane
do lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstem należy wprowadzić jeden odstęp.
• Tytuł pracy – powinien być napisany pogrubioną czcionką.
• Tytuł rozdziału – powinien być napisany pogrubioną
czcionką.
• Tytuł podrozdziału – powinien być napisany pochyloną
czcionką,
8.2 Układ manuskryptu
• Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowych przy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afilia-
3.
4.
5.
6.
7.
8.
cję każdego z nich, w następujący sposób Autor1, Autor2,
…; 1Afiliacja, 2Afiliacja; tytuł pracy w języku polskim i angielskim, nazwę placówki naukowej skąd pochodzi praca.
U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres,
telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję, dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanych prosimy o wskazanie źródła finansowania (w tym
numery dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lub
sponsorów).
• Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie (150-250 słów w języku polskim i angielskim), będące
autonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczać odnośników literaturowych. Streszczenie powinno
zawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawowe
procedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych, metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Pod
streszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w języku
polskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject Headings
Index Medicus.
• Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały,
według następującego schematu:
prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań,
dyskusja oraz wnioski;
prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziały i podrozdziały;
prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby, charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp.
• Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe) powinny być umieszczone w osobnej kopercie, ponumerowane, opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy,
z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać na
oddzielnej stronie z numerami ilustracji podanymi cyframi arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane, należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy na
ponowną publikację.
• Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należy ponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułami
umieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać na
oddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframi
rzymskimi.
• Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinna
wynosić 10, a pozostałych – 5 stron.
8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowania w tekście pracy.
Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z Index
Medicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza,
powinna być opatrzona numerem oraz zredagowana
zgodnie z niżej podanym przykładem:
• czasopismo naukowe:
np.: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic
multisystem fibrotic
disorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67.
Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podać nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.
np.: Komosińska-Vassev K i wsp. Graves’ disease-associated changes in the serum lysosomal glycosidases activity
and the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003;
331: 97-102.
• wydawnictwo zbiorowe:
np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: Biochemia Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1994, 59-69.
• monografia:
np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław
2004.
Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych, powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1].
Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracach
oryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do
10 pozycji.
45
PRENUMERATA
Prosimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literami
i dokonanie wpłat na poczcie lub w banku.
Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu.
Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej prenumeraty otrzymają Państwo po około 2 tygodniach
od dokonania wpłaty.
Dodatkowych informacji udziela Dział Prenumeraty
i Kolportażu:
6
WYDAWCA
Nr rachunku odbiorcy:
0
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiego
ul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Biała
TEL. 033 817 38 99
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
ODBIORCA:
kwota:.......................................................................................
wpłacający:..............................................................................
.................................................................................................
.................................................................................................
Zamawiam
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
Nr ............
Nr rachunku odbiorcy:
0
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
ODBIORCA:
kwota:.......................................................................................
wpłacający:..............................................................................
.................................................................................................
.................................................................................................
Zamawiam
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
Nr ............
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY

Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transkrypt

Podobne dokumenty

Analiza DNA - praktyka - Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

Załącznik do pobrania. - Sekcja Rehabilitacji Kardiologicznej i

KOMÓRKOWY SZLAK SYGNALIZACYJNY ZALEŻNY OD

pobierz - Polskie Towarzystwo Hematologów i Transfuzjologów